ઇમ્યુનોમોડ્યુલેટરી મેટાબોલાઇટ્સ ટ્યુમર માઇક્રોએનવાયરમેન્ટ (TME) નું મુખ્ય લક્ષણ છે, પરંતુ થોડા અપવાદો સાથે, તેમની ઓળખ મોટાભાગે અજાણ રહે છે. અહીં, અમે હાઇ-ગ્રેડ સેરસ કાર્સિનોમા (HGSC) ધરાવતા દર્દીઓના ટ્યુમર અને જલોદરમાંથી ટ્યુમર અને T કોષોનું વિશ્લેષણ કર્યું છે જેથી આ વિવિધ TME કમ્પાર્ટમેન્ટના મેટાબોલોમને જાહેર કરી શકાય. જલોદર અને ટ્યુમર કોષોમાં વ્યાપક મેટાબોલિટ તફાવતો છે. જલોદરની તુલનામાં, ટ્યુમર-ઘૂસણખોરી કરતી T કોષો 1-મિથાઈલનિકોટીનામાઇડ (MNA) માં નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ થાય છે. T કોષોમાં MNA નું સ્તર ઊંચું હોવા છતાં, નિકોટીનામાઇડ N-મિથાઈલટ્રાન્સફેરેઝ (એક એન્ઝાઇમ જે S-એડેનોસિલમેથિઓનાઇનથી નિકોટીનામાઇડમાં મિથાઈલ જૂથોના ટ્રાન્સફરને ઉત્પ્રેરિત કરે છે) ની અભિવ્યક્તિ ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ્સ અને ટ્યુમર કોષો સુધી મર્યાદિત છે. કાર્યાત્મક રીતે, MNA ટ્યુમર-પ્રોત્સાહન સાયટોકાઇન ટ્યુમર નેક્રોસિસ ફેક્ટર આલ્ફા સ્ત્રાવ કરવા માટે T કોષોને પ્રેરિત કરે છે. તેથી, TME-વ્યુત્પન્ન MNA T કોષોના રોગપ્રતિકારક નિયમનમાં ફાળો આપે છે અને માનવ કેન્સરની સારવાર માટે સંભવિત ઇમ્યુનોથેરાપી લક્ષ્યનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.
ગાંઠમાંથી મેળવેલા ચયાપચય ગાંઠ-વિરોધી રોગપ્રતિકારક શક્તિ પર ઊંડી અવરોધક અસર કરી શકે છે, અને વધુને વધુ પુરાવા દર્શાવે છે કે તેઓ રોગના વિકાસ માટે મુખ્ય પ્રેરક બળ તરીકે પણ સેવા આપી શકે છે (1). વોરબર્ગ અસર ઉપરાંત, તાજેતરના કાર્યમાં ગાંઠ કોષોની ચયાપચયની સ્થિતિ અને ગાંઠ સૂક્ષ્મ પર્યાવરણ (TME) ની રોગપ્રતિકારક સ્થિતિ સાથેના તેના સંબંધને દર્શાવવાનું શરૂ થયું છે. માઉસ મોડેલ્સ અને માનવ ટી કોષો પરના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે ગ્લુટામાઇન ચયાપચય (2), ઓક્સિડેટીવ ચયાપચય (3) અને ગ્લુકોઝ ચયાપચય (4) વિવિધ રોગપ્રતિકારક કોષ પેટાજૂથો પર સ્વતંત્ર રીતે કાર્ય કરી શકે છે. આ માર્ગોમાં રહેલા કેટલાક ચયાપચય ટી કોષોના એન્ટિ-ટ્યુમર કાર્યને અટકાવે છે. તે સાબિત થયું છે કે કોએનઝાઇમ ટેટ્રાહાઇડ્રોબાયોપ્ટેરિન (BH4) ના અવરોધ T કોષોના પ્રસારને નુકસાન પહોંચાડી શકે છે, અને શરીરમાં BH4 નો વધારો CD4 અને CD8 દ્વારા મધ્યસ્થી કરાયેલ એન્ટિ-ટ્યુમર રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવને વધારી શકે છે. વધુમાં, BH4 ના વહીવટ દ્વારા કાયન્યુરેનાઇનની રોગપ્રતિકારક શક્તિને દબાવી શકાય છે (5). આઇસોસાઇટ્રેટ ડિહાઇડ્રોજેનેઝ (IDH) મ્યુટન્ટ ગ્લિઓબ્લાસ્ટોમામાં, એન્ન્ટિઓમેટાબોલિક (R)-2-હાઇડ્રોક્સીગ્લુટેરેટ (R-2-HG) નું સ્ત્રાવ ટી સેલ સક્રિયકરણ, પ્રસાર અને સાયટોલિસિસ પ્રવૃત્તિને અટકાવે છે (6). તાજેતરમાં, એવું દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે ગ્લાયકોલિસિસનું આડપેદાશ, મિથાઈલગ્લાયોક્સલ, માયલોઇડ મૂળના સપ્રેસર કોષો દ્વારા ઉત્પન્ન થાય છે, અને મિથાઈલગ્લાયોક્સલનું ટી સેલ ટ્રાન્સફર ઇફેક્ટર ટી સેલ કાર્યને અટકાવી શકે છે. સારવારમાં, મિથાઈલગ્લાયોક્સલનું તટસ્થકરણ માયલોઇડ-ડેરિવ્ડ સપ્રેસર કોષો (MDSC) ની પ્રવૃત્તિને દૂર કરી શકે છે અને માઉસ મોડેલ્સમાં ચેકપોઇન્ટ બ્લોકેડ થેરાપીને સિનર્જિસ્ટિકલી વધારી શકે છે (7). આ અભ્યાસો સામૂહિક રીતે ટી સેલ કાર્ય અને પ્રવૃત્તિને નિયંત્રિત કરવામાં TME-ડેરિવ્ડ મેટાબોલાઇટ્સની મુખ્ય ભૂમિકા પર ભાર મૂકે છે.
અંડાશયના કેન્સરમાં ટી સેલ ડિસફંક્શન વ્યાપકપણે નોંધાયું છે (8). આ અંશતઃ હાયપોક્સિયા અને અસામાન્ય ગાંઠ વેસ્ક્યુલેચર (9) માં રહેલી મેટાબોલિક લાક્ષણિકતાઓને કારણે છે, જેના પરિણામે ગ્લુકોઝ અને ટ્રિપ્ટોફનનું લેક્ટિક એસિડ અને કાયન્યુરેનાઇન જેવા ઉપ-ઉત્પાદનોમાં રૂપાંતર થાય છે. વધુ પડતું એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર લેક્ટેટ ઇન્ટરફેરોન-γ (IFN-γ) નું ઉત્પાદન ઘટાડે છે અને માયલોસપ્રેસિવ પેટાજૂથોના ભિન્નતાને આગળ ધપાવે છે (10, 11). ટ્રિપ્ટોફનનો વપરાશ સીધા ટી સેલ પ્રસારને અટકાવે છે અને ટી સેલ રીસેપ્ટર સિગ્નલિંગને અટકાવે છે (12-14). આ અવલોકનો છતાં, રોગપ્રતિકારક ચયાપચયની આસપાસ ઘણું કામ ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ મીડિયાનો ઉપયોગ કરીને ઇન વિટ્રો ટી સેલ કલ્ચરમાં હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું, અથવા વિવોમાં હોમોલોગસ માઉસ મોડેલ્સ સુધી મર્યાદિત હતું, જેમાંથી કોઈ પણ માનવ કેન્સર અને શારીરિક મેક્રો અને માઇક્રો પર્યાવરણની વિજાતીયતાને સંપૂર્ણપણે પ્રતિબિંબિત કરતું નથી.
અંડાશયના કેન્સરનું એક સામાન્ય લક્ષણ પેરીટોનિયલ ફેલાવો અને જલોદરનો દેખાવ છે. જલોદરમાં કોષ પ્રવાહીનું સંચય એ અદ્યતન રોગ અને નબળા પૂર્વસૂચન સાથે સંકળાયેલું છે (15). અહેવાલો અનુસાર, આ અનોખો કમ્પાર્ટમેન્ટ હાઇપોક્સિક છે, તેમાં વેસ્ક્યુલર એન્ડોથેલિયલ ગ્રોથ ફેક્ટર (VEGF) અને ઇન્ડોલીયામાઇન 2,3-ડાયોક્સિજેનેઝ (IDO) નું ઉચ્ચ સ્તર છે, અને તે T નિયમનકારી કોષો અને માયલોઇડ અવરોધક કોષો (15-18) દ્વારા ઘૂસણખોરી કરે છે. જલોદરનું મેટાબોલિક વાતાવરણ ગાંઠ કરતા અલગ હોઈ શકે છે, તેથી પેરીટોનિયલ અવકાશમાં T કોષોનું પુનઃપ્રોગ્રામિંગ અસ્પષ્ટ છે. વધુમાં, ગાંઠના વાતાવરણમાં હાજર જલોદર અને મેટાબોલાઇટ્સ વચ્ચેના મુખ્ય તફાવતો અને વિજાતીયતા રોગપ્રતિકારક કોષોના ઘૂસણખોરી અને ગાંઠો પર તેમના કાર્યને અવરોધી શકે છે, અને વધુ સંશોધનની જરૂર છે.
આ સમસ્યાઓના ઉકેલ માટે, અમે વિવિધ કોષ પ્રકારો (CD4 + અને CD8 + T કોષો સહિત) તેમજ ગાંઠોની અંદર અને વચ્ચે અભ્યાસ કરવા માટે સંવેદનશીલ કોષ વિભાજન અને પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફી ટેન્ડમ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (LC-MS/MS) પદ્ધતિ ડિઝાઇન કરી. તેના મેટાબોલાઇટ્સ દર્દીના સમાન જલોદર અને ગાંઠ વાતાવરણમાં કોષોને ફેલાવે છે. અમે આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ ઉચ્ચ-પરિમાણીય પ્રવાહ સાયટોમેટ્રી અને સિંગલ-સેલ RNA સિક્વન્સિંગ (scRNA-seq) સાથે જોડાણમાં કરીએ છીએ જેથી આ મુખ્ય વસ્તીની મેટાબોલિક સ્થિતિનું ઉચ્ચ-નિરાકરણ પોટ્રેટ પ્રદાન કરી શકાય. આ પદ્ધતિએ ગાંઠ T કોષોમાં 1-મિથાઈલનિકોટીનામાઇડ (MNA) ના સ્તરમાં નોંધપાત્ર વધારો જાહેર કર્યો, અને ઇન વિટ્રો પ્રયોગો દર્શાવે છે કે T કોષ કાર્ય પર MNA ની ઇમ્યુનોમોડ્યુલેટરી અસર અગાઉ અજાણ હતી. સામાન્ય રીતે, આ પદ્ધતિ ગાંઠો અને રોગપ્રતિકારક કોષો વચ્ચે પરસ્પર મેટાબોલિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ છતી કરે છે, અને રોગપ્રતિકારક નિયમન મેટાબોલાઇટ્સમાં અનન્ય આંતરદૃષ્ટિ પ્રદાન કરે છે, જે T કોષ-આધારિત અંડાશયના કેન્સર ઇમ્યુનોથેરાપી સારવારની તકોની સારવાર માટે ઉપયોગી થઈ શકે છે.
અમે ગ્લુકોઝ શોષણનું પ્રમાણ એકસાથે માપવા માટે ઉચ્ચ-પરિમાણીય પ્રવાહ સાયટોમેટ્રીનો ઉપયોગ કર્યો [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) અને મિટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિ [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) એ લાક્ષણિક માર્કર છે જે રોગપ્રતિકારક કોષો અને ગાંઠ કોષોની વસ્તીને અલગ પાડે છે (કોષ્ટક S2 અને આકૃતિ S1A). આ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે T કોષોની તુલનામાં, જલોદર અને ગાંઠ કોષોમાં ગ્લુકોઝ શોષણનું સ્તર વધુ હોય છે, પરંતુ માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિમાં ઓછા તફાવત હોય છે. ગાંઠ કોષોનું સરેરાશ ગ્લુકોઝ શોષણ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] T કોષો કરતા ત્રણથી ચાર ગણું છે, અને CD4 + T કોષોનું સરેરાશ ગ્લુકોઝ શોષણ CD8 + T કોષો કરતા 1.2 ગણું છે, જે દર્શાવે છે કે ગાંઠ ઘૂસણખોરી કરતી લિમ્ફોસાઇટ્સ (TIL) ની સમાન TME (આકૃતિ 1A) માં પણ વિવિધ મેટાબોલિક જરૂરિયાતો હોય છે. તેનાથી વિપરીત, ગાંઠ કોષોમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિ CD4 + T કોષો જેવી જ છે, અને બંને પ્રકારના કોષની માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિ CD8 + T કોષો કરતા વધારે છે (આકૃતિ 1B). સામાન્ય રીતે, આ પરિણામો મેટાબોલિક સ્તર દર્શાવે છે. ગાંઠ કોષોની મેટાબોલિક પ્રવૃત્તિ CD4 + T કોષો કરતા વધારે છે, અને CD4 + T કોષોની મેટાબોલિક પ્રવૃત્તિ CD8 + T કોષો કરતા વધારે છે. કોષ પ્રકારોમાં આ અસરો હોવા છતાં, ગાંઠોની તુલનામાં CD4 + અને CD8 + T કોષોની મેટાબોલિક સ્થિતિ અથવા જલોદરમાં તેમના સંબંધિત પ્રમાણમાં કોઈ સુસંગત તફાવત નથી (આકૃતિ 1C). તેનાથી વિપરીત, CD45-કોષ અપૂર્ણાંકમાં, ગાંઠમાં EpCAM+ કોષોનું પ્રમાણ જલોદરની તુલનામાં વધ્યું (આકૃતિ 1D). અમે EpCAM+ અને EpCAM- કોષ ઘટકો વચ્ચે સ્પષ્ટ મેટાબોલિક તફાવત પણ જોયો. EpCAM+ (ગાંઠ) કોષોમાં EpCAM- કોષો કરતાં ગ્લુકોઝ શોષણ અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિ વધુ હોય છે, જે TME (આકૃતિ 1, E અને F) માં ગાંઠ કોષોમાં ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ્સની મેટાબોલિક પ્રવૃત્તિ કરતા ઘણી વધારે છે.
(A અને B) ગ્લુકોઝ શોષણની મધ્ય ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતા (MFI) (2-NBDG) (A) અને CD4 + T કોષોની માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિ (MitoTracker ઘેરો લાલ) (B) પ્રતિનિધિ ગ્રાફ (ડાબે) અને ટેબ્યુલેટેડ ડેટા (જમણે), જલોદર અને ગાંઠમાંથી CD8 + T કોષો અને EpCAM + CD45-ટ્યુમર કોષો. (C) જલોદર અને ગાંઠમાં CD4 + અને CD8 + કોષો (CD3 + T કોષોનો) ગુણોત્તર. (D) જલોદર અને ગાંઠમાં EpCAM + ટ્યુમર કોષોનું પ્રમાણ (CD45−). (E અને F) EpCAM + CD45-ટ્યુમર અને EpCAM-CD45-મેટ્રિક્સ ગ્લુકોઝ શોષણ (2-NBDG) (E) અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિ (MitoTracker ઘેરો લાલ) (F) પ્રતિનિધિ ગ્રાફ (ડાબે) અને ટેબ્યુલેટેડ ડેટા (જમણે) જલોદર અને ગાંઠ કોષો. (G) ફ્લો સાયટોમેટ્રી દ્વારા CD25, CD137 અને PD1 અભિવ્યક્તિના પ્રતિનિધિ ગ્રાફ. (H અને I) CD25, CD137 અને PD1 અભિવ્યક્તિ CD4 + T કોષો (H) અને CD8 + T કોષો (I) પર. (J અને K) CCR7 અને CD45RO ની અભિવ્યક્તિ પર આધારિત નિષ્કપટ, કેન્દ્રીય મેમરી (Tcm), ઇફેક્ટર (Teff) અને ઇફેક્ટર મેમરી (Tem) ફેનોટાઇપ્સ. જલોદર અને ગાંઠોમાં CD4 + T કોષો (J) અને CD8 + T કોષો (K) ની પ્રતિનિધિ છબીઓ (ડાબે) અને ટેબ્યુલર ડેટા (જમણે). જોડીવાળા ટી-ટેસ્ટ (*P<0.05, **P<0.01 અને ***P<0.001) દ્વારા નક્કી કરાયેલ P મૂલ્યો. રેખા મેળ ખાતા દર્દીઓનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે (n = 6). FMO, ફ્લોરોસેન્સ માઇનસ વન; MFI, મધ્ય ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતા.
વધુ વિશ્લેષણમાં અત્યંત ઉકેલાયેલા T કોષ ફેનોટાઇપિક સ્થિતિ વચ્ચે અન્ય નોંધપાત્ર તફાવતો જાહેર થયા. ગાંઠોમાં સક્રિય (આકૃતિ 1, G થી I) અને ઇફેક્ટર મેમરી (આકૃતિ 1, J અને K) જલોદર (CD3 + T કોષોનું પ્રમાણ) કરતાં ઘણી વાર જોવા મળે છે. તેવી જ રીતે, સક્રિયકરણ માર્કર્સ (CD25 અને CD137) અને ડિપ્લેશન માર્કર્સ [પ્રોગ્રામ્ડ સેલ ડેથ પ્રોટીન 1 (PD1)] ની અભિવ્યક્તિ દ્વારા ફિનોટાઇપનું વિશ્લેષણ કરવાથી જાણવા મળ્યું કે આ વસ્તીની મેટાબોલિક લાક્ષણિકતાઓ અલગ હોવા છતાં (આકૃતિ S1, B થી E), પરંતુ નિષ્કપટ, ઇફેક્ટર અથવા મેમરી સબસેટ્સ (આકૃતિ S1, F થી I) વચ્ચે કોઈ નોંધપાત્ર મેટાબોલિક તફાવત સતત જોવા મળ્યા નથી. આ પરિણામોની પુષ્ટિ મશીન લર્નિંગ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને સેલ ફેનોટાઇપ્સ (21) ને આપમેળે સોંપવા માટે કરવામાં આવી હતી, જેણે દર્દીના જલોદર (આકૃતિ S2A) માં મોટી સંખ્યામાં અસ્થિ મજ્જા કોષો (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ની હાજરીને વધુ જાહેર કરી. ઓળખાયેલા તમામ કોષ પ્રકારોમાં, આ માયલોઇડ કોષ વસ્તીએ સૌથી વધુ ગ્લુકોઝ શોષણ અને મિટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિ દર્શાવી (આકૃતિ S2, B થી G). આ પરિણામો HGSC દર્દીઓમાં જલોદર અને ગાંઠોમાં જોવા મળતા બહુવિધ કોષ પ્રકારો વચ્ચેના મજબૂત મેટાબોલિક તફાવતોને પ્રકાશિત કરે છે.
TIL ની મેટાબોનોમિક લાક્ષણિકતાઓને સમજવામાં મુખ્ય પડકાર એ ગાંઠોમાંથી પૂરતી શુદ્ધતા, ગુણવત્તા અને જથ્થાના T કોષોના નમૂનાઓને અલગ કરવાની જરૂરિયાત છે. તાજેતરના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે ફ્લો સાયટોમેટ્રી પર આધારિત સૉર્ટિંગ અને મણકા સંવર્ધન પદ્ધતિઓ સેલ્યુલર મેટાબોલાઇટ પ્રોફાઇલ્સમાં ફેરફારો તરફ દોરી શકે છે (22-24). આ સમસ્યાને દૂર કરવા માટે, અમે LC-MS/MS દ્વારા વિશ્લેષણ પહેલાં સર્જિકલ રીતે રિસેક્ટેડ માનવ અંડાશયના કેન્સરમાંથી TIL ને અલગ કરવા અને અલગ કરવા માટે મણકા સંવર્ધન પદ્ધતિને ઑપ્ટિમાઇઝ કરી (સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ જુઓ; આકૃતિ 2A). મેટાબોલાઇટ ફેરફારો પર આ પ્રોટોકોલની એકંદર અસરનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે ઉપરોક્ત મણકા વિભાજન પગલા પછી સ્વસ્થ દાતાઓ દ્વારા સક્રિય કરાયેલ T કોષોના મેટાબોલાઇટ પ્રોફાઇલ્સની તુલના એવા કોષો સાથે કરી જે મણકા અલગ ન હતા પરંતુ બરફ પર રહ્યા હતા. આ ગુણવત્તા નિયંત્રણ વિશ્લેષણમાં જાણવા મળ્યું કે આ બે સ્થિતિઓ (r = 0.77) વચ્ચે ઉચ્ચ સહસંબંધ છે, અને 86 મેટાબોલાઇટ્સના જૂથની તકનીકી પુનરાવર્તિતતા ઉચ્ચ પુનરાવર્તિતતા ધરાવે છે (આકૃતિ 2B). તેથી, આ પદ્ધતિઓ કોષ પ્રકાર સંવર્ધનમાંથી પસાર થતા કોષોમાં સચોટ મેટાબોલિટ વિશ્લેષણ કરી શકે છે, આમ HGSC માં ચોક્કસ મેટાબોલિટ્સને ઓળખવા માટે પ્રથમ ઉચ્ચ-રીઝોલ્યુશન પ્લેટફોર્મ પૂરું પાડે છે, જેનાથી લોકોને કોષ વિશિષ્ટતા જાતીય ચયાપચય કાર્યક્રમની ઊંડી સમજ પ્રાપ્ત થાય છે.
(A) ચુંબકીય મણકાના સંવર્ધનનો યોજનાકીય આકૃતિ. LC-MS/MS દ્વારા વિશ્લેષણ પહેલાં, કોષો ચુંબકીય મણકાના સંવર્ધનના સતત ત્રણ રાઉન્ડમાંથી પસાર થશે અથવા બરફ પર રહેશે. (B) ચયાપચયની વિપુલતા પર સંવર્ધન પ્રકારની અસર. દરેક સંવર્ધન પ્રકાર ± SE માટે ત્રણ માપનો સરેરાશ. ગ્રે રેખા 1:1 સંબંધ દર્શાવે છે. અક્ષ લેબલમાં દર્શાવેલ પુનરાવર્તિત માપનો ઇન્ટ્રા-ક્લાસ સહસંબંધ (ICC). NAD, નિકોટીનામાઇડ એડેનાઇન ડાયન્યુક્લિયોટાઇડ. (C) દર્દીના મેટાબોલિટ વિશ્લેષણના કાર્યપ્રવાહનો યોજનાકીય આકૃતિ. દર્દીઓ પાસેથી જલોદર અથવા ગાંઠો એકત્રિત કરવામાં આવે છે અને ક્રાયોપ્રીઝર્વ કરવામાં આવે છે. દરેક નમૂનાનો એક નાનો ભાગ ફ્લો સાયટોમેટ્રી દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યો હતો, જ્યારે બાકીના નમૂનાઓ CD4+, CD8+ અને CD45- કોષો માટે સંવર્ધનના ત્રણ રાઉન્ડમાંથી પસાર થયા હતા. આ કોષ અપૂર્ણાંકોનું વિશ્લેષણ LC-MS/MS નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. (D) પ્રમાણિત મેટાબોલિટ વિપુલતાનો ગરમીનો નકશો. ડેંડ્રોગ્રામ નમૂનાઓ વચ્ચે યુક્લિડિયન અંતરના વોર્ડના ક્લસ્ટરિંગનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. (E) નમૂના મેટાબોલાઇટ નકશાનું મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ (PCA), દરેક નમૂનાની ત્રણ પ્રતિકૃતિઓ દર્શાવે છે, એક જ દર્દીના નમૂનાઓ એક રેખા દ્વારા જોડાયેલા છે. (F) દર્દી પર શરતી નમૂનાના મેટાબોલાઇટ પ્રોફાઇલનો PCA (એટલે ​​\u200b\u200bકે, આંશિક રીડન્ડન્સીનો ઉપયોગ કરીને); નમૂનાનો પ્રકાર બહિર્મુખ હલ દ્વારા મર્યાદિત છે. PC1, મુખ્ય ઘટક 1; PC2, મુખ્ય ઘટક 2.
આગળ, અમે છ HGSC દર્દીઓના પ્રાથમિક જલોદર અને ગાંઠોમાં CD4 +, CD8 + અને CD45-કોષ અપૂર્ણાંકોમાં 99 ચયાપચયનું વિશ્લેષણ કરવા માટે આ સંવર્ધન પદ્ધતિનો ઉપયોગ કર્યો (આકૃતિ 2C, આકૃતિ S3A અને કોષ્ટક S3 અને S4). જીવંત કોષોના મૂળ મોટા નમૂનાના 2% થી 70% રસની વસ્તીનો હિસ્સો છે, અને કોષોનું પ્રમાણ દર્દીઓ વચ્ચે ખૂબ બદલાય છે. માળખાને અલગ કર્યા પછી, રસનો સમૃદ્ધ અપૂર્ણાંક (CD4+, CD8+ અથવા CD45-) સરેરાશ નમૂનામાં તમામ જીવંત કોષોના 85% થી વધુ હિસ્સો ધરાવે છે. આ સંવર્ધન પદ્ધતિ આપણને માનવ ગાંઠ પેશી ચયાપચયમાંથી કોષ વસ્તીનું વિશ્લેષણ કરવાની મંજૂરી આપે છે, જે મોટા નમૂનાઓથી કરવું અશક્ય છે. આ પ્રોટોકોલનો ઉપયોગ કરીને, અમે નક્કી કર્યું કે l-kynurenine અને adenosine, આ બે સારી રીતે લાક્ષણિકતા ધરાવતા ઇમ્યુનોસપ્રેસિવ ચયાપચય, ગાંઠ T કોષો અથવા ગાંઠ કોષોમાં ઉન્નત હતા (આકૃતિ S3, B અને C). તેથી, આ પરિણામો દર્દીના પેશીઓમાં જૈવિક રીતે મહત્વપૂર્ણ ચયાપચય શોધવા માટે આપણી કોષ વિભાજન અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી ટેકનોલોજીની વફાદારી અને ક્ષમતા દર્શાવે છે.
અમારા વિશ્લેષણમાં દર્દીઓની અંદર અને વચ્ચે કોષોના પ્રકારોનું મજબૂત મેટાબોલિક વિભાજન પણ બહાર આવ્યું (આકૃતિ 2D અને આકૃતિ S4A). ખાસ કરીને, અન્ય દર્દીઓની તુલનામાં, દર્દી 70 એ વિવિધ મેટાબોલિક લાક્ષણિકતાઓ (આકૃતિ 2E અને આકૃતિ S4B) દર્શાવી, જે દર્શાવે છે કે દર્દીઓ વચ્ચે નોંધપાત્ર મેટાબોલિક વિજાતીયતા હોઈ શકે છે. એ નોંધવું યોગ્ય છે કે અન્ય દર્દીઓ (1.2 થી 2 લિટર; કોષ્ટક S1) ની તુલનામાં, દર્દી 70 (80 મિલી) માં એકત્રિત કરવામાં આવેલા જલોદરનું કુલ પ્રમાણ ઓછું હતું. મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ દરમિયાન આંતર-દર્દી વિજાતીયતાનું નિયંત્રણ (ઉદાહરણ તરીકે, આંશિક રીડન્ડન્સી વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને) કોષોના પ્રકારો વચ્ચે સુસંગત ફેરફારો દર્શાવે છે, અને કોષોના પ્રકારો અને/અથવા સૂક્ષ્મ પર્યાવરણ સ્પષ્ટ રીતે મેટાબોલિટ પ્રોફાઇલ (આકૃતિ 2F) અનુસાર એકત્રિત કરવામાં આવે છે. એકલ ચયાપચયના વિશ્લેષણમાં આ અસરો પર ભાર મૂકવામાં આવ્યો અને કોષોના પ્રકારો અને સૂક્ષ્મ પર્યાવરણ વચ્ચે નોંધપાત્ર તફાવતો જાહેર થયા. એ નોંધવું યોગ્ય છે કે જોવા મળતો સૌથી આત્યંતિક તફાવત MNA છે, જે સામાન્ય રીતે CD45- કોષોમાં અને ગાંઠમાં ઘૂસણખોરી કરતા CD4+ અને CD8+ કોષોમાં સમૃદ્ધ થાય છે (આકૃતિ 3A). CD4 + કોષો માટે, આ અસર સૌથી સ્પષ્ટ છે, અને CD8 + કોષોમાં MNA પણ પર્યાવરણ દ્વારા મજબૂત રીતે પ્રભાવિત હોય તેવું લાગે છે. જો કે, આ મહત્વપૂર્ણ નથી, કારણ કે છ દર્દીઓમાંથી ફક્ત ત્રણનું જ ગાંઠ CD8+ સ્કોર્સ માટે મૂલ્યાંકન કરી શકાય છે. MNA ઉપરાંત, જલોદર અને ગાંઠોમાં વિવિધ પ્રકારના કોષોમાં, TIL માં નબળી લાક્ષણિકતા ધરાવતા અન્ય ચયાપચય પણ અલગ રીતે સમૃદ્ધ હોય છે (આકૃતિઓ S3 અને S4). તેથી, આ ડેટા વધુ સંશોધન માટે ઇમ્યુનોમોડ્યુલેટરી ચયાપચયનો એક આશાસ્પદ સમૂહ દર્શાવે છે.
(A) જલોદર અને ગાંઠમાંથી CD4+, CD8+ અને CD45- કોષોમાં MNA નું સામાન્યકૃત પ્રમાણ. બોક્સ પ્લોટ મધ્ય (રેખા), ઇન્ટરક્વાર્ટાઇલ રેન્જ (ફ્રેમ હિન્જ) અને ડેટા રેન્જ દર્શાવે છે, જે ઇન્ટરક્વાર્ટાઇલ રેન્જ (ફ્રેમ વ્હિસ્કર) કરતા 1.5 ગણું વધારે છે. દર્દી સામગ્રી અને પદ્ધતિઓમાં વર્ણવ્યા મુજબ, P મૂલ્ય (*P<0.05 અને **P<0.01) નક્કી કરવા માટે દર્દીના લિમા મૂલ્યનો ઉપયોગ કરો. (B) MNA ચયાપચયનું યોજનાકીય આકૃતિ (60). ચયાપચય: S-એડેનોસિલ-1-મેથિઓનાઇન; SAH, S-એડેનોસિન-1-હોમોસિસ્ટીન; NA, નિકોટીનામાઇડ; MNA, 1-મિથાઈલનિકોટીનામાઇડ; 2-PY, 1-મિથાઈલ- 2-પાયરિડોન-5-કાર્બોક્સામાઇડ; 4-PY, 1-મિથાઈલ-4-પાયરિડોન-5-કાર્બોક્સામાઇડ; NR, નિકોટીનામાઇડ રાઇબોઝ; NMN, નિકોટીનામાઇડ મોનોન્યુક્લિયોટાઇડ. ઉત્સેચકો (લીલો): NNMT, નિકોટીનામાઇડ N-મિથાઈલટ્રાન્સફેરેઝ; SIRT, સિર્ટુઇન્સ; NAMPT, નિકોટીનામાઇડ ફોસ્ફોરિબોસિલ ટ્રાન્સફરેઝ; AOX1, એલ્ડીહાઇડ ઓક્સિડેઝ 1; NRK, નિકોટીનામાઇડ રિબોસાઇડ કાઇનેઝ; NMNAT, નિકોટીનામાઇડ મોનો ન્યુક્લિયોટાઇડ એડેનાઇલેટ ટ્રાન્સફરેઝ; Pnp1, પ્યુરિન ન્યુક્લિયોસાઇડ ફોસ્ફોરીલેઝ. (C) જલોદર (ગ્રે) અને ગાંઠ (લાલ; n = 3 દર્દીઓ) ના scRNA-seq નું t-SNE. (D) scRNA-seq નો ઉપયોગ કરીને ઓળખાયેલી વિવિધ કોષ વસ્તીમાં NNMT અભિવ્યક્તિ. (E) SK-OV-3, માનવ ગર્ભ કિડની (HEK) 293T, T કોષો અને MNA-સારવાર કરાયેલ T કોષોમાં NNMT અને AOX1 ની અભિવ્યક્તિ. ફોલ્ડ કરેલ અભિવ્યક્તિ SK-OV-3 ની તુલનામાં બતાવવામાં આવી છે. SEM સાથે અભિવ્યક્તિ પેટર્ન બતાવવામાં આવી છે (n = 6 સ્વસ્થ દાતાઓ). 35 થી વધુ Ct મૂલ્યો શોધી ન શકાય તેવા (UD) ગણવામાં આવે છે. (F) SK-OV-3, HEK293T, T કોષો અને 8mM MNA સાથે સારવાર કરાયેલ T કોષોમાં SLC22A1 અને SLC22A2 ની અભિવ્યક્તિ. SK-OV-3 ની તુલનામાં ફોલ્ડ કરેલ અભિવ્યક્તિ બતાવવામાં આવી છે. SEM સાથે અભિવ્યક્તિ પેટર્ન બતાવવામાં આવી છે (n = 6 સ્વસ્થ દાતાઓ). 35 થી વધુ Ct મૂલ્યો શોધી ન શકાય તેવા (UD) માનવામાં આવે છે. (G) MNA સાથે 72 કલાકના ઇન્ક્યુબેશન પછી સક્રિય સ્વસ્થ દાતા T કોષોમાં કોષ MNA સામગ્રી. SEM સાથે અભિવ્યક્તિ પેટર્ન બતાવવામાં આવી છે (n = 4 સ્વસ્થ દાતાઓ).
નિકોટીનામાઇડ N-મિથાઈલટ્રાન્સફેરેઝ (NNMT; આકૃતિ 3B) દ્વારા S-એડેનોસિલ-1-મેથિઓનાઈન (SAM) માંથી નિકોટીનામાઇડ (NA) માં મિથાઈલ જૂથને સ્થાનાંતરિત કરીને MNA ઉત્પન્ન થાય છે. NNMT વિવિધ માનવ કેન્સરમાં વધુ પડતું વ્યક્ત થાય છે અને તે પ્રસાર, આક્રમણ અને મેટાસ્ટેસિસ સાથે સંકળાયેલું છે (25-27). TME માં T કોષોમાં MNA ના સ્ત્રોતને વધુ સારી રીતે સમજવા માટે, અમે ત્રણ HGSC દર્દીઓના જલોદર અને ગાંઠોમાં કોષ પ્રકારોમાં NNMT ની અભિવ્યક્તિ દર્શાવવા માટે scRNA-seq નો ઉપયોગ કર્યો (કોષ્ટક S5). આશરે 6,500 કોષોના વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે જલોદર અને ગાંઠ વાતાવરણમાં, NNMT અભિવ્યક્તિ અનુમાનિત ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ અને ગાંઠ કોષ વસ્તી સુધી મર્યાદિત હતી (આકૃતિ 3, C અને D). એ નોંધવું યોગ્ય છે કે PTPRC (CD45 +) (આકૃતિ 3D અને આકૃતિ S5A) વ્યક્ત કરતી કોઈપણ વસ્તીમાં કોઈ સ્પષ્ટ NNMT અભિવ્યક્તિ નથી, જે સૂચવે છે કે મેટાબોલિટ સ્પેક્ટ્રમમાં શોધાયેલ MNA T કોષોમાં દાખલ કરવામાં આવ્યું છે. એલ્ડીહાઇડ ઓક્સિડેઝ 1 (AOX1) ની અભિવ્યક્તિ MNA ને 1-મિથાઈલ-2-પાયરિડોન-5-કાર્બોક્સામાઇડ (2-PYR) અથવા 1-મિથાઈલ-4-પાયરિડોન-5-કાર્બોક્સામાઇડ (4- PYR) માં રૂપાંતરિત કરે છે; આકૃતિ 3B) COL1A1 (આકૃતિ S5A) વ્યક્ત કરતા ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ્સની વસ્તી સુધી પણ મર્યાદિત છે, જે એકસાથે સૂચવે છે કે T કોષોમાં પરંપરાગત MNA ચયાપચયની ક્ષમતાનો અભાવ છે. HGSC દર્દીઓના જલોદરમાંથી બીજા સ્વતંત્ર કોષ ડેટા સેટનો ઉપયોગ કરીને આ MNA-સંબંધિત જનીનોની અભિવ્યક્તિ પેટર્ન ચકાસવામાં આવી હતી (આકૃતિ S5B; n = 6) (16). વધુમાં, MNA સાથે સારવાર કરાયેલા સ્વસ્થ દાતા T કોષોના જથ્થાત્મક પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન (qPCR) વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે નિયંત્રણ SK-OV-3 અંડાશયના ગાંઠ કોષોની તુલનામાં, NNMT અથવા AOX1 લગભગ વ્યક્ત કરવામાં આવ્યું ન હતું (આકૃતિ 3E). આ અણધાર્યા પરિણામો સૂચવે છે કે MNA ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ્સ અથવા ગાંઠોમાંથી TME માં નજીકના T કોષોમાં સ્ત્રાવ થઈ શકે છે.
જોકે ઉમેદવારોમાં દ્રાવ્ય વાહક 22 (SLC22) પરિવાર (SLC22A1, SLC22A2 અને SLC22A3) દ્વારા એન્કોડ કરાયેલા ઓર્ગેનિક કેશન ટ્રાન્સપોર્ટર્સ 1 થી 3 (OCT1, OCT2 અને OCT3) ના પરિવારનો સમાવેશ થાય છે, તેમ છતાં MNA ના સંભવિત ટ્રાન્સપોર્ટર્સ હજુ પણ અવ્યાખ્યાયિત છે (28). સ્વસ્થ દાતા T કોષોમાંથી mRNA ના QPCR એ SLC22A1 ના ઓછા અભિવ્યક્તિ સ્તરો દર્શાવ્યા હતા પરંતુ SLC22A2 ના શોધી ન શકાય તેવા સ્તરો દર્શાવ્યા હતા, જે પુષ્ટિ કરે છે કે તે અગાઉ સાહિત્યમાં નોંધાયું હતું (આકૃતિ 3F) (29). તેનાથી વિપરીત, SK-OV-3 અંડાશયના ગાંઠ કોષ રેખાએ બંને ટ્રાન્સપોર્ટર્સ (આકૃતિ 3F) ના ઉચ્ચ સ્તરો વ્યક્ત કર્યા હતા.
T કોષોમાં વિદેશી MNA શોષવાની ક્ષમતા હોવાની શક્યતા ચકાસવા માટે, MNA ની વિવિધ સાંદ્રતાની હાજરીમાં 72 કલાક માટે સ્વસ્થ દાતા T કોષોનું સંવર્ધન કરવામાં આવ્યું હતું. બાહ્ય MNA ની ગેરહાજરીમાં, MNA ની કોષીય સામગ્રી શોધી શકાતી નથી (આકૃતિ 3G). જો કે, બાહ્ય MNA સાથે સારવાર કરાયેલ સક્રિય T કોષોએ કોષોમાં MNA સામગ્રીમાં માત્રા-આધારિત વધારો દર્શાવ્યો, 6 mM MNA સુધી (આકૃતિ 3G). આ પરિણામ સૂચવે છે કે ટ્રાન્સપોર્ટર અભિવ્યક્તિનું નીચું સ્તર અને અંતઃકોશિક MNA ચયાપચય માટે જવાબદાર મુખ્ય ઉત્સેચકનો અભાવ હોવા છતાં, TIL હજુ પણ MNA લઈ શકે છે.
દર્દીઓના ટી કોષો અને ઇન વિટ્રો MNA શોષણ પ્રયોગોમાં મેટાબોલાઇટ્સનું સ્પેક્ટ્રમ કેન્સર-સંકળાયેલ ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ્સ (CAF) MNA સ્ત્રાવ કરે છે અને ગાંઠ કોષો TIL ના ફેનોટાઇપ અને કાર્યને નિયંત્રિત કરી શકે છે તેવી શક્યતા વધારે છે. T કોષો પર MNA ની અસર નક્કી કરવા માટે, MNA ની હાજરી અથવા ગેરહાજરીમાં સ્વસ્થ દાતા T કોષોને ઇન વિટ્રો સક્રિય કરવામાં આવ્યા હતા, અને તેમના પ્રસાર અને સાયટોકાઇન ઉત્પાદનનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું. સૌથી વધુ માત્રામાં MNA ઉમેર્યાના 7 દિવસ પછી, વસ્તી બમણી થવાની સંખ્યા મધ્યમ રીતે ઓછી થઈ હતી, જ્યારે તમામ ડોઝ પર ઉત્સાહ જાળવી રાખવામાં આવ્યો હતો (આકૃતિ 4A). વધુમાં, બાહ્ય MNA ની સારવારના પરિણામે ગાંઠ નેક્રોસિસ પરિબળ-α (TNFα; આકૃતિ 4B) વ્યક્ત કરતા CD4 + અને CD8 + T કોષોના પ્રમાણમાં વધારો થયો હતો. તેનાથી વિપરીત, CD4 + T કોષોમાં IFN-γ નું ઇન્ટ્રાસેલ્યુલર ઉત્પાદન નોંધપાત્ર રીતે ઘટ્યું હતું, પરંતુ CD8 + T કોષોમાં નહીં, અને ઇન્ટરલ્યુકિન 2 (IL-2; આકૃતિ 4, C અને D) માં કોઈ નોંધપાત્ર ફેરફાર થયો ન હતો. તેથી, આ MNA-સારવાર કરાયેલ T સેલ કલ્ચરમાંથી સુપરનેટન્ટ્સના એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે (ELISA) એ TNFα માં નોંધપાત્ર વધારો, IFN-γ માં ઘટાડો અને IL-2 માં કોઈ ફેરફાર દર્શાવ્યો નથી (આકૃતિ 4, E થી G). . IFN-γ નો ઘટાડો સૂચવે છે કે MNA T કોષોની એન્ટિ-ટ્યુમર પ્રવૃત્તિને અટકાવવામાં ભૂમિકા ભજવી શકે છે. T સેલ-મધ્યસ્થી સાયટોટોક્સિસિટી પર MNA ની અસરનું અનુકરણ કરવા માટે, લીલા ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન (GFP) -CAR-T) કોષો દ્વારા નિયંત્રિત ફોલેટ રીસેપ્ટર α અને CAR-T (GFP) ને લક્ષ્ય બનાવતા કાઇમરિક એન્ટિજેન રીસેપ્ટર T (FRα-CAR-T) કોષો સ્વસ્થ દાતા પેરિફેરલ બ્લડ મોનોન્યુક્લિયર કોષો (PBMC) દ્વારા ઉત્પન્ન થાય છે. CAR-T કોષોને MNA ની હાજરીમાં 24 કલાક માટે સંવર્ધન કરવામાં આવ્યા હતા, અને પછી 10:1 ના ઇફેક્ટરથી લક્ષ્ય ગુણોત્તર પર ફોલેટ રીસેપ્ટર α વ્યક્ત કરતા માનવ SK-OV-3 અંડાશયના ગાંઠ કોષો સાથે સહ-સંવર્ધન કરવામાં આવ્યું હતું. MNA સારવારના પરિણામે FRα-CAR-T કોષોની હત્યા પ્રવૃત્તિમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો, જે એડેનોસિનથી સારવાર કરાયેલા FRα-CAR-T કોષો જેવો જ હતો (આકૃતિ 4H).
(A) દિવસ 7 પર કલ્ચરમાંથી સીધા કુલ સક્ષમ કોષ ગણતરી અને વસ્તી બમણી (PD). બાર ગ્રાફ છ સ્વસ્થ દાતાઓના સરેરાશ + SEM દર્શાવે છે. ઓછામાં ઓછા n = 3 સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાંથી ડેટા રજૂ કરે છે. (B થી D) CD3/CD28 અને IL-2 નો ઉપયોગ 7 દિવસ માટે તેમના સંબંધિત MNA સાંદ્રતા પર T કોષોને સક્રિય કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. વિશ્લેષણ પહેલાં, કોષોને 4 કલાક માટે GolgiStop સાથે PMA/ionomycin સાથે ઉત્તેજિત કરવામાં આવ્યા હતા. T કોષોમાં TNFα (B) અભિવ્યક્તિ. જીવંત કોષોમાં TNFα અભિવ્યક્તિની ઉદાહરણ છબી (ડાબે) અને ટેબ્યુલર ડેટા (જમણે). T કોષોમાં IFN-γ (C) અને IL-2 (D) અભિવ્યક્તિ. સાયટોકાઇન્સની અભિવ્યક્તિ ફ્લો સાયટોમેટ્રી દ્વારા માપવામાં આવી હતી. બાર ગ્રાફ સરેરાશ (n = 6 સ્વસ્થ દાતાઓ) + SEM દર્શાવે છે. P મૂલ્ય નક્કી કરવા માટે ભિન્નતા અને પુનરાવર્તિત માપ (*P<0.05 અને **P<0.01) ના એક-માર્ગી વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરો. ઓછામાં ઓછા n = 3 સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાંથી ડેટા રજૂ કરે છે. (E થી G) CD3/CD28 અને IL-2 નો ઉપયોગ 7 દિવસ સુધી તેમના સંબંધિત MNA સાંદ્રતા પર T કોષોને સક્રિય કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. PMA/ionomycin ઉત્તેજનાના 4 કલાક પહેલા અને પછી માધ્યમ એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. TNFα (E), IFN-γ (F) અને IL-2 (G) ની સાંદ્રતા ELISA દ્વારા માપવામાં આવી હતી. બાર ગ્રાફ સરેરાશ (n = 5 સ્વસ્થ દાતાઓ) + SEM દર્શાવે છે. P મૂલ્ય ભિન્નતા અને પુનરાવર્તિત માપનના એક-માર્ગી વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવે છે (*P<0.05). ડોટેડ લાઇન શોધની શોધ મર્યાદા સૂચવે છે. (H) સેલ લિસિસ એસે. FRα-CAR-T અથવા GFP-CAR-T કોષોને 24 કલાક માટે એડેનોસિન (250μM) અથવા MNA (10 mM) સાથે ગોઠવવામાં આવ્યા હતા, અથવા સારવાર વિના છોડી દેવામાં આવ્યા હતા (Ctrl). SK-OV-3 કોષોની ટકાવારી હત્યા માપવામાં આવી હતી. P મૂલ્ય વેલ્ચ ટી પરીક્ષણ (*P<0.5 અને **P<0.01) દ્વારા નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું.
MNA-આધારિત TNFα અભિવ્યક્તિ નિયમનની યાંત્રિક સમજ મેળવવા માટે, MNA-સારવાર કરાયેલા T કોષોના TNFα mRNA માં થયેલા ફેરફારોનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું (આકૃતિ 5A). MNA સાથે સારવાર કરાયેલા સ્વસ્થ દાતા T કોષોએ TNFα ટ્રાન્સક્રિપ્શન સ્તરમાં બે ગણો વધારો દર્શાવ્યો, જે દર્શાવે છે કે MNA TNFα ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ નિયમન પર આધારિત છે. આ શક્ય નિયમનકારી પદ્ધતિની તપાસ કરવા માટે, TNFα ને નિયંત્રિત કરતા બે જાણીતા ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળો, એટલે કે સક્રિય T સેલ ન્યુક્લિયર ફેક્ટર (NFAT) અને ચોક્કસ પ્રોટીન 1 (Sp1),નું મૂલ્યાંકન પ્રોક્સિમલ TNFα પ્રમોટર (30) સાથે MNA બંધનના પ્રતિભાવમાં કરવામાં આવ્યું. TNFα પ્રમોટરમાં 6 ઓળખાયેલ NFAT બંધનકર્તા સાઇટ્સ અને 2 Sp1 બંધનકર્તા સાઇટ્સ છે, જે એક સાઇટ પર ઓવરલેપ થાય છે [-55 બેઝ જોડીઓ (bp) 5'cap થી] (30). ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રીસિપિટેશન (ChIP) દર્શાવે છે કે જ્યારે MNA સાથે સારવાર કરવામાં આવે છે, ત્યારે TNFα પ્રમોટર સાથે Sp1 નું બંધન ત્રણ ગણું વધી ગયું. NFAT નો સમાવેશ પણ વધ્યો અને મહત્વની નજીક પહોંચ્યો (આકૃતિ 5B). આ ડેટા દર્શાવે છે કે MNA Sp1 ટ્રાન્સક્રિપ્શન દ્વારા TNFα ની અભિવ્યક્તિનું નિયમન કરે છે, અને થોડા અંશે NFAT ની અભિવ્યક્તિનું.
(A) MNA વગર સંવર્ધિત T કોષોની તુલનામાં, MNA સાથે સારવાર કરાયેલ T કોષોમાં TNFα અભિવ્યક્તિનો ફોલ્ડ ફેરફાર. SEM સાથે અભિવ્યક્તિ પેટર્ન બતાવવામાં આવી છે (n = 5 સ્વસ્થ દાતાઓ). ઓછામાં ઓછા n = 3 સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાંથી ડેટા રજૂ કરે છે. (B) NFAT અને Sp1 પછી 8 mM MNA સાથે અથવા વગર સારવાર કરાયેલ T કોષોના TNFα પ્રમોટરને (Ctrl) અને PMA/ionomycin ઉત્તેજના સાથે 4 કલાક માટે જોડવામાં આવ્યા હતા. ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન G (IgG) અને H3 નો ઉપયોગ ઇમ્યુનોપ્રીસિપિટેશન માટે અનુક્રમે નકારાત્મક અને હકારાત્મક નિયંત્રણો તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. ChIP ના જથ્થાત્મકકરણે દર્શાવ્યું હતું કે MNA-સારવાર કરાયેલ કોષોમાં TNFα પ્રમોટર સાથે Sp1 અને NFAT નું બંધન નિયંત્રણની તુલનામાં ઘણી વખત વધ્યું છે. ઓછામાં ઓછા n = 3 સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાંથી ડેટા રજૂ કરે છે. બહુવિધ t-પરીક્ષણો દ્વારા નક્કી કરાયેલ P મૂલ્ય (*** P <0.01). (C) HGSC ના જલોદરની તુલનામાં, T કોષો (નોન-સાયટોટોક્સિક) એ ગાંઠમાં TNF ની વધેલી અભિવ્યક્તિ દર્શાવી. રંગો વિવિધ દર્દીઓનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. પ્રદર્શિત કોષોને રેન્ડમલી 300 સુધી નમૂના લેવામાં આવ્યા છે અને ઓવરડ્રોઇંગને મર્યાદિત કરવા માટે ધ્રુજાવવામાં આવ્યા છે (** Padj = 0.0076). (D) અંડાશયના કેન્સર માટે MNA નું પ્રસ્તાવિત મોડેલ. MNA TME માં ગાંઠ કોષો અને ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ્સમાં ઉત્પન્ન થાય છે અને T કોષો દ્વારા શોષાય છે. MNA Sp1 નું TNFα પ્રમોટર સાથે બંધન વધારે છે, જેના કારણે TNFα ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને TNFα સાયટોકાઇન ઉત્પાદનમાં વધારો થાય છે. MNA IFN-γ માં પણ ઘટાડો કરે છે. T કોષ કાર્યના અવરોધથી હત્યા કરવાની ક્ષમતામાં ઘટાડો થાય છે અને ગાંઠની વૃદ્ધિ ઝડપી બને છે.
અહેવાલો અનુસાર, TNFα આગળ અને પાછળ-આધારિત એન્ટિ-ટ્યુમર અને એન્ટિ-ટ્યુમર અસરો ધરાવે છે, પરંતુ તે અંડાશયના કેન્સરના વિકાસ અને મેટાસ્ટેસિસને પ્રોત્સાહન આપવામાં જાણીતી ભૂમિકા ભજવે છે (31-33). અહેવાલો અનુસાર, અંડાશયના કેન્સરવાળા દર્દીઓમાં જલોદર અને ગાંઠના પેશીઓમાં TNFα ની સાંદ્રતા સૌમ્ય પેશીઓ કરતા વધારે છે (34-36). મિકેનિઝમની દ્રષ્ટિએ, TNFα શ્વેત રક્ત કોશિકાઓના સક્રિયકરણ, કાર્ય અને પ્રસારને નિયંત્રિત કરી શકે છે, અને કેન્સર કોષોના ફેનોટાઇપને બદલી શકે છે (37, 38). આ તારણો સાથે સુસંગત, વિભેદક જનીન અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે જલોદરની તુલનામાં ગાંઠના પેશીઓમાં T કોષોમાં TNF નોંધપાત્ર રીતે ઉપર-નિયમન કરવામાં આવ્યું હતું (આકૃતિ 5C). TNF અભિવ્યક્તિમાં વધારો ફક્ત બિન-સાયટોટોક્સિક ફેનોટાઇપ (આકૃતિ S5A) ધરાવતી T કોષોની વસ્તીમાં જ સ્પષ્ટ હતો. સારાંશમાં, આ ડેટા એ દૃષ્ટિકોણને સમર્થન આપે છે કે MNA HGSC માં ડ્યુઅલ ઇમ્યુનોસપ્રેસિવ અને ગાંઠને પ્રોત્સાહન આપતી અસરો ધરાવે છે.
ફ્લો સાયટોમેટ્રી પર આધારિત ફ્લોરોસન્ટ લેબલિંગ TIL ચયાપચયનો અભ્યાસ કરવા માટેની મુખ્ય પદ્ધતિ બની ગઈ છે. આ અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે પેરિફેરલ બ્લડ લિમ્ફોસાઇટ્સ અથવા ગૌણ લિમ્ફોઇડ અંગોમાંથી T કોષોની તુલનામાં, મુરિન અને માનવ TIL માં ગ્લુકોઝ શોષણ કરવાની વધુ વૃત્તિ છે (4, 39) અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ કાર્યમાં ધીમે ધીમે ઘટાડો (19, 40). જોકે આપણે આ અભ્યાસમાં સમાન પરિણામો જોયા છે, મુખ્ય વિકાસ એ છે કે ગાંઠ કોષોના ચયાપચય અને સમાન રિસેક્ટેડ ગાંઠ પેશીઓમાંથી TIL ની તુલના કરવી. આ અગાઉના કેટલાક અહેવાલો સાથે સુસંગત, જલોદર અને ગાંઠોમાંથી ગાંઠ (CD45-EpCAM +) કોષોમાં CD8 + અને CD4 + T કોષો કરતાં વધુ ગ્લુકોઝ શોષણ હોય છે, જે સમર્થન આપે છે કે ગાંઠ કોષોના ઉચ્ચ ગ્લુકોઝ શોષણની તુલના T કોષો સાથે કરી શકાય છે. T સેલ સ્પર્ધાનો ખ્યાલ. TME. જો કે, ગાંઠ કોષોની માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિ CD8 + T કોષો કરતાં વધુ છે, પરંતુ માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિ CD4 + T કોષો જેવી જ છે. આ પરિણામો ઉભરતા વિષયને મજબૂત બનાવે છે કે ગાંઠ કોષો માટે ઓક્સિડેટીવ ચયાપચય મહત્વપૂર્ણ છે (41, 42). તેઓ એવું પણ સૂચવે છે કે CD8 + T કોષો CD4 + T કોષો કરતાં ઓક્સિડેટીવ ડિસફંક્શન માટે વધુ સંવેદનશીલ હોઈ શકે છે, અથવા CD4 + T કોષો માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિ જાળવવા માટે ગ્લુકોઝ સિવાયના કાર્બન સ્ત્રોતોનો ઉપયોગ કરી શકે છે (43, 44). એ નોંધવું જોઈએ કે અમે જલોદરમાં CD4 + T ઇફેક્ટર્સ, T ઇફેક્ટર મેમરી અને T સેન્ટ્રલ મેમરી કોષો વચ્ચે ગ્લુકોઝ શોષણ અથવા માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિમાં કોઈ તફાવત જોયો નથી. તેવી જ રીતે, ગાંઠોમાં CD8 + T કોષોની ભિન્નતા સ્થિતિનો ગ્લુકોઝ શોષણમાં ફેરફાર સાથે કોઈ સંબંધ નથી, જે ઇન વિટ્રોમાં કલ્ચર્ડ T કોષો અને માનવ TIL ઇન વિવો વચ્ચે નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે (22). આ અવલોકનોની પુષ્ટિ નિષ્પક્ષ ઓટોમેટિક સેલ વસ્તી ફાળવણીના ઉપયોગ દ્વારા પણ કરવામાં આવી હતી, જેણે આગળ જણાવ્યું હતું કે CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + કોષો ગાંઠ કોષો કરતાં વધુ ગ્લુકોઝ શોષણ અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિ ધરાવતા હોય છે પરંતુ મેટાબોલિક સક્રિય કોષ વસ્તી ધરાવે છે. આ વસ્તી scRNA-seq વિશ્લેષણમાં ઓળખાતા માઇલોઇડ સપ્રેસર કોષો અથવા પ્લાઝમાસાયટોઇડ ડેંડ્રિટિક કોષોની પુટેટિવ ​​પેટા વસ્તીનું પ્રતિનિધિત્વ કરી શકે છે. જોકે આ બંને માનવ અંડાશયના ગાંઠોમાં નોંધાયા છે [45], તેમને હજુ પણ આ માયલોઇડ પેટા વસ્તીનું વર્ણન કરવા માટે વધુ કાર્યની જરૂર છે.
જોકે ફ્લો સાયટોમેટ્રી-આધારિત પદ્ધતિઓ કોષ પ્રકારો વચ્ચે ગ્લુકોઝ અને ઓક્સિડેટીવ ચયાપચયમાં સામાન્ય તફાવતોને સ્પષ્ટ કરી શકે છે, TME માં માઇટોકોન્ડ્રીયલ ચયાપચય માટે ગ્લુકોઝ અથવા અન્ય કાર્બન સ્ત્રોતો દ્વારા ઉત્પાદિત ચોક્કસ ચયાપચય હજુ સુધી નક્કી કરવામાં આવ્યા નથી. આપેલ TIL સબસેટને ચયાપચયની હાજરી અથવા ગેરહાજરી સોંપવા માટે એક્સાઇઝ્ડ પેશીમાંથી કોષ વસ્તીનું શુદ્ધિકરણ જરૂરી છે. તેથી, માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી સાથે જોડાયેલી અમારી કોષ સંવર્ધન પદ્ધતિ મેટાબોલિટ્સમાં આંતરદૃષ્ટિ પ્રદાન કરી શકે છે જે મેચિંગ દર્દી નમૂનાઓમાં T કોષો અને ગાંઠ કોષ વસ્તીમાં અલગ રીતે સમૃદ્ધ થાય છે. જોકે આ પદ્ધતિમાં ફ્લોરોસેન્સ-સક્રિયકૃત કોષ સૉર્ટિંગ કરતાં ફાયદા છે, તેમ છતાં ચોક્કસ મેટાબોલિટ લાઇબ્રેરીઓ સહજ સ્થિરતા અને/અથવા ઝડપી ટર્નઓવર રેટ (22) ને કારણે પ્રભાવિત થઈ શકે છે. તેમ છતાં, અમારી પદ્ધતિ બે માન્ય ઇમ્યુનોસપ્રેસિવ ચયાપચય, એડેનોસિન અને કાયન્યુરેનાઇનને ઓળખવામાં સક્ષમ હતી, કારણ કે તે નમૂના પ્રકારો વચ્ચે મોટા પ્રમાણમાં બદલાય છે.
ગાંઠો અને TIL સબટાઇપ્સનું અમારું મેટાબોનોમિક વિશ્લેષણ અંડાશયના TME માં ચયાપચયની ભૂમિકા વિશે વધુ સમજ આપે છે. પ્રથમ, ફ્લો સાયટોમેટ્રીનો ઉપયોગ કરીને, અમે નક્કી કર્યું કે ગાંઠો અને CD4 + T કોષો વચ્ચે માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિમાં કોઈ તફાવત નથી. જો કે, LC-MS/MS વિશ્લેષણમાં આ વસ્તીમાં ચયાપચયની વિપુલતામાં નોંધપાત્ર ફેરફારો જોવા મળ્યા, જે દર્શાવે છે કે TIL ચયાપચય અને તેની એકંદર ચયાપચય પ્રવૃત્તિ વિશેના નિષ્કર્ષોને કાળજીપૂર્વક અર્થઘટનની જરૂર છે. બીજું, MNA એ ચયાપચય છે જે CD45-કોષો અને જલોદરમાં T કોષો વચ્ચે સૌથી મોટો તફાવત ધરાવે છે, ગાંઠો નહીં. તેથી, કમ્પાર્ટમેન્ટલાઇઝેશન અને ગાંઠ સ્થાન TIL ચયાપચય પર અલગ અલગ અસરો કરી શકે છે, જે આપેલ સૂક્ષ્મ પર્યાવરણમાં સંભવિત વિજાતીયતાને પ્રકાશિત કરે છે. ત્રીજું, MNA-ઉત્પાદક એન્ઝાઇમ NNMT ની અભિવ્યક્તિ મુખ્યત્વે CAF સુધી મર્યાદિત છે, જે ઓછી હદ સુધી ગાંઠ કોષો છે, પરંતુ ગાંઠ-ઉત્પાદિત T કોષોમાં શોધી શકાય તેવા MNA સ્તરો જોવા મળે છે. અંડાશયના CAF માં NNMT ની અતિશય અભિવ્યક્તિ જાણીતી કેન્સર-પ્રોત્સાહક અસર ધરાવે છે, આંશિક રીતે CAF ચયાપચય, ગાંઠ આક્રમણ અને મેટાસ્ટેસિસને પ્રોત્સાહન આપવાને કારણે (27). TIL નું એકંદર સ્તર મધ્યમ હોવા છતાં, CAF માં NNMT ની અભિવ્યક્તિ કેન્સર જીનોમ એટલાસ (TCGA) મેસેનકાઇમલ સબટાઇપ સાથે ગાઢ રીતે સંબંધિત છે, જે નબળા પૂર્વસૂચન (27, 46, 47) સાથે સંકળાયેલ છે. છેલ્લે, MNA ડિગ્રેડેશન માટે જવાબદાર એન્ઝાઇમ AOX1 ની અભિવ્યક્તિ પણ CAF વસ્તી સુધી મર્યાદિત છે, જે સૂચવે છે કે T કોષોમાં MNA ને ચયાપચય કરવાની ક્ષમતાનો અભાવ છે. આ પરિણામો આ વિચારને સમર્થન આપે છે કે આ શોધને ચકાસવા માટે વધુ કાર્યની જરૂર હોવા છતાં, T કોષોમાં MNA નું ઉચ્ચ સ્તર રોગપ્રતિકારક શક્તિને દબાવનાર CAF સૂક્ષ્મ પર્યાવરણની હાજરી સૂચવી શકે છે.
MNA ટ્રાન્સપોર્ટર્સના નીચા અભિવ્યક્તિ સ્તર અને MNA ચયાપચયમાં સામેલ મુખ્ય પ્રોટીનના અદ્રશ્ય સ્તરને ધ્યાનમાં રાખીને, T કોષોમાં MNA ની હાજરી અણધારી છે. NNMT કે AOX1 ને scRNA-seq વિશ્લેષણ અને બે સ્વતંત્ર સમૂહોના લક્ષિત qPCR દ્વારા શોધી શકાયું નથી. આ પરિણામો સૂચવે છે કે MNA T કોષો દ્વારા સંશ્લેષિત થતું નથી, પરંતુ આસપાસના TME માંથી શોષાય છે. ઇન વિટ્રો પ્રયોગો દર્શાવે છે કે T કોષો બાહ્ય MNA એકઠા કરવાનું વલણ ધરાવે છે.
અમારા ઇન વિટ્રો અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે બાહ્ય MNA T કોષોમાં TNFα ની અભિવ્યક્તિને પ્રેરિત કરે છે અને TNFα પ્રમોટર સાથે Sp1 ના બંધનને વધારે છે. જોકે TNFα માં ગાંઠ વિરોધી અને ગાંઠ વિરોધી બંને કાર્યો છે, અંડાશયના કેન્સરમાં, TNFα અંડાશયના કેન્સરના વિકાસને પ્રોત્સાહન આપી શકે છે (31-33). અંડાશયના ગાંઠ કોષ સંસ્કૃતિમાં TNFα નું તટસ્થીકરણ અથવા માઉસ મોડેલોમાં TNFα સિગ્નલને દૂર કરવાથી TNFα-મધ્યસ્થી બળતરા સાયટોકાઇન ઉત્પાદનમાં સુધારો થઈ શકે છે અને ગાંઠ વૃદ્ધિને અટકાવી શકે છે (32, 35). તેથી, આ કિસ્સામાં, TME-ઉત્પન્ન MNA ઓટોક્રાઇન લૂપ દ્વારા TNFα-આધારિત પદ્ધતિ દ્વારા બળતરા વિરોધી મેટાબોલાઇટ તરીકે કાર્ય કરી શકે છે, જેનાથી અંડાશયના કેન્સરની ઘટના અને ફેલાવાને પ્રોત્સાહન મળે છે (31). આ શક્યતાના આધારે, TNFα નાકાબંધીનો અભ્યાસ અંડાશયના કેન્સર માટે સંભવિત ઉપચારાત્મક એજન્ટ તરીકે કરવામાં આવી રહ્યો છે (37, 48, 49). વધુમાં, MNA CAR-T કોષોની સાયટોટોક્સિસિટીને અંડાશયના ગાંઠ કોષો પર અસર કરે છે, જે MNA-મધ્યસ્થી રોગપ્રતિકારક દમન માટે વધુ પુરાવા પૂરા પાડે છે. સામૂહિક રીતે, આ પરિણામો એક મોડેલ સૂચવે છે જેમાં ગાંઠો અને CAF કોષો બાહ્યકોષીય TME માં MNA સ્ત્રાવ કરે છે. (i) TNF-પ્રેરિત અંડાશયના કેન્સર વૃદ્ધિ ઉત્તેજના અને (ii) MNA-પ્રેરિત T સેલ સાયટોટોક્સિક પ્રવૃત્તિ અવરોધ દ્વારા, આમાં બેવડી ગાંઠ અસર હોઈ શકે છે (આકૃતિ 5D).
નિષ્કર્ષમાં, ઝડપી કોષ સંવર્ધન, સિંગલ-સેલ સિક્વન્સિંગ અને મેટાબોલિક પ્રોફાઇલિંગના સંયોજનનો ઉપયોગ કરીને, આ અભ્યાસમાં HGSC દર્દીઓમાં ગાંઠો અને જલોદર કોષો વચ્ચેના વિશાળ ઇમ્યુનોમેટાબોલોમિક તફાવતો જાહેર થયા. આ વ્યાપક વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે T કોષો વચ્ચે ગ્લુકોઝ શોષણ અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિમાં તફાવત છે, અને MNA ને બિન-કોષ સ્વાયત્ત રોગપ્રતિકારક નિયમનકારી મેટાબોલાઇટ તરીકે ઓળખવામાં આવ્યું છે. આ ડેટા માનવ કેન્સરમાં TME કેવી રીતે T સેલ ચયાપચયને અસર કરે છે તેના પર અસર કરે છે. જોકે T કોષો અને કેન્સર કોષો વચ્ચે પોષક તત્વો માટે સીધી સ્પર્ધાની જાણ કરવામાં આવી છે, મેટાબોલાઇટ્સ ગાંઠની પ્રગતિને પ્રોત્સાહન આપવા અને સંભવતઃ અંતર્જાત રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવોને દબાવવા માટે પરોક્ષ નિયમનકારો તરીકે પણ કાર્ય કરી શકે છે. આ નિયમનકારી ચયાપચયની કાર્યાત્મક ભૂમિકાનું વધુ વર્ણન ગાંઠ વિરોધી રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવને વધારવા માટે વૈકલ્પિક વ્યૂહરચનાઓ ખોલી શકે છે.
કેનેડિયન ટીશ્યુ રિપોઝીટરી નેટવર્ક દ્વારા પ્રમાણિત BC કેન્સર ટ્યુમર ટિશ્યુ રિપોઝીટરી દ્વારા દર્દીના નમૂનાઓ અને ક્લિનિકલ ડેટા મેળવવામાં આવ્યા હતા. BC કેન્સર રિસર્ચ એથિક્સ કમિટી અને યુનિવર્સિટી ઓફ બ્રિટિશ કોલંબિયા (H07-00463) દ્વારા મંજૂર કરાયેલા પ્રોટોકોલ અનુસાર, બધા દર્દીઓના નમૂનાઓ અને ક્લિનિકલ ડેટાએ લેખિત સંમતિ મેળવી હતી અથવા ઔપચારિક રીતે તેમની સંમતિ છોડી દીધી હતી. નમૂનાઓ પ્રમાણિત બાયોબેંક (BRC-00290) માં સંગ્રહિત કરવામાં આવે છે. દર્દીની વિગતવાર લાક્ષણિકતાઓ કોષ્ટકો S1 અને S5 માં બતાવવામાં આવી છે. ક્રાયોપ્રિઝર્વેશન માટે, દર્દીના ટ્યુમર નમૂનાને યાંત્રિક રીતે વિઘટિત કરવા માટે સ્કેલ્પેલનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે અને પછી તેને 100-માઇક્રોન ફિલ્ટર દ્વારા દબાણ કરીને સિંગલ સેલ સસ્પેન્શન મેળવવામાં આવે છે. દર્દીના જલોદરને 4°C પર 10 મિનિટ માટે 1500 rpm પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું જેથી કોષોને પેલેટ કરી શકાય અને સુપરનેટન્ટ દૂર કરી શકાય. ગાંઠ અને જલોદરમાંથી મેળવેલા કોષોને 50% ગરમી-નિષ્ક્રિય માનવ AB સીરમ (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ), 40% RPMI-1640 (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) અને 10% ડાયમિથાઇલ સલ્ફોક્સાઇડમાં ક્રાયોપ્રિઝર્વ કરવામાં આવ્યા હતા. આ સાચવેલ સિંગલ સેલ સસ્પેન્શનને પીગળીને નીચે વર્ણવેલ મેટાબોલોમિક્સ અને મેટાબોલાઇટ નિર્ધારણ માટે ઉપયોગમાં લેવામાં આવ્યા હતા.
સંપૂર્ણ માધ્યમમાં 0.22 μm ફિલ્ટર કરેલ 50:50 પૂરક RPMI 1640 હોય છે: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-ગ્લુટામાઇન (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) 10% ગરમી-નિષ્ક્રિય માનવ AB સીરમ (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ), 12.5 mM હેપ્સ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક), 2 mM l-ગ્લુટામાઇન (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) ફિશર સાયન્ટિફિક), 1 x પેનિસિલિન સ્ટ્રેપ્ટોમાસીન (પેનસ્ટ્રેપ) સોલ્યુશન (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) અને 50 μMB-મર્કેપ્ટોઇથેનોલ સાથે પૂરક. AimV (ઇનવિટ્રોજન) 20 mM હેપ્સ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) અને 2 mM l-ગ્લુટામાઇન (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) સાથે પૂરક છે. ફ્લો સાયટોમીટર સ્ટેનિંગ બફરમાં 0.22μm ફિલ્ટર કરેલ ફોસ્ફેટ બફર કરેલ ખારા (PBS; ઇન્વિટ્રોજન) 3% ગરમી-નિષ્ક્રિય AB માનવ સીરમ (સિગ્મા) સાથે પૂરક છે. કોષ સંવર્ધન બફર 0.22μm ફિલ્ટર કરેલ PBS થી બનેલો છે અને 0.5% ગરમી-નિષ્ક્રિય માનવ AB સીરમ (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) સાથે પૂરક છે.
૩૭°C પૂર્ણ માધ્યમમાં, કોષોને ૧૦ nM MT DR અને ૧૦૦ μM 2-NBDG થી ૩૦ મિનિટ માટે રંગવામાં આવ્યા હતા. આગળ, કોષોને ૧૫ મિનિટ માટે ૪°C પર વાયેબિલિટી ડાઇ eF506 થી રંગવામાં આવ્યા હતા. FC બ્લોક (eBioscience) અને બ્રિલિયન્ટ સ્ટેન બફર (BD Biosciences) માં કોષોને ફરીથી સસ્પેન્ડ કરો, ફ્લો સાયટોમીટર સ્ટેનિંગ બફરમાં પાતળું કરો (ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર), અને ઓરડાના તાપમાને ૧૦ મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો. ૪°C પર ફ્લો સાયટોમેટ્રી સ્ટેનિંગ બફરમાં ૨૦ મિનિટ માટે એન્ટિબોડીઝ (ટેબલ S2) ના સમૂહ સાથે કોષોને રંગ આપો. વિશ્લેષણ પહેલાં કોષોને ફ્લો સાયટોમેટ્રી સ્ટેનિંગ બફર (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R રૂપરેખાંકન) માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરો. સેલ કાઉન્ટ ડેટાનું વિશ્લેષણ કરવા માટે SpectroFlo અને FlowJo V10 નો ઉપયોગ કરો, અને ડેટા બનાવવા માટે GraphPad Prism 8 નો ઉપયોગ કરો. 2-NBDG અને MT DR ની મધ્ય ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતા (MFI) ને લોગ-નોર્મલાઇઝ કરવામાં આવી હતી, અને પછી મેળ ખાતા દર્દીઓ માટે આંકડાકીય વિશ્લેષણ માટે જોડી કરેલ t પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. વિશ્લેષણમાંથી 40 થી ઓછી ઘટનાઓ ધરાવતી બધી વસ્તીઓને દૂર કરો; આંકડાકીય વિશ્લેષણ અને ડેટા વિઝ્યુલાઇઝેશન કરતા પહેલા કોઈપણ નકારાત્મક મૂલ્યો માટે 1 નું MFI મૂલ્ય દાખલ કરો.
ઉપરોક્ત પ્રક્રિયા પેનલની મેન્યુઅલ ગેટિંગ વ્યૂહરચનાને પૂરક બનાવવા માટે, અમે FlowJo માં મૃત કોષોને દૂર કર્યા પછી વસ્તીને આપમેળે કોષો સોંપવા માટે આકાર પ્રતિબંધ વૃક્ષ (FAUST) (21) દ્વારા સંપૂર્ણ એનોટેશનનો ઉપયોગ કર્યો. ખોટી રીતે ફાળવેલ વસ્તી (PD1+ ને PD1-ટ્યુમર કોષો સાથે જોડીને) અને જાળવી રાખેલી વસ્તીને મર્જ કરવા માટે અમે મેન્યુઅલી આઉટપુટનું સંચાલન કરીએ છીએ. દરેક નમૂનામાં કુલ 11 વસ્તી માટે સરેરાશ 2% થી વધુ કોષો હોય છે.
લ્યુકોસાઇટ સેપરેશન પ્રોડક્ટ્સ (STEMCELL ટેક્નોલોજીસ) થી PBMC ને અલગ કરવા માટે Ficoll ગ્રેડિયન્ટ ડેન્સિટી સેન્ટ્રીફ્યુગેશનનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર, CD8 + T કોષોને PBMC થી CD8 માઇક્રોબીડ્સ (મિલ્ટેની) નો ઉપયોગ કરીને અલગ કરવામાં આવ્યા હતા અને ટ્રાન્સએક્ટ (મિલ્ટેની) નો ઉપયોગ કરીને 2 અઠવાડિયા માટે સંપૂર્ણ માધ્યમમાં વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યા હતા. IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) ધરાવતા સંપૂર્ણ માધ્યમમાં કોષોને 5 દિવસ સુધી ઊભા રહેવા દેવામાં આવ્યા હતા, અને પછી ટ્રાન્સએક્ટ સાથે ફરીથી ઉત્તેજિત કરવામાં આવ્યા હતા. 7મા દિવસે, ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર, માનવ CD45 માઇક્રોબીડ્સ (મિલ્ટેની) નો ઉપયોગ સતત ત્રણ રાઉન્ડમાં કોષોને સમૃદ્ધ બનાવવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. કોષોને ફ્લો સાયટોમેટ્રી વિશ્લેષણ માટે (ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ) અલગ કરવામાં આવ્યા હતા, અને LC-MS/MS વિશ્લેષણ માટે ત્રણ વખત અલગ કરવામાં આવ્યા હતા. નીચે વર્ણવ્યા મુજબ LC-MS/MS દ્વારા નમૂનાઓ પર પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી. અમે 1,000 ની આયન સંખ્યા સાથે ગુમ થયેલ મેટાબોલિટ મૂલ્યનો અંદાજ લગાવ્યો હતો. દરેક નમૂનાને કુલ આયન નંબર (TIC) દ્વારા સામાન્ય બનાવવામાં આવે છે, લઘુગણક રૂપે રૂપાંતરિત કરવામાં આવે છે અને વિશ્લેષણ પહેલાં MetaboAnalystR માં આપમેળે સામાન્ય કરવામાં આવે છે.
દરેક દર્દીના સિંગલ સેલ સસ્પેન્શનને પીગળીને 40 μm ફિલ્ટર દ્વારા સંપૂર્ણ માધ્યમમાં ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યું હતું (ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ). ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ મુજબ, CD8+, CD4+ અને CD45- કોષો (બરફ પર) માટે નમૂનાઓને સમૃદ્ધ બનાવવા માટે માઇક્રોબીડ્સ (મિલ્ટેની) નો ઉપયોગ કરીને ચુંબકીય મણકાના વિભાજન દ્વારા સકારાત્મક પસંદગીના સતત ત્રણ રાઉન્ડનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. ટૂંકમાં, કોષોને કોષ સંવર્ધન બફરમાં (ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ) ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવે છે અને ગણતરી કરવામાં આવે છે. કોષોને માનવ CD8 મણકા, માનવ CD4 મણકા અથવા માનવ CD45 મણકા (મિલ્ટેની) સાથે 4°C પર 15 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા, અને પછી કોષ સંવર્ધન બફરથી ધોવામાં આવ્યા હતા. નમૂનાને LS સ્તંભ (મિલ્ટેની)માંથી પસાર કરવામાં આવે છે, અને હકારાત્મક અને નકારાત્મક અપૂર્ણાંક એકત્રિત કરવામાં આવે છે. સમયગાળો ઘટાડવા અને કોષ પુનઃપ્રાપ્તિના પગલાને મહત્તમ કરવા માટે, પછી CD8-અપૂર્ણાંકનો ઉપયોગ CD4+ સંવર્ધનના બીજા રાઉન્ડ માટે કરવામાં આવે છે, અને CD4-અપૂર્ણાંકનો ઉપયોગ અનુગામી CD45-સંવર્ધન માટે થાય છે. વિભાજન પ્રક્રિયા દરમ્યાન દ્રાવણને બરફ પર રાખો.
મેટાબોલાઇટ વિશ્લેષણ માટે નમૂનાઓ તૈયાર કરવા માટે, કોષોને બરફ-ઠંડા મીઠાના દ્રાવણથી એકવાર ધોવામાં આવ્યા હતા, અને દરેક નમૂનામાં 1 મિલી 80% મિથેનોલ ઉમેરવામાં આવ્યું હતું, પછી પ્રવાહી નાઇટ્રોજનમાં વમળ અને સ્નેપ ફ્રીઝ કરવામાં આવ્યું હતું. નમૂનાઓને ત્રણ ફ્રીઝ-થો ચક્રને આધિન કરવામાં આવ્યા હતા અને 14,000 rpm પર 4°C પર 15 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા. મેટાબોલાઇટ્સ ધરાવતા સુપરનેટન્ટને સૂકા થાય ત્યાં સુધી બાષ્પીભવન કરવામાં આવે છે. મેટાબોલાઇટ્સને 0.03% ફોર્મિક એસિડના 50 μl માં ફરીથી ઓગળવામાં આવ્યા હતા, મિશ્ર કરવા માટે વમળ કરવામાં આવ્યા હતા, અને પછી કાટમાળ દૂર કરવા માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા.
ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ મેટાબોલાઇટ્સ કાઢો. મેટાબોલોમિક્સ સંશોધન માટે સુપરનેટન્ટને ઉચ્ચ પ્રદર્શન પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફી બોટલમાં સ્થાનાંતરિત કરો. બેચ અસરોને રોકવા માટે દરેક નમૂનાને સમાન સંખ્યામાં કોષો સાથે સારવાર કરવા માટે રેન્ડમ ટ્રીટમેન્ટ પ્રોટોકોલનો ઉપયોગ કરો. અમે AB SCIEX QTRAP 5500 ટ્રિપલ ક્વાડ્રુપોલ માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર (50) પર અગાઉ પ્રકાશિત વૈશ્વિક મેટાબોલાઇટ્સનું ગુણાત્મક મૂલ્યાંકન કર્યું. ક્રોમેટોગ્રાફિક વિશ્લેષણ અને પીક એરિયા ઇન્ટિગ્રેશન મલ્ટિક્વોન્ટ વર્ઝન 2.1 સોફ્ટવેર (એપ્લાઇડ બાયોસિસ્ટમ્સ SCIEX) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.
ગુમ થયેલ મેટાબોલિટ મૂલ્યનો અંદાજ કાઢવા માટે 1000 ની આયન ગણતરીનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, અને દરેક નમૂનાના TIC નો ઉપયોગ નમૂના પ્રક્રિયામાંથી ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટલ વિશ્લેષણ દ્વારા રજૂ કરાયેલા ફેરફારોને સુધારવા માટે દરેક શોધાયેલ મેટાબોલિટના સામાન્યકૃત ટોચ ક્ષેત્રની ગણતરી કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. TIC નોર્મલાઇઝ થયા પછી, MetaboAnalystR(51) (ડિફોલ્ટ પરિમાણ) નો ઉપયોગ લોગરીધમિક રૂપાંતર અને સ્વચાલિત ધોરણ રેખા સ્કેલિંગ માટે થાય છે. અમે નમૂના પ્રકારો વચ્ચે મેટાબોલોમ તફાવતોનું સંશોધનાત્મક વિશ્લેષણ કરવા માટે વેગન R પેકેજ સાથે PCA નો ઉપયોગ કર્યો, અને દર્દીઓનું વિશ્લેષણ કરવા માટે આંશિક રીડન્ડન્સી વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કર્યો. નમૂનાઓ વચ્ચે યુક્લિડિયન અંતરને ક્લસ્ટર કરવા માટે હીટ મેપ ડેન્ડ્રોગ્રામ બનાવવા માટે વોર્ડ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરો. અમે સમગ્ર કોષ પ્રકાર અને સૂક્ષ્મ પર્યાવરણમાં વિભિન્ન રીતે વિપુલ પ્રમાણમાં મેટાબોલિટ્સને ઓળખવા માટે પ્રમાણિત મેટાબોલિટ વિપુલતા પર લિમ્મા (52) નો ઉપયોગ કર્યો. સમજૂતીને સરળ બનાવવા માટે, અમે મોડેલનો ઉલ્લેખ કરવા માટે જૂથ સરેરાશ પરિમાણનો ઉપયોગ કરીએ છીએ, અને સૂક્ષ્મ પર્યાવરણમાં કોષ પ્રકારોને દરેક જૂથ (n = 6 જૂથો) તરીકે ધ્યાનમાં લઈએ છીએ; મહત્વ પરીક્ષણ માટે, અમે દરેક મેટાબોલાઇટ માટે ત્રણ પુનરાવર્તિત માપન કર્યા. ખોટી પ્રતિકૃતિ ટાળવા માટે, દર્દીને લિમ્મા ડિઝાઇનમાં અવરોધ તરીકે સમાવવામાં આવ્યો હતો. વિવિધ દર્દીઓ વચ્ચે મેટાબોલાઇટ્સમાં તફાવતો તપાસવા માટે, અમે દર્દીઓ સહિત લિમ્મા મોડેલને નિશ્ચિત રીતે ગોઠવ્યું. અમે કોષ પ્રકાર અને પેડજ <0.05 (બેન્જામિન-હોચબર્ગ કરેક્શન) ના સૂક્ષ્મ પર્યાવરણ વચ્ચે પૂર્વ-નિર્દિષ્ટ વિરોધાભાસના મહત્વની જાણ કરીએ છીએ.
મિલ્ટેની ડેડ સેલ રિમૂવલ કીટ (>80% સધ્ધરતા) નો ઉપયોગ કરીને ઉત્સાહ સંવર્ધન પછી, 10x 5′જીન અભિવ્યક્તિ પ્રોટોકોલનો ઉપયોગ કરીને કુલ જીવંત સ્થિર જલોદર અને ગાંઠના નમૂનાઓ પર સિંગલ-સેલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ સિક્વન્સિંગ કરવામાં આવ્યું. મેળ ખાતી ગાંઠો અને જલોદર સાથેના પાંચ કેસોનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું, જોકે એક ગાંઠના નમૂનામાંથી ઓછી સધ્ધરતાએ તેના સમાવેશને અટકાવ્યો. દર્દીઓની બહુવિધ પસંદગીઓ પ્રાપ્ત કરવા માટે, અમે 10x ક્રોમિયમ કંટ્રોલરની લેનમાં દરેક દર્દીના નમૂનાઓને જોડ્યા, અને જલોદર અને ગાંઠના સ્થળોનું અલગથી વિશ્લેષણ કર્યું. સિક્વન્સિંગ પછી [ઇલ્યુમિના હાઇસેક 4000 28×98 બીપી જોડીવાળા અંત (પીઇ), ક્વિબેક જીનોમ; ગાંઠ અને જલોદર માટે પ્રતિ કોષ અનુક્રમે 73,488 અને 41,378 રીડ]], અમે CellSNP અને Vireo (53) નો ઉપયોગ કર્યો (CellSNP પર આધારિત કારણ કે GRCh38 દ્વારા પ્રદાન કરાયેલ સામાન્ય માનવ SNP (VCF) ને દાતાની ઓળખ સોંપવામાં આવી છે. અમે દર્દીના જીનોટાઇપ સ્ટેટસ (IBS) ની સૌથી નજીકની ઓળખ (IBS) શોધવા માટે SNPRelate નો ઉપયોગ કરીએ છીએ, જેમાં ડુપ્લેક્સ તરીકે ઓળખાતા ન હોય તેવા કોષો અને કોષોને બાદ કરતા અને જલોદર અને ગાંઠના નમૂનાઓ વચ્ચે મેળ ખાતા દાતાઓને (54). આ કાર્યના આધારે, અમે ડાઉનસ્ટ્રીમ વિશ્લેષણ માટે ગાંઠ અને જલોદરમાં વિપુલ પ્રમાણમાં કોષ પ્રતિનિધિત્વ ધરાવતા ત્રણ કેસ જાળવી રાખ્યા. સ્કેટર (55) અને સ્ક્રેન (56) બાયોકંડક્ટર પેકેજિંગમાં માસ ફિલ્ટરેશન સ્ટેપ કર્યા પછી, આનાથી વિશ્લેષણ માટે 6975 કોષો (અનુક્રમે ગાંઠ અને જલોદરમાંથી 2792 અને 4183 કોષો) મળ્યા. અમે શેર કરેલા નજીકના પડોશી નેટવર્ક (SNN) ના igraph's (57) Louvain ક્લસ્ટરિંગનો ઉપયોગ કરીએ છીએ. અભિવ્યક્તિ દ્વારા ક્લસ્ટર કોષોનું જેકાર્ડ અંતર. માર્કર જનીન અભિવ્યક્તિના આધારે ક્લસ્ટરોને મેન્યુઅલી પુટેટિવ ​​સેલ પ્રકારોમાં એનોટેટ કરવામાં આવ્યા હતા અને t-SNE સાથે વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવ્યા હતા. સાયટોટોક્સિક T કોષો CD8A અને GZMA ની અભિવ્યક્તિ દ્વારા વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવે છે, જેમાં ઓછી રિબોસોમલ પ્રોટીન અભિવ્યક્તિવાળા સબક્લસ્ટરોનો સમાવેશ થાય છે. અમે Izar et al. (16) ના પ્રકાશિત ડેટાને ઍક્સેસ કર્યો, જેમાં તેમના t-SNE એમ્બેડિંગનો સમાવેશ થાય છે, જે રોગપ્રતિકારક કોષ માર્કર્સ અને NNMT અભિવ્યક્તિ વચ્ચે અભિવ્યક્તિ ઓવરલેપને નિયંત્રિત કરી શકે છે.
ફિકોલ ગ્રેડિયન્ટ ડેન્સિટી સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા પીબીએમસીને લ્યુકોસાઇટ સેપરેશન પ્રોડક્ટ્સ (STEMCELL ટેક્નોલોજીસ) થી અલગ કરવામાં આવ્યા હતા. સીડી3 બીડ્સ (મિલ્ટેની) નો ઉપયોગ કરીને સીડી3 + કોષોને પીબીએમસીથી અલગ કરવામાં આવ્યા હતા. એમએનએની હાજરી અથવા ગેરહાજરીમાં, સીડી3+ કોષોને પ્લેટ-બાઉન્ડ સીડી3 (5μg/ml), દ્રાવ્ય સીડી28 (3μg/ml) અને આઈએલ-2 (300 યુ/એમએલ; પ્રોલ્યુકિન) સાથે સક્રિય કરવામાં આવ્યા હતા. વિસ્તરણના છેલ્લા દિવસે, સધ્ધરતા (ફિક્સેબલ વાયબિલિટી ડાય ઇફ્લુઓર450, ઇબાયોસાયન્સ) અને પ્રસાર (123count ઇબીડ્સ, થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) નું ફ્લો સાયટોમેટ્રી દ્વારા મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું. ગોલ્ગીસ્ટોપ સાથે PMA (20 ng/ml) અને આયોનોમિસિન (1μg/ml) સાથે કોષોને ઉત્તેજીત કરીને 4 કલાક માટે ઇફેક્ટર કાર્યનું મૂલ્યાંકન કરો, અને CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) અને TNFα-ફ્લોરોસેન આઇસોથિયોસાયનેટ (FITC) (MAb11, BD) નું નિરીક્ષણ કરો. 4 કલાક માટે PMA (20 ng/ml) અને આયોનોમિસિન (1μg/ml) સાથે qPCR અને ChIP કોષોને ઉત્તેજીત કરો. ELISA સુપરનેટન્ટ PMA (20 ng/ml) અને આયોનોમિસિન (1 μg/ml) સાથે ઉત્તેજના પહેલાં અને પછી 4 કલાક માટે એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) નો ઉપયોગ કરીને RNA ને અલગ કરવા માટે ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલનું પાલન કરો. નમૂનાને એકરૂપ બનાવવા માટે QIAshredder (QIAGEN) નો ઉપયોગ કરો. પૂરક DNA (cDNA) ને સંશ્લેષિત કરવા માટે cDNA કીટ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) માં ઉચ્ચ-ક્ષમતાવાળા RNA નો ઉપયોગ કરો. નીચેના પ્રોબ્સ સાથે જનીન અભિવ્યક્તિ (ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ અનુસાર) માપવા માટે TaqMan Rapid Advanced Master Mix (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) નો ઉપયોગ કરો: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [ગ્લિસેરાલ્ડીહાઇડ-3-ફોસ્ફેટ ઓફ હાઇડ્રોજન (GAPDH)] અને Hs01010726_m1 (SLC22A2). આ નમૂનાઓ સ્ટેપવનપ્લસ રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર સિસ્ટમ (એપ્લાઇડ બાયોસિસ્ટમ્સ) (એપ્લાઇડ બાયોસિસ્ટમ્સ) પર માઇક્રોએમ્પ ઓપ્ટિકલ ફિલ્મ સાથે માઇક્રોએમ્પ ફાસ્ટ ઓપ્ટિકલ 96-વેલ રિએક્શન પ્લેટ (એપ્લાઇડ બાયોસિસ્ટમ્સ) માં ચલાવવામાં આવ્યા હતા. કોઈપણ સીટી મૂલ્ય જે 35 થી વધુ હોય તેને શોધ થ્રેશોલ્ડથી ઉપર ગણવામાં આવે છે અને તેને શોધી શકાતું નથી તરીકે ચિહ્નિત કરવામાં આવે છે.
અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ ChIP કરો (58). ટૂંકમાં, કોષોને ફોર્માલ્ડીહાઇડ (અંતિમ સાંદ્રતા 1.42%) સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી અને ઓરડાના તાપમાને 10 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા હતા. પૂરક સોજો બફર (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl અને 0.1% NP-40) નો ઉપયોગ બરફ પર 10 મિનિટ માટે કરો, પછી વર્ણવ્યા મુજબ ઇમ્યુનોપ્રીસિપિટેશન બફરમાં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરો (58). ત્યારબાદ નમૂનાને નીચેના ચક્રો સાથે સોનિકેટ કરવામાં આવ્યું: 10 ચક્ર (20 1-સેકન્ડ પલ્સ) અને 40 સેકન્ડનો સ્થિર સમય. ChIP-ગ્રેડ ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન G (સેલ સિગ્નલિંગ ટેકનોલોજી; 1μl), હિસ્ટોન H3 (સેલ સિગ્નલિંગ ટેકનોલોજી; 3μl), NFAT (ઇન્વિટ્રોજન; 3μl) અને SP1 (સેલ સિગ્નલિંગ ટેકનોલોજી; 3μl) એન્ટિબોડીઝને 4°CC પર રાતોરાત શેક પર નમૂના સાથે ઇન્ક્યુબેટ કરો. પ્રોટીન A બીડ્સ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) ને 4°C તાપમાને સેમ્પલ સાથે 1 કલાક માટે હળવેથી હલાવીને ઇન્ક્યુબેટ કરો, પછી DNA ને સમૃદ્ધ બનાવવા માટે ચેલેક્સ બીડ્સ (બાયો-રેડ) નો ઉપયોગ કરો અને પ્રોટીન પાચન માટે પ્રોટીનેઝ K (થર્મો ફિશર) નો ઉપયોગ કરો. TNFα પ્રમોટર PCR દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું: ફોરવર્ડ, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; તેનાથી વિપરીત, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp ઉત્પાદન). છબીઓ ઇમેજ લેબ (બાયો-રેડ) દ્વારા બનાવવામાં આવી હતી અને ઇમેજજે સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને તેનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું.
ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ સેલ કલ્ચર સુપરનેટન્ટ એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. આ નિર્ધારણ ઉત્પાદકની માનવ TNFα ELISA કીટ (Invitrogen), માનવ IL-2 ELISA કીટ (Invitrogen) અને માનવ IFN-γ ELISA કીટ (Abcam) ની પ્રક્રિયાઓ અનુસાર કરવામાં આવ્યું હતું. ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ મુજબ, TNFα અને IL-2 શોધવા માટે સુપરનેટન્ટને 1:100 અને IFN-γ શોધવા માટે 1:3 પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું. 450 nm પર શોષણ માપવા માટે EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) નો ઉપયોગ કરો.
ફિકોલ ગ્રેડિયન્ટ ડેન્સિટી સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા પીબીએમસીને લ્યુકોસાઇટ સેપરેશન પ્રોડક્ટ્સ (STEMCELL ટેક્નોલોજીસ) થી અલગ કરવામાં આવ્યા હતા. સીડી3 બીડ્સ (મિલ્ટેની) નો ઉપયોગ કરીને સીડી3 + કોષોને પીબીએમસીથી અલગ કરવામાં આવ્યા હતા. એમએનએની હાજરી અથવા ગેરહાજરીમાં, સીડી3+ કોષોને પ્લેટ-બાઉન્ડ સીડી3 (5μg/ml), દ્રાવ્ય સીડી28 (3μg/ml) અને આઈએલ-2 (300 યુ/એમએલ; પ્રોલ્યુકિન) સાથે 3 દિવસ માટે સક્રિય કરવામાં આવ્યા હતા. 3 દિવસ પછી, કોષો એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને 0.9% ખારાથી ધોવામાં આવ્યા હતા, અને પેલેટને સ્નેપ ફ્રીઝ કરવામાં આવ્યું હતું. 123count eBeads નો ઉપયોગ કરીને ફ્લો સાયટોમેટ્રી (સાયટેક ઓરોરા; 3L-16V-14B-8R કન્ફિગરેશન) દ્વારા કોષ ગણતરી કરવામાં આવી હતી.
ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ અર્ક મેટાબોલાઇટ્સ. સૂકા અર્કનું પુનર્ગઠન 4000 કોષ સમકક્ષ/μl ની સાંદ્રતા પર કરવામાં આવ્યું હતું. રિવર્સ્ડ-ફેઝ ક્રોમેટોગ્રાફી (1290 ઇન્ફિનિટી II, એજિલેન્ટ ટેક્નોલોજીસ, સાન્ટા ક્લેરા, CA) અને CORTECS T3 કોલમ (2.1×150 mm, કણ કદ 1.6-μm, છિદ્ર કદ 120-Å; #186008500, વોટર્સ) દ્વારા નમૂનાનું વિશ્લેષણ કરો. ધ્રુવીય માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર (6470, એજિલેન્ટ), જેમાં ઇલેક્ટ્રોસ્પ્રે આયનીકરણ હકારાત્મક સ્થિતિમાં કાર્ય કરે છે. મોબાઇલ તબક્કો A 0.1% ફોર્મિક એસિડ (H2O માં), મોબાઇલ તબક્કો B 90% એસિટોનિટ્રાઇલ, 0.1% ફોર્મિક એસિડ છે. LC ગ્રેડિયન્ટ 100% A માટે 0 થી 2 મિનિટ, 99% B માટે 2 થી 7.1 મિનિટ અને 99% B માટે 7.1 થી 8 મિનિટ છે. પછી 3 મિનિટ માટે 0.6 મિલી/મિનિટના પ્રવાહ દરે મોબાઇલ ફેઝ A સાથે સ્તંભને ફરીથી સંતુલિત કરો. . પ્રવાહ દર 0.4 મિલી/મિનિટ છે, અને સ્તંભ ચેમ્બરને 50°C સુધી ગરમ કરવામાં આવે છે. રીટેન્શન સમય (RT) અને ટ્રાન્સફોર્મેશન (RT = 0.882 મિનિટ, ટ્રાન્સફોર્મેશન 1 = 137→94.1, ટ્રાન્સફોર્મેશન 2 = 137→92, કન્વર્ઝન 3 = 137→78) સ્થાપિત કરવા માટે MNA ના શુદ્ધ રાસાયણિક ધોરણ (M320995, ટોરોન્ટો રિસર્ચ કેમિકલ કંપની, નોર્થ યોર્ક, ઓન્ટારિયો, કેનેડા) નો ઉપયોગ કરો. જ્યારે ત્રણેય સંક્રમણો યોગ્ય રીટેન્શન સમયે થાય છે, ત્યારે ચોક્કસતાની ખાતરી કરવા માટે સંક્રમણ 1 નો ઉપયોગ જથ્થાત્મકતા માટે થાય છે. MNA (ટોરોન્ટો રિસર્ચ કેમિકલ કંપની) નો સ્ટાન્ડર્ડ કર્વ સ્ટોક સોલ્યુશન (1 mg/ml) ના છ સીરીયલ ડિલ્યુશન દ્વારા 0.1, 1.0, 10 અને 100 ng/ml અને 1.0 અને 10μg/ml પ્રવાહીના ધોરણો મેળવવા માટે જનરેટ કરવામાં આવ્યો હતો. શોધ મર્યાદા 1 ng/ml છે, અને રેખીય પ્રતિભાવ 10 ng/ml અને 10μg/ml ની વચ્ચે છે. LC/MS વિશ્લેષણ માટે નમૂના અને ધોરણના બે માઇક્રોલિટરના દરેક ઇન્જેક્શનનો ઉપયોગ થાય છે, અને વિશ્લેષણ પ્લેટફોર્મની સ્થિરતા સુનિશ્ચિત કરવા માટે દર આઠ ઇન્જેક્શન પર મિશ્ર ગુણવત્તા નિયંત્રણ નમૂના ચલાવવામાં આવે છે. બધા MNA-સારવાર કરાયેલા કોષ નમૂનાઓના MNA પ્રતિભાવો એસેની રેખીય શ્રેણીમાં હતા. ડેટા વિશ્લેષણ માસહન્ટર જથ્થાત્મક વિશ્લેષણ સોફ્ટવેર (v9.0, એજિલેન્ટ) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.
બીજી પેઢીના αFR-CAR બાંધકામને સોંગ એટ અલ. (59) માંથી લેવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, બાંધકામમાં નીચેની સામગ્રી શામેલ છે: CD8a લીડર સિક્વન્સ, માનવ αFR-વિશિષ્ટ સિંગલ-ચેઇન ચલ ફ્રેગમેન્ટ, CD8a હિન્જ અને ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન ક્ષેત્ર, CD27 ઇન્ટ્રાસેલ્યુલર ડોમેન અને CD3z ઇન્ટ્રાસેલ્યુલર ડોમેન. સંપૂર્ણ CAR ક્રમને GenScript દ્વારા સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યો હતો, અને પછી ટ્રાન્સડક્શન કાર્યક્ષમતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતા GFP અભિવ્યક્તિ કેસેટના અપસ્ટ્રીમમાં બીજી પેઢીના લેન્ટિવાયરલ અભિવ્યક્તિ વેક્ટરમાં ક્લોન કરવામાં આવ્યો હતો.
લેન્ટીવાયરસ HEK293T કોષો [અમેરિકન ટાઇપ કલ્ચર કલેક્શન (ATCC)] ના ટ્રાન્સફેક્શન દ્વારા ઉત્પન્ન થાય છે; 10% ફેટલ બોવાઇન સીરમ (FBS) અને 1% પેનસ્ટ્રેપ ધરાવતા ડલ્બેકોના સંશોધિત ઇગલ માધ્યમમાં ઉગાડવામાં આવે છે, અને CAR-GFP વેક્ટરનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે અને પેકેજિંગ પ્લાઝમિડ્સ (psPAX2 અને pMD2.G, એડજીન) લિપોફેક્શન એમાઇન (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) નો ઉપયોગ કરે છે. વાયરસ ધરાવતું સુપરનેટન્ટ ટ્રાન્સફેક્શન પછી 48 અને 72 કલાક પછી એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું, ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યું હતું અને અલ્ટ્રાસેન્ટ્રિફ્યુગેશન દ્વારા કેન્દ્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. ટ્રાન્સડક્શન સુધી -80°C પર કેન્દ્રિત વાયરલ સુપરનેટન્ટ સ્ટોર કરો.
ફિકોલ ગ્રેડિયન્ટ ડેન્સિટી સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા PBMC ને સ્વસ્થ દાતા લ્યુકોસાઇટ સેપરેશન પ્રોડક્ટ્સ (STEMCELL ટેક્નોલોજીસ) થી અલગ કરવામાં આવે છે. PBMC થી CD8+ કોષોને અલગ કરવા માટે પોઝિટિવ સિલેક્શન CD8 માઇક્રોબીડ્સ (મિલ્ટેની) નો ઉપયોગ કરો. ટ્રાન્સએક્ટ (મિલ્ટેની) અને ટેક્સમેક્સ માધ્યમમાં T કોષોને ઉત્તેજીત કરો [મિલ્ટેની; 3% ગરમી-નિષ્ક્રિય માનવ સીરમ, 1% પેનસ્ટ્રેપ અને IL-2 (300 U/ml) સાથે પૂરક]. ઉત્તેજના પછી ચોવીસ કલાક પછી, T કોષોને લેન્ટીવાયરસ (106 કોષો દીઠ 10 μl કેન્દ્રિત વાયરસ સુપરનેટન્ટ) સાથે ટ્રાન્સડ્યુસ કરવામાં આવ્યા હતા. Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+ પર ટ્રાન્સડક્શનના 1 થી 3 દિવસ પછી, કોષોની GFP અભિવ્યક્તિનું મૂલ્યાંકન કરો જેથી ઓછામાં ઓછી 30% ટ્રાન્સડક્શન કાર્યક્ષમતા દર્શાવી શકાય.
CAR-T કોષોને ઇમ્યુનોકલ્ટ (STEMCELL ટેક્નોલોજીસ; 1% પેનસ્ટ્રેપ સાથે પૂરક) માં 24 કલાક માટે નીચેની પરિસ્થિતિઓ હેઠળ સંવર્ધન કરવામાં આવ્યું હતું: સારવાર ન કરાયેલ, 250 μM એડેનોસિન અથવા 10 mM MNA સાથે સારવાર આપવામાં આવી. પ્રીટ્રીટમેન્ટ પછી, CAR-T કોષોને PBS થી ધોવામાં આવ્યા હતા અને 20,000 SK-OV-3 કોષો સાથે જોડવામાં આવ્યા હતા [ATCC; મેકકોય 5A માધ્યમ (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) માં 10% FBS અને 1% પેનસ્ટ્રેપ સાથે 10 પર પૂરક: 1 ના ઇફેક્ટર ટુ ટાર્ગેટ રેશિયોને પૂરક ઇમ્યુનોકલ્ટ માધ્યમમાં ત્રિપુટીમાં વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યો હતો. ડિજિટલિસ સેપોનિન (0.5mg/ml; સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) સાથે લાઇઝ કરેલા SK-OV-3 કોષો અને SK-OV-3 કોષોનો ઉપયોગ અનુક્રમે નકારાત્મક અને હકારાત્મક નિયંત્રણો તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. 24 કલાકના સહ-ખેતી પછી, સુપરનેટન્ટ એકત્રિત કરવામાં આવ્યું અને ઉત્પાદકની સૂચનાઓ (LDH ગ્લો સાયટોટોક્સિસિટી એસે કીટ, પ્રોમેગા) અનુસાર લેક્ટેટ ડિહાઇડ્રોજેનેઝ (LDH) માપવામાં આવ્યું. LDH સુપરનેટન્ટને LDH બફરમાં 1:50 પાતળું કરવામાં આવ્યું. હત્યાની ટકાવારી નીચેના સૂત્રનો ઉપયોગ કરીને માપવામાં આવી: હત્યાની ટકાવારી = સુધારણાની ટકાવારી / મહત્તમ હત્યા દર x 100%, જ્યાં સુધારણાની ટકાવારી = ફક્ત સહ-સંવર્ધન-T કોષો, અને મહત્તમ હત્યા દર = હકારાત્મક નિયંત્રણ-નકારાત્મક નિયંત્રણ.
ટેક્સ્ટ અથવા સામગ્રી અને પદ્ધતિઓમાં વર્ણવ્યા મુજબ, આંકડાકીય વિશ્લેષણ માટે ગ્રાફપેડ પ્રિઝમ 8, માઇક્રોસોફ્ટ એક્સેલ અથવા R v3.6.0 નો ઉપયોગ કરો. જો એક જ દર્દી પાસેથી બહુવિધ નમૂનાઓ એકત્રિત કરવામાં આવે છે (જેમ કે જલોદર અને ગાંઠ), તો અમે જોડીવાળા ટી પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીએ છીએ અથવા દર્દીને યોગ્ય રીતે રેખીય અથવા સામાન્યકૃત મોડેલમાં રેન્ડમ અસર તરીકે શામેલ કરીએ છીએ. મેટાબોલોમિક્સ વિશ્લેષણ માટે, મહત્વ પરીક્ષણ ત્રિપુટીમાં કરવામાં આવે છે.
આ લેખ માટે પૂરક સામગ્રી માટે, કૃપા કરીને http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 જુઓ.
આ એક ઓપન એક્સેસ લેખ છે જે ક્રિએટિવ કોમન્સ એટ્રિબ્યુશન-નોન-કોમર્શિયલ લાઇસન્સની શરતો હેઠળ વિતરિત કરવામાં આવે છે, જે કોઈપણ માધ્યમમાં ઉપયોગ, વિતરણ અને પુનઃઉત્પાદનની મંજૂરી આપે છે, જ્યાં સુધી અંતિમ ઉપયોગ વ્યાપારી લાભ માટે ન હોય અને આધાર એ હોય કે મૂળ કાર્ય સાચું છે. સંદર્ભ.
નોંધ: અમે તમને ફક્ત તમારું ઇમેઇલ સરનામું આપવાનું કહીએ છીએ જેથી તમે જે વ્યક્તિને પેજ પર ભલામણ કરો છો તે જાણે કે તમે ઇચ્છો છો કે તે ઇમેઇલ જુએ અને તે સ્પામ ન હોય. અમે કોઈપણ ઇમેઇલ સરનામાં કેપ્ચર કરીશું નહીં.
આ પ્રશ્નનો ઉપયોગ તમે મુલાકાતી છો કે નહીં તે ચકાસવા અને આપમેળે સ્પામ સબમિશન અટકાવવા માટે થાય છે.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. N. J. R. B. એચ. આર. બી.), જે.આર. ડીબેરાર્ડિનિસ), રસેલ જી. જોન્સ (રસેલ જી. જોન્સ), ફિનાસ ટી. હેમિલ્ટન (ફિનીસ ટી.
MNA ટી કોષોના રોગપ્રતિકારક દમનમાં ફાળો આપે છે અને માનવ કેન્સરની સારવાર માટે સંભવિત ઇમ્યુનોથેરાપી લક્ષ્યનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. N. J. R. B. એચ. આર. બી.), જે.આર. ડીબેરાર્ડિનિસ), રસેલ જી. જોન્સ (રસેલ જી. જોન્સ), ફિનાસ ટી. હેમિલ્ટન (ફિનીસ ટી.
MNA ટી કોષોના રોગપ્રતિકારક દમનમાં ફાળો આપે છે અને માનવ કેન્સરની સારવાર માટે સંભવિત ઇમ્યુનોથેરાપી લક્ષ્યનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.
©2021 અમેરિકન એસોસિયેશન ફોર ધ એડવાન્સમેન્ટ ઓફ સાયન્સ. તમામ અધિકારો સુરક્ષિત છે. AAAS એ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef અને COUNTER ના ભાગીદાર છે. સાયન્સ એડવાન્સ ISSN 2375-2548.