પ્રોપિયોનિક એસિડ (PPA), એક એન્ટિફંગલ એજન્ટ અને સામાન્ય ડાયેટરી એડિટિવ, ઉંદરોમાં અસામાન્ય ન્યુરોડેવલપમેન્ટનું કારણ બને છે જે ગેસ્ટ્રોઇન્ટેસ્ટાઇનલ ડિસફંક્શન સાથે હોય છે, જે આંતરડાના ડિસબાયોસિસને કારણે થઈ શકે છે. ડાયેટરી PPA એક્સપોઝર અને આંતરડાના માઇક્રોબાયોટા ડિસબાયોસિસ વચ્ચેનો સંબંધ સૂચવવામાં આવ્યો છે, પરંતુ તેની સીધી તપાસ કરવામાં આવી નથી. અહીં, અમે આંતરડાના માઇક્રોબાયોટા રચનામાં PPA-સંકળાયેલ ફેરફારોની તપાસ કરી જે ડિસબાયોસિસ તરફ દોરી શકે છે. ઉંદરોના આંતરડાના માઇક્રોબાયોમ્સને સારવાર ન કરાયેલ ખોરાક (n=9) અને PPA-સમૃદ્ધ ખોરાક (n=13) ખવડાવવામાં આવ્યા હતા, જે માઇક્રોબાયલ રચના અને બેક્ટેરિયલ મેટાબોલિક માર્ગોમાં તફાવતોનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે લાંબા-અંતરના મેટાજેનોમિક સિક્વન્સિંગનો ઉપયોગ કરીને ક્રમબદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા. ડાયેટરી PPA નોંધપાત્ર ટેક્સાના વિપુલ પ્રમાણમાં વધારા સાથે સંકળાયેલું હતું, જેમાં ઘણી બેક્ટેરોઇડ્સ, પ્રીવોટેલા અને રુમિનોકોકસ પ્રજાતિઓનો સમાવેશ થાય છે, જેમાંથી સભ્યો અગાઉ PPA ઉત્પાદનમાં સામેલ હતા. PPA-સંપર્કમાં આવેલા ઉંદરોના માઇક્રોબાયોમ્સમાં લિપિડ મેટાબોલિઝમ અને સ્ટીરોઈડ હોર્મોન બાયોસિન્થેસિસ સંબંધિત વધુ માર્ગો પણ હતા. અમારા પરિણામો સૂચવે છે કે PPA આંતરડાના માઇક્રોબાયોટા અને તેના સંકળાયેલ મેટાબોલિક માર્ગોને બદલી શકે છે. આ અવલોકન કરાયેલા ફેરફારો દર્શાવે છે કે વપરાશ માટે સલામત તરીકે વર્ગીકૃત કરાયેલા પ્રિઝર્વેટિવ્સ આંતરડાના માઇક્રોબાયોટાની રચના અને બદલામાં, માનવ સ્વાસ્થ્યને પ્રભાવિત કરી શકે છે.
માનવ માઇક્રોબાયોમને ઘણીવાર "શરીરનું છેલ્લું અંગ" તરીકે ઓળખવામાં આવે છે અને તે માનવ સ્વાસ્થ્યમાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે (બેક્વેરો અને નોમ્બેલા, 2012). ખાસ કરીને, આંતરડાના માઇક્રોબાયોમને તેના સિસ્ટમ-વ્યાપી પ્રભાવ અને ઘણા આવશ્યક કાર્યોમાં ભૂમિકા માટે ઓળખવામાં આવે છે. આંતરડામાં કોમન્સલ બેક્ટેરિયા વિપુલ પ્રમાણમાં હોય છે, જે બહુવિધ ઇકોલોજીકલ માળખાં પર કબજો કરે છે, પોષક તત્વોનો ઉપયોગ કરે છે અને સંભવિત રોગકારક જીવાણુઓ સાથે સ્પર્ધા કરે છે (જાંધ્યાલા એટ અલ., 2015). આંતરડાના માઇક્રોબાયોટાના વિવિધ બેક્ટેરિયલ ઘટકો વિટામિન જેવા આવશ્યક પોષક તત્વો ઉત્પન્ન કરવા અને પાચનને પ્રોત્સાહન આપવા સક્ષમ છે (રોલેન્ડ એટ અલ., 2018). બેક્ટેરિયલ મેટાબોલાઇટ્સ પેશીઓના વિકાસને પ્રભાવિત કરવા અને મેટાબોલિક અને રોગપ્રતિકારક માર્ગોને વધારવા માટે પણ દર્શાવવામાં આવ્યા છે (હેઇજ્ટ્ઝ એટ અલ., 2011; યુ એટ અલ., 2022). માનવ આંતરડાના માઇક્રોબાયોમની રચના અત્યંત વૈવિધ્યસભર છે અને તે આહાર, લિંગ, દવાઓ અને આરોગ્ય સ્થિતિ જેવા આનુવંશિક અને પર્યાવરણીય પરિબળો પર આધાર રાખે છે (કુંભારે એટ અલ., 2019).
માતાનો ખોરાક ગર્ભ અને નવજાત શિશુના વિકાસનો એક મહત્વપૂર્ણ ઘટક છે અને વિકાસને પ્રભાવિત કરી શકે તેવા સંયોજનોનો એક શંકાસ્પદ સ્ત્રોત છે (બેઝર એટ અલ., 2004; ઇનિસ, 2014). આવા જ એક રસિક સંયોજન પ્રોપિયોનિક એસિડ (PPA) છે, જે બેક્ટેરિયલ આથો અને ફૂડ એડિટિવ (ડેન બેસ્ટેન એટ અલ., 2013) માંથી મેળવવામાં આવતી શોર્ટ-ચેઇન ફેટી એસિડ બાય-પ્રોડક્ટ છે. PPA માં એન્ટીબેક્ટેરિયલ અને એન્ટિફંગલ ગુણધર્મો છે અને તેથી તેનો ઉપયોગ ફૂડ પ્રિઝર્વેટિવ તરીકે અને મોલ્ડ અને બેક્ટેરિયાના વિકાસને રોકવા માટે ઔદ્યોગિક એપ્લિકેશનોમાં થાય છે (વેમેનહોવ એટ અલ., 2016). PPA ની વિવિધ પેશીઓમાં વિવિધ અસરો હોય છે. યકૃતમાં, મેક્રોફેજમાં સાયટોકાઇન અભિવ્યક્તિને અસર કરીને PPA ની બળતરા વિરોધી અસરો હોય છે (કાવાસો એટ અલ., 2022). આ નિયમનકારી અસર અન્ય રોગપ્રતિકારક કોષોમાં પણ જોવા મળી છે, જેના કારણે બળતરાનું નિયમન ઓછું થાય છે (હાસે એટ અલ., 2021). જો કે, મગજમાં વિપરીત અસર જોવા મળી છે. અગાઉના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે PPA ના સંપર્કમાં આવવાથી ઉંદરોમાં ઓટીઝમ જેવું વર્તન થાય છે (એલ-અન્સરી એટ અલ., 2012). અન્ય અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે PPA ગ્લિઓસિસને પ્રેરિત કરી શકે છે અને મગજમાં બળતરા વિરોધી માર્ગોને સક્રિય કરી શકે છે (અબ્દેલી એટ અલ., 2019). કારણ કે PPA એક નબળો એસિડ છે, તે આંતરડાના ઉપકલા દ્વારા લોહીના પ્રવાહમાં ફેલાય છે અને આમ રક્ત-મગજ અવરોધ તેમજ પ્લેસેન્ટા સહિત પ્રતિબંધક અવરોધોને પાર કરી શકે છે (સ્ટિન્સન એટ અલ., 2019), બેક્ટેરિયા દ્વારા ઉત્પાદિત નિયમનકારી મેટાબોલાઇટ તરીકે PPA ના મહત્વ પર પ્રકાશ પાડે છે. જોકે ઓટીઝમ માટે જોખમ પરિબળ તરીકે PPA ની સંભવિત ભૂમિકા હાલમાં તપાસ હેઠળ છે, ઓટીઝમ ધરાવતા વ્યક્તિઓ પર તેની અસરો ન્યુરલ ડિફરન્સિયેશનને પ્રેરિત કરવા ઉપરાંત પણ વિસ્તૃત થઈ શકે છે.
ન્યુરોડેવલપમેન્ટલ ડિસઓર્ડર ધરાવતા દર્દીઓમાં ઝાડા અને કબજિયાત જેવા જઠરાંત્રિય લક્ષણો સામાન્ય છે (કાઓ એટ અલ., 2021). અગાઉના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે ઓટીઝમ સ્પેક્ટ્રમ ડિસઓર્ડર (ASD) ધરાવતા દર્દીઓનું માઇક્રોબાયોમ સ્વસ્થ વ્યક્તિઓ કરતા અલગ છે, જે આંતરડાના માઇક્રોબાયોટા ડિસબાયોસિસની હાજરી સૂચવે છે (ફાઇનગોલ્ડ એટ અલ., 2010). તેવી જ રીતે, બળતરા આંતરડાના રોગો, સ્થૂળતા, અલ્ઝાઇમર રોગ, વગેરે ધરાવતા દર્દીઓની માઇક્રોબાયોમ લાક્ષણિકતાઓ પણ સ્વસ્થ વ્યક્તિઓ કરતા અલગ છે (ટર્નબો એટ અલ., 2009; વોગ્ટ એટ અલ., 2017; હેન્કે એટ અલ., 2019). જો કે, આજ સુધી, આંતરડાના માઇક્રોબાયોમ અને ન્યુરોલોજીકલ રોગો અથવા લક્ષણો વચ્ચે કોઈ કારણભૂત સંબંધ સ્થાપિત થયો નથી (યાપ એટ અલ., 2021), જોકે ઘણી બેક્ટેરિયલ પ્રજાતિઓ આમાંની કેટલીક રોગની સ્થિતિમાં ભૂમિકા ભજવે છે તેવું માનવામાં આવે છે. ઉદાહરણ તરીકે, ઓટીઝમ ધરાવતા દર્દીઓના માઇક્રોબાયોટામાં અક્કરમેન્સિયા, બેક્ટેરોઇડ્સ, ક્લોસ્ટ્રિડિયમ, લેક્ટોબેસિલસ, ડેસલ્ફોવિબ્રિઓ અને અન્ય જાતિઓ વધુ પ્રમાણમાં જોવા મળે છે (ટોમોવા એટ અલ., 2015; ગોલુબેવા એટ અલ., 2017; ક્રિસ્ટિયાનો એટ અલ., 2018; ઝુરિટા એટ અલ., 2020). નોંધનીય છે કે, આ જાતિઓમાંની કેટલીક સભ્ય પ્રજાતિઓ PPA ઉત્પાદન સાથે સંકળાયેલા જનીનો ધરાવે છે (રીચાર્ડ એટ અલ., 2014; યુન અને લી, 2016; ઝાંગ એટ અલ., 2019; બૌર અને ડ્યુરે, 2023). PPA ના એન્ટિમાઇક્રોબાયલ ગુણધર્મોને જોતાં, તેની વિપુલતામાં વધારો PPA-ઉત્પાદક બેક્ટેરિયાના વિકાસ માટે ફાયદાકારક હોઈ શકે છે (જેકોબસન એટ અલ., 2018). આમ, PFA-સમૃદ્ધ વાતાવરણ આંતરડાના માઇક્રોબાયોટામાં ફેરફારો તરફ દોરી શકે છે, જેમાં જઠરાંત્રિય પેથોજેન્સનો સમાવેશ થાય છે, જે જઠરાંત્રિય લક્ષણો તરફ દોરી જતા સંભવિત પરિબળો હોઈ શકે છે.
માઇક્રોબાયોમ સંશોધનમાં એક મુખ્ય પ્રશ્ન એ છે કે શું માઇક્રોબાયોમ રચનામાં તફાવત એ અંતર્ગત રોગોનું કારણ છે કે લક્ષણ છે. આહાર, આંતરડાના માઇક્રોબાયોમ અને ન્યુરોલોજીકલ રોગો વચ્ચેના જટિલ સંબંધને સ્પષ્ટ કરવા તરફનું પ્રથમ પગલું એ છે કે આહારની માઇક્રોબાયોમ રચના પર થતી અસરોનું મૂલ્યાંકન કરવું. આ માટે, અમે PPA-સમૃદ્ધ અથવા PPA-ક્ષતિગ્રસ્ત ખોરાક ખવડાવતા ઉંદરોના સંતાનોના આંતરડાના માઇક્રોબાયોમ્સની તુલના કરવા માટે લાંબા સમયથી વાંચેલા મેટાજેનોમિક સિક્વન્સિંગનો ઉપયોગ કર્યો. સંતાનોને તેમની માતાઓ જેવો જ ખોરાક આપવામાં આવ્યો હતો. અમે અનુમાન લગાવ્યું હતું કે PPA-સમૃદ્ધ ખોરાક આંતરડાના માઇક્રોબાયોમ રચના અને માઇક્રોબાયલ કાર્યાત્મક માર્ગોમાં ફેરફાર કરશે, ખાસ કરીને PPA ચયાપચય અને/અથવા PPA ઉત્પાદન સાથે સંબંધિત.
આ અભ્યાસમાં FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J ટ્રાન્સજેનિક ઉંદર (જેક્સન લેબોરેટરીઝ) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો જે યુનિવર્સિટી ઓફ સેન્ટ્રલ ફ્લોરિડા ઇન્સ્ટિટ્યૂશનલ એનિમલ કેર એન્ડ યુઝ કમિટી (UCF-IACUC) (એનિમલ યુઝ પરમિટ નંબર: PROTO202000002) ની માર્ગદર્શિકાને અનુસરીને ગ્લિયા-સ્પેસિફિક GFAP પ્રમોટરના નિયંત્રણ હેઠળ ગ્રીન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન (GFP) ને ઓવરએક્સપ્રેસ કરે છે. દૂધ છોડાવ્યા પછી, ઉંદરોને દરેક પાંજરામાં દરેક જાતિના 1-5 ઉંદર સાથે પાંજરામાં વ્યક્તિગત રીતે રાખવામાં આવ્યા હતા. ઉંદરોને શુદ્ધ નિયંત્રણ આહાર (સંશોધિત ઓપન-લેબલ સ્ટાન્ડર્ડ ડાયેટ, 16 kcal% ચરબી) અથવા સોડિયમ પ્રોપિયોનેટ-સપ્લિમેન્ટેડ ડાયેટ (સંશોધિત ઓપન-લેબલ સ્ટાન્ડર્ડ ડાયેટ, 16 kcal% ચરબી, જેમાં 5,000 ppm સોડિયમ પ્રોપિયોનેટ હોય છે) સાથે એડ લિબિટમ ખવડાવવામાં આવ્યા હતા. વપરાયેલ સોડિયમ પ્રોપિયોનેટની માત્રા 5,000 મિલિગ્રામ PFA/કિલો કુલ ખોરાક વજન જેટલી હતી. આ ફૂડ પ્રિઝર્વેટિવ તરીકે ઉપયોગ માટે મંજૂર થયેલ PPA ની સૌથી વધુ સાંદ્રતા છે. આ અભ્યાસની તૈયારી માટે, માતાપિતા ઉંદરોને સમાગમના 4 અઠવાડિયા પહેલા બંને ખોરાક આપવામાં આવ્યા હતા અને માતાની ગર્ભાવસ્થા દરમિયાન ચાલુ રાખવામાં આવ્યા હતા. સંતાન ઉંદરો [22 ઉંદર, 9 નિયંત્રણો (6 નર, 3 માદા) અને 13 PPA (4 નર, 9 માદા)] ને દૂધ છોડાવવામાં આવ્યું હતું અને પછી 5 મહિના સુધી માતા જેવા જ ખોરાક પર ચાલુ રાખવામાં આવ્યા હતા. સંતાન ઉંદરોને 5 મહિનાની ઉંમરે બલિદાન આપવામાં આવ્યું હતું અને તેમના આંતરડાના મળ સામગ્રી એકત્રિત કરવામાં આવી હતી અને શરૂઆતમાં 1.5 મિલી માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં -20°C તાપમાને સંગ્રહિત કરવામાં આવી હતી અને પછી -80°C ફ્રીઝરમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવી હતી જ્યાં સુધી હોસ્ટ DNA ખાલી ન થાય અને માઇક્રોબાયલ ન્યુક્લિક એસિડ કાઢવામાં ન આવે.
સુધારેલા પ્રોટોકોલ (Charalampous et al., 2019) અનુસાર હોસ્ટ DNA દૂર કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, મળ સામગ્રીને 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) માં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવી હતી અને સ્થિર સંગ્રહિત કરવામાં આવી હતી. દરેક નિષ્કર્ષણ દીઠ મહત્તમ 1-2 મળ ગોળીઓ પર પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી. ત્યારબાદ મળ સામગ્રીને ટ્યુબની અંદર પ્લાસ્ટિક પેસ્ટલનો ઉપયોગ કરીને યાંત્રિક રીતે એકરૂપ કરવામાં આવી હતી જેથી સ્લરી બનાવવામાં આવે. નમૂનાઓને 5 મિનિટ માટે 10,000 RCF પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો અથવા જ્યાં સુધી નમૂનાઓ પેલેટ ન થાય ત્યાં સુધી, પછી સુપરનેટન્ટને એસ્પિરેટ કરો અને પેલેટને 250 µl 1× PBS માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરો. યુકેરીયોટિક કોષ પટલને છૂટા કરવા માટે ડિટર્જન્ટ તરીકે નમૂનામાં 250 µl 4.4% સેપોનિન દ્રાવણ (TCI, ઉત્પાદન નંબર S0019) ઉમેરો. નમૂનાઓને સરળ થાય ત્યાં સુધી ધીમેધીમે મિશ્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને 10 મિનિટ માટે ઓરડાના તાપમાને ઉકાળવામાં આવ્યા હતા. આગળ, યુકેરીયોટિક કોષોને વિક્ષેપિત કરવા માટે, નમૂનામાં 350 μl ન્યુક્લીઝ-મુક્ત પાણી ઉમેરવામાં આવ્યું, 30 સેકન્ડ માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું, અને પછી 12 μl 5 M NaCl ઉમેરવામાં આવ્યું. ત્યારબાદ નમૂનાઓને 5 મિનિટ માટે 6000 RCF પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા. સુપરનેટન્ટને એસ્પિરેટ કરો અને પેલેટને 100 μl 1X PBS માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરો. હોસ્ટ DNA દૂર કરવા માટે, 100 μl HL-SAN બફર (12.8568 ગ્રામ NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml ન્યુક્લીઝ-મુક્ત પાણી) અને 10 μl HL-SAN એન્ઝાઇમ (ArticZymes P/N 70910-202) ઉમેરો. નમૂનાઓને પાઇપિંગ દ્વારા સારી રીતે મિશ્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને એપેન્ડોર્ફ™ થર્મોમિક્સર સી પર 800 આરપીએમ પર 30 મિનિટ માટે 37 °C પર ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા હતા. ઇન્ક્યુબેટ કર્યા પછી, 3 મિનિટ માટે 6000 RCF પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું અને 800 µl અને 1000 µl 1X PBS સાથે બે વાર ધોવામાં આવ્યું હતું. અંતે, પેલેટને 100 µl 1X PBS માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યું હતું.
ન્યૂ ઇંગ્લેન્ડ બાયોલેબ્સ મોનાર્ક જીનોમિક ડીએનએ પ્યુરિફિકેશન કીટ (ન્યૂ ઇંગ્લેન્ડ બાયોલેબ્સ, ઇપ્સવિચ, એમએ, કેટ# T3010L) નો ઉપયોગ કરીને કુલ બેક્ટેરિયલ ડીએનએને અલગ કરવામાં આવ્યું હતું. કીટ સાથે પૂરી પાડવામાં આવેલ પ્રમાણભૂત ઓપરેટિંગ પ્રક્રિયામાં થોડો ફેરફાર કરવામાં આવ્યો છે. અંતિમ ઉત્સર્જન માટે ઓપરેશન પહેલાં 60°C પર ન્યુક્લીઝ-મુક્ત પાણીને ઇન્ક્યુબેટ કરો અને જાળવો. દરેક નમૂનામાં 10 µl પ્રોટીનેઝ K અને 3 µl RNase A ઉમેરો. પછી 100 µl સેલ લિસિસ બફર ઉમેરો અને ધીમેધીમે મિક્સ કરો. ત્યારબાદ નમૂનાઓને એપેન્ડોર્ફ™ થર્મોમિક્સર સીમાં 56°C અને 1400 rpm પર ઓછામાં ઓછા 1 કલાક અને 3 કલાક સુધી ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા હતા. ઇન્ક્યુબેટેડ નમૂનાઓને 12,000 RCF પર 3 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા અને દરેક નમૂનામાંથી સુપરનેટન્ટને 400 µL બંધનકર્તા દ્રાવણ ધરાવતી અલગ 1.5 mL માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં ટ્રાન્સફર કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ ટ્યુબ્સને 1 સેકન્ડના અંતરાલ પર 5-10 સેકન્ડ માટે પલ્સ વર્ટેક્સ કરવામાં આવ્યા. દરેક નમૂનાના સમગ્ર પ્રવાહી સામગ્રી (આશરે 600-700 µL) ને ફ્લો-થ્રુ કલેક્શન ટ્યુબમાં મૂકવામાં આવેલા ફિલ્ટર કારતૂસમાં સ્થાનાંતરિત કરો. પ્રારંભિક DNA બંધન માટે ટ્યુબને 3 મિનિટ માટે 1,000 RCF પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા અને પછી શેષ પ્રવાહી દૂર કરવા માટે 1 મિનિટ માટે 12,000 RCF પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા. નમૂનાના સ્તંભને નવી કલેક્શન ટ્યુબમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા અને પછી બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા. પ્રથમ ધોવા માટે, દરેક ટ્યુબમાં 500 µL વોશ બફર ઉમેરો. ટ્યુબને 3-5 વખત ઉલટાવી દો અને પછી 1 મિનિટ માટે 12,000 RCF પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો. કલેક્શન ટ્યુબમાંથી પ્રવાહી કાઢી નાખો અને ફિલ્ટર કારતૂસને તે જ કલેક્શન ટ્યુબમાં પાછું મૂકો. બીજા ધોવા માટે, ઉલટાવ્યા વિના ફિલ્ટરમાં 500 µL વોશ બફર ઉમેરો. નમૂનાઓને 1 મિનિટ માટે 12,000 RCF પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા. ફિલ્ટરને 1.5 mL LoBind® ટ્યુબમાં સ્થાનાંતરિત કરો અને 100 µL પહેલાથી ગરમ કરેલ ન્યુક્લીઝ-મુક્ત પાણી ઉમેરો. ફિલ્ટર્સને ઓરડાના તાપમાને 1 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા અને પછી 1 મિનિટ માટે 12,000 RCF પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા. એલ્યુટેડ DNA -80°C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું હતું.
ક્યુબિટ™ 4.0 ફ્લોરોમીટરનો ઉપયોગ કરીને ડીએનએ સાંદ્રતાનું માપન કરવામાં આવ્યું. ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર ક્યુબિટ™ 1X dsDNA હાઇ સેન્સિટિવિટી કીટ (કેટ. નં. Q33231) નો ઉપયોગ કરીને ડીએનએ તૈયાર કરવામાં આવ્યું. એગ્લિએન્ટ™ 4150 અથવા 4200 ટેપસ્ટેશનનો ઉપયોગ કરીને ડીએનએ ટુકડાની લંબાઈનું વિતરણ માપવામાં આવ્યું. એજિલેન્ટ™ જીનોમિક ડીએનએ રીએજન્ટ્સ (કેટ. નં. 5067-5366) અને જીનોમિક ડીએનએ સ્ક્રીનટેપ (કેટ. નં. 5067-5365) નો ઉપયોગ કરીને ડીએનએ તૈયાર કરવામાં આવ્યું. ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર ઓક્સફોર્ડ નેનોપોર ટેક્નોલોજીસ™ (ONT) રેપિડ PCR બારકોડિંગ કીટ (SQK-RPB004) નો ઉપયોગ કરીને લાઇબ્રેરી તૈયારી કરવામાં આવી. Min106D ફ્લો સેલ (R 9.4.1) સાથે ONT GridION™ Mk1 સિક્વન્સરનો ઉપયોગ કરીને ડીએનએ સિક્વન્સ કરવામાં આવ્યું. સિક્વન્સિંગ સેટિંગ્સ આ પ્રમાણે હતી: ઉચ્ચ ચોકસાઈ બેઝ કોલિંગ, ન્યૂનતમ q મૂલ્ય 9, બારકોડ સેટઅપ અને બારકોડ ટ્રીમ. નમૂનાઓને 72 કલાક માટે ક્રમબદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા, ત્યારબાદ વધુ પ્રક્રિયા અને વિશ્લેષણ માટે બેઝ કોલ ડેટા સબમિટ કરવામાં આવ્યો હતો.
બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ પ્રોસેસિંગ અગાઉ વર્ણવેલ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું (ગ્રીનમેન એટ અલ., 2024). સિક્વન્સિંગમાંથી મેળવેલી FASTQ ફાઇલોને દરેક નમૂના માટે ડિરેક્ટરીઓમાં વિભાજિત કરવામાં આવી હતી. બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ વિશ્લેષણ પહેલાં, ડેટાને નીચેની પાઇપલાઇનનો ઉપયોગ કરીને પ્રક્રિયા કરવામાં આવતો હતો: પ્રથમ, નમૂનાઓની FASTQ ફાઇલોને એક જ FASTQ ફાઇલમાં મર્જ કરવામાં આવતી હતી. પછી, 1000 bp કરતા ઓછા વાંચનને Filtlong v. 0.2.1 નો ઉપયોગ કરીને ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યા હતા, જેમાં એકમાત્ર પરિમાણ -min_length 1000 (વિક, 2024) બદલાયો હતો. વધુ ફિલ્ટરિંગ પહેલાં, વાંચન ગુણવત્તાને નીચેના પરિમાણો સાથે NanoPlot v. 1.41.3 નો ઉપયોગ કરીને નિયંત્રિત કરવામાં આવી હતી: –fastq –plots dot –N50 -o(ડી કોસ્ટર અને રેડેમેકર્સ, 2023). નીચેના પરિમાણો સાથે હોસ્ટ-દૂષિત રીડ્સને દૂર કરવા માટે minimap2 v. 2.24-r1122 નો ઉપયોગ કરીને રીડ્સને માઉસ સંદર્ભ જીનોમ GRCm39 (GCF_000001635.27) સાથે ગોઠવવામાં આવ્યા હતા: -L -ax map-ont(લી, 2018). જનરેટ થયેલ ગોઠવણી ફાઇલોને samtools v. 1.16.1 માં samtools view -b (Danecek et al., 2021) નો ઉપયોગ કરીને BAM ફોર્મેટમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવી હતી. પછી samtools view -b -f 4 નો ઉપયોગ કરીને અનએલાઈન કરેલ રીડ્સ ઓળખવામાં આવ્યા હતા, જે દર્શાવે છે કે આ રીડ્સ હોસ્ટ જીનોમ સાથે સંબંધિત નથી. ડિફોલ્ટ પરિમાણો સાથે samtools bam2fq નો ઉપયોગ કરીને અનએલાઈન કરેલ રીડ્સને FASTQ ફોર્મેટમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા. અગાઉ વર્ણવેલ સેટિંગ્સનો ઉપયોગ કરીને વધુ ફિલ્ટર કરેલ રીડ્સ પર નેનોપ્લોટ ફરીથી ચલાવવામાં આવ્યો હતો. ફિલ્ટરિંગ પછી, મેટાજેનોમિક ડેટા નીચેના પરિમાણો સાથે મેટાફ્લાય v. 2.8.2-b1689 નો ઉપયોગ કરીને એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યો હતો: –nano-raw–meta (કોલ્મોગોરોવ એટ અલ., 2020). બાકીના પરિમાણોને તેમના ડિફોલ્ટ મૂલ્યો પર છોડી દો. એસેમ્બલી પછી, ફિલ્ટર કરેલ રીડ્સને minimap2 નો ઉપયોગ કરીને એસેમ્બલીમાં મેપ કરવામાં આવ્યા હતા, અને -ax map-ont પેરામીટરનો ઉપયોગ SAM ફોર્મેટમાં એલાઇનમેન્ટ ફાઇલ જનરેટ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. એસેમ્બલીને પહેલા નીચેના પરિમાણો સાથે racon v. 1.4.20 નો ઉપયોગ કરીને રિફાઇન કરવામાં આવી હતી: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser et al., 2017). racon પૂર્ણ થયા પછી, તેને medaka v. 1.7.2 સાથે વધુ રિફાઇન કરવામાં આવ્યું હતું, medaka_consesus નો ઉપયોગ કરીને, -m પેરામીટર સિવાયના બધા પરિમાણો તેમના ડિફોલ્ટ મૂલ્યો પર બાકી રહ્યા હતા. -m પેરામીટર r941_min_hac_g507 પર સેટ કરેલ છે જેથી અમારા ડેટા (nanoporetech/medaka, 2024) માટે ઉપયોગમાં લેવાતા ફ્લો સેલ રસાયણશાસ્ત્ર અને ઉચ્ચ-ચોકસાઈ બેઝ કોલિંગનો ઉલ્લેખ કરી શકાય. ફિલ્ટર કરેલ ડેટા (ત્યારબાદ માઇક્રોબાયલ ડેટા તરીકે ઓળખવામાં આવશે) અને અંતિમ સાફ કરેલ એસેમ્બલીનો ઉપયોગ અનુગામી વિશ્લેષણ માટે કરવામાં આવ્યો હતો.
વર્ગીકરણ વર્ગીકરણ માટે, રીડ્સ અને એસેમ્બલ કોન્ટિગ્સને ક્રેકેન2 આવૃત્તિ 2.1.2 (વુડ એટ અલ., 2019) નો ઉપયોગ કરીને વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યા હતા. રીડ્સ અને એસેમ્બલી માટે અનુક્રમે રિપોર્ટ્સ અને આઉટપુટ ફાઇલો જનરેટ કરો. રીડ્સ અને એસેમ્બલીનું વિશ્લેષણ કરવા માટે -ઉપયોગ-નામો વિકલ્પનો ઉપયોગ કરો. રીડ સેગમેન્ટ્સ માટે -gzip-સંકુચિત અને -જોડી વિકલ્પો ઉલ્લેખિત છે. બ્રેકન આવૃત્તિ 2.8 (લુ એટ અલ., 2017) નો ઉપયોગ કરીને મેટાજેનોમ્સમાં ટેક્સાની સંબંધિત વિપુલતાનો અંદાજ કાઢવામાં આવ્યો હતો. અમે સૌપ્રથમ નીચેના પરિમાણો સાથે બ્રેકન-બિલ્ડનો ઉપયોગ કરીને 1000 બેઝ ધરાવતો kmer ડેટાબેઝ બનાવ્યો: -d-k 35 -l 1000 એકવાર બની ગયા પછી, બ્રેકન kraken2 દ્વારા જનરેટ કરાયેલ રિપોર્ટના આધારે ચાલે છે અને નીચેના વિકલ્પોનો ઉપયોગ કરીને ડેટા ફિલ્ટર કરે છે: -d -I -O-પૃષ્ઠ ૧૦૦૦ -લ

તેમાંથી, વિશ્લેષણ કરવામાં આવતા વર્ગીકરણ સ્તરના આધારે P, G અથવા S પસંદ કરવામાં આવે છે. ખોટા હકારાત્મક વર્ગીકરણની અસર ઘટાડવા માટે, 1e-4 (1/10,000 વાંચન) ની ન્યૂનતમ સંબંધિત વિપુલતા થ્રેશોલ્ડ અપનાવવામાં આવી હતી. આંકડાકીય વિશ્લેષણ પહેલાં, બ્રેકન (fraction_total_reads) દ્વારા નોંધાયેલ સંબંધિત વિપુલતાઓને કેન્દ્રિત લોગ-રેશિયો (CLR) રૂપાંતર (Aitchison, 1982) નો ઉપયોગ કરીને રૂપાંતરિત કરવામાં આવી હતી. ડેટા પરિવર્તન માટે CLR પદ્ધતિ પસંદ કરવામાં આવી હતી કારણ કે તે સ્કેલ-અપરિવર્તનશીલ છે અને બિન-છૂટક ડેટાસેટ્સ માટે પૂરતી છે (Gloor et al., 2017). CLR પરિવર્તન કુદરતી લઘુગણકનો ઉપયોગ કરે છે. બ્રેકન દ્વારા નોંધાયેલ ગણતરી ડેટાને સંબંધિત લોગ અભિવ્યક્તિ (RLE) (Anders and Huber, 2010) નો ઉપયોગ કરીને સામાન્ય બનાવવામાં આવ્યો હતો. matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 અને ક્રમિક લઘુગણક (Gloor et al., 2017) ના સંયોજનનો ઉપયોગ કરીને આંકડાઓ જનરેટ કરવામાં આવ્યા હતા. 0.12.2 અને stantanotations v. 0.5.0 (હન્ટર, 2007; વાસ્કોમ, 2021; ચાર્લીયર એટ અલ., 2022). દરેક નમૂના માટે સામાન્યકૃત બેક્ટેરિયલ ગણતરીઓનો ઉપયોગ કરીને બેસિલસ/બેક્ટેરોઇડેટ્સ ગુણોત્તરની ગણતરી કરવામાં આવી હતી. કોષ્ટકોમાં નોંધાયેલા મૂલ્યો 4 દશાંશ સ્થાનો સુધી ગોળાકાર છે. સિમ્પસન વિવિધતા સૂચકાંકની ગણતરી KrakenTools v. 1.2 પેકેજ (Lu et al., 2022) માં પ્રદાન કરેલ alpha_diversity.py સ્ક્રિપ્ટનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી. બ્રેકન રિપોર્ટ સ્ક્રિપ્ટમાં પ્રદાન કરવામાં આવ્યો છે અને -an પરિમાણ માટે સિમ્પસન અનુક્રમણિકા "Si" પ્રદાન કરવામાં આવી છે. વિપુલતામાં નોંધપાત્ર તફાવતોને સરેરાશ CLR તફાવતો ≥ 1 અથવા ≤ -1 તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવ્યા હતા. ±1 નો સરેરાશ CLR તફાવત નમૂના પ્રકારની વિપુલતામાં 2.7 ગણો વધારો સૂચવે છે. ચિહ્ન (+/-) સૂચવે છે કે શું ટેક્સન અનુક્રમે PPA નમૂના અને નિયંત્રણ નમૂનામાં વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં છે. માન-વ્હીટની યુ ટેસ્ટ (વિર્ટાનેન એટ અલ., 2020) નો ઉપયોગ કરીને મહત્વ નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું. સ્ટેટ્સમોડેલ્સ વિ. 0.14 (બેન્જામિન અને હોચબર્ગ, 1995; સીબોલ્ડ અને પર્કટોલ્ડ, 2010) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, અને બહુવિધ પરીક્ષણ માટે સુધારણા માટે બેન્જામિન-હોચબર્ગ પ્રક્રિયા લાગુ કરવામાં આવી હતી. આંકડાકીય મહત્વ નક્કી કરવા માટે થ્રેશોલ્ડ તરીકે સમાયોજિત p-મૂલ્ય ≤ 0.05 નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.
જનીન એનોટેશન અને સંબંધિત વિપુલતાનો અંદાજ મારંગા એટ અલ. (મારંગા એટ અલ., 2023) દ્વારા વર્ણવેલ પ્રોટોકોલના સંશોધિત સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યો હતો. સૌપ્રથમ, SeqKit v. 2.5.1 (શેન એટ અલ., 2016) નો ઉપયોગ કરીને તમામ એસેમ્બલીઓમાંથી 500 bp કરતા ઓછા કોન્ટિગ દૂર કરવામાં આવ્યા હતા. પછી પસંદ કરેલા એસેમ્બલીઓને પેન-મેટાજેનોમમાં જોડવામાં આવ્યા હતા. નીચેના પરિમાણો સાથે પ્રોડિગલ v. 1.0.1 (પ્રોડિગલ v. 2.6.3 નું સમાંતર સંસ્કરણ) નો ઉપયોગ કરીને ઓપન રીડિંગ ફ્રેમ્સ (ORFs) ઓળખવામાં આવ્યા હતા: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024). પરિણામી ન્યુક્લિયોટાઇડ ફાઇલોને પછી બધા અપૂર્ણ જનીનોને દૂર કરવા માટે Python નો ઉપયોગ કરીને ફિલ્ટર કરવામાં આવી હતી. ત્યારબાદ CD-HIT v. 4.8.1 નો ઉપયોગ નીચેના પરિમાણો સાથે જનીનોને ક્લસ્ટર કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો: cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu et al., 2012). જનીન વિપુલતા અને ટીકાનો અંદાજ કાઢવા માટે જનરેટ થયેલ બિન-રિડન્ડન્ટ જનીન સૂચિનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. KMA v. 1.4.9 (Clausen et al., 2018) નો ઉપયોગ કરીને સંબંધિત જનીન વિપુલતાનો અંદાજ કાઢવામાં આવ્યો હતો. પ્રથમ, નીચેના પરિમાણો સાથે KMA ઇન્ડેક્સનો ઉપયોગ કરીને એક ઇન્ડેક્સ ફાઇલ બનાવો: -i -Oપછી, બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ પાઇપલાઇન વિભાગમાં વર્ણવ્યા મુજબ દરેક નમૂના માટે માઇક્રોબાયલ રીડ સાથે જનરેટ થયેલ ઇન્ડેક્સનો ઉપયોગ કરીને, KMA નીચેના પરિમાણો સાથે ચલાવવામાં આવ્યું: -i -O-ટી_ડીબી-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. પછી, CLR નો ઉપયોગ કરીને જનીન ગણતરીઓને સામાન્ય બનાવવામાં આવી, અને સાય-કિટ લર્નના મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ (PCA) વર્ગનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો (Pedregosa et al., 2011). eggNOG v. 2.1.12 અને eggNOG ડેટાબેઝ સંસ્કરણ 5.0.2 ની emapper.py સ્ક્રિપ્ટનો ઉપયોગ કરીને નોન-રિડન્ડન્ટ જનીન કેટલોગ પર અનુમાનિત જનીન એનોટેશન નીચેના પરિમાણો સાથે કરવામાં આવ્યું: –itype CDS –cpu 24 -i- ડેટા કેટલોગ–go_evidence નોન-ઇલેક્ટ્રોનિક – આઉટપુટ- આઉટપુટ ડિરેક્ટરી–ટાર્ગેટ_ઓર્થોલોગ્સ બધા –સીડ_ઓર્થોલોગ_વેલ્યુ 0.001 –સીડ_ઓર્થોલોગ_સ્કોર 60 –ક્વેરી_કવર 20 –વિષય_કવર 0 –અનુવાદ –ઓવરરાઇડ –ટેમ્પ_ડાયર(Cantalapiedra et al., 2021). KMA પરિણામોની તપાસ પર્યાપ્ત ટેમ્પ્લેટ કવરેજ અને ટેમ્પ્લેટ ઓળખ (≥ 90%) અને વિપુલતા (ઊંડાઈ ≥ 3) ધરાવતા જનીનો પસંદ કરવા માટે કરવામાં આવી હતી. ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ CLR નો ઉપયોગ કરીને KMA ઊંડાઈ પરિણામોને રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ KMA પરિણામોની સરખામણી દરેક જનીન માટે કોન્ટિગ સ્ત્રોતનો ઉપયોગ કરીને કાર્યાત્મક એનોટેશન અને વર્ગીકરણ પરિણામોમાંથી કોન્ટિગ ID સાથે કરવામાં આવી હતી. ટેક્સાની જેમ, જનીન વિપુલતામાં નોંધપાત્ર તફાવતોને સરેરાશ CLR તફાવત ≥ 1 અથવા ≤ -1 ધરાવતા જનીનો તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવ્યા હતા, જેમાં એક ચિહ્ન (+/-) હતું જે દર્શાવે છે કે જનીન અનુક્રમે PPA અથવા નિયંત્રણ નમૂનાઓમાં વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં હતું.
જનીન પાથવે વિપુલતાની તુલના કરવા માટે eggNOG દ્વારા સોંપાયેલ ક્યોટો એનસાયક્લોપીડિયા ઓફ જીન્સ એન્ડ જીનોમ્સ (KEGG) ઓર્થોલોગ (KO) ઓળખકર્તાઓ અનુસાર જનીનોનું પ્રથમ જૂથ બનાવવામાં આવ્યું હતું. વિશ્લેષણ પહેલાં નોકઆઉટ વિનાના જનીનો અથવા બહુવિધ નોકઆઉટ ધરાવતા જનીનો દૂર કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ નમૂના દીઠ દરેક KO ની સરેરાશ વિપુલતાની ગણતરી કરવામાં આવી હતી અને આંકડાકીય વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. PPA મેટાબોલિઝમ જનીનોને કોઈપણ જનીન તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવ્યા હતા જેને KEGG_Pathway સ્તંભમાં ko00640 પંક્તિ સોંપવામાં આવી હતી, જે KEGG અનુસાર પ્રોપિયોનેટ ચયાપચયમાં ભૂમિકા સૂચવે છે. PPA ઉત્પાદન સાથે સંકળાયેલા તરીકે ઓળખાતા જનીનો પૂરક કોષ્ટક 1 (રીચાર્ડટ એટ અલ., 2014; યાંગ એટ અલ., 2017) માં સૂચિબદ્ધ છે. દરેક નમૂના પ્રકારમાં નોંધપાત્ર રીતે વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં રહેલા PPA મેટાબોલિઝમ અને ઉત્પાદન જનીનોને ઓળખવા માટે ક્રમચય પરીક્ષણો કરવામાં આવ્યા હતા. વિશ્લેષણ કરાયેલ દરેક જનીન માટે એક હજાર ક્રમચય કરવામાં આવ્યા હતા. આંકડાકીય મહત્વ નક્કી કરવા માટે કટઓફ તરીકે 0.05 નું p-મૂલ્ય ઉપયોગમાં લેવાયું હતું. ક્લસ્ટરની અંદર પ્રતિનિધિ જનીનોના એનોટેશનના આધારે ક્લસ્ટરની અંદર વ્યક્તિગત જનીનોને કાર્યાત્મક એનોટેશન સોંપવામાં આવ્યા હતા. PPA ચયાપચય અને/અથવા PPA ઉત્પાદન સાથે સંકળાયેલ ટેક્સાને ક્રેકેન2 આઉટપુટ ફાઇલોમાં કોન્ટિગ ID ને eggNOG નો ઉપયોગ કરીને કાર્યાત્મક એનોટેશન દરમિયાન જાળવી રાખવામાં આવેલા સમાન કોન્ટિગ ID સાથે મેચ કરીને ઓળખી શકાય છે. અગાઉ વર્ણવેલ માન-વ્હીટની U પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને મહત્વ પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું. બેન્જામિન-હોચબર્ગ પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરીને બહુવિધ પરીક્ષણ માટે સુધારો કરવામાં આવ્યો હતો. આંકડાકીય મહત્વ નક્કી કરવા માટે કટઓફ તરીકે ≤ 0.05 નું p-મૂલ્ય ઉપયોગમાં લેવાયું હતું.
સિમ્પસન ડાયવર્સિટી ઇન્ડેક્સનો ઉપયોગ કરીને ઉંદરોના આંતરડાના માઇક્રોબાયોમની વિવિધતાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું. જીનસ અને પ્રજાતિ વિવિધતાના સંદર્ભમાં નિયંત્રણ અને PPA નમૂનાઓ વચ્ચે કોઈ નોંધપાત્ર તફાવત જોવા મળ્યો ન હતો (જીનસ માટે p-મૂલ્ય: 0.18, પ્રજાતિઓ માટે p-મૂલ્ય: 0.16) (આકૃતિ 1). ત્યારબાદ મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ (PCA) નો ઉપયોગ કરીને માઇક્રોબાયલ રચનાની તુલના કરવામાં આવી હતી. આકૃતિ 2 તેમના ફાયલા દ્વારા નમૂનાઓનું ક્લસ્ટરિંગ દર્શાવે છે, જે દર્શાવે છે કે PPA અને નિયંત્રણ નમૂનાઓ વચ્ચે માઇક્રોબાયોમ્સની પ્રજાતિ રચનામાં તફાવત હતો. આ ક્લસ્ટરિંગ જીનસ સ્તરે ઓછું સ્પષ્ટ હતું, જે સૂચવે છે કે PPA ચોક્કસ બેક્ટેરિયાને અસર કરે છે (પૂરક આકૃતિ 1).
આકૃતિ 1. ઉંદરના આંતરડાના માઇક્રોબાયોમની જાતિ અને પ્રજાતિઓની રચનાની આલ્ફા વિવિધતા. PPA અને નિયંત્રણ નમૂનાઓમાં જાતિ (A) અને પ્રજાતિઓ (B) ના સિમ્પસન વિવિધતા સૂચકાંકો દર્શાવતા બોક્સ પ્લોટ. માન-વ્હીટની U પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને મહત્વ નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું, અને બેન્જામિની-હોચબર્ગ પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરીને બહુવિધ સુધારા કરવામાં આવ્યા હતા. ns, p-મૂલ્ય નોંધપાત્ર ન હતું (p>0.05).
આકૃતિ 2. પ્રજાતિ સ્તરે ઉંદરના આંતરડાના માઇક્રોબાયોમ રચનાના મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણના પરિણામો. મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ પ્લોટ તેમના પ્રથમ બે મુખ્ય ઘટકોમાં નમૂનાઓનું વિતરણ દર્શાવે છે. રંગો નમૂના પ્રકાર સૂચવે છે: PPA-ખુલ્લા ઉંદર જાંબલી છે અને નિયંત્રણ ઉંદર પીળા છે. મુખ્ય ઘટકો 1 અને 2 અનુક્રમે x-અક્ષ અને y-અક્ષ પર પ્લોટ કરવામાં આવ્યા છે, અને તેમના સમજાવેલ ભિન્નતા ગુણોત્તર તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવ્યા છે.
RLE રૂપાંતરિત ગણતરી ડેટાનો ઉપયોગ કરીને, નિયંત્રણ અને PPA ઉંદરોમાં મધ્ય બેક્ટેરોઇડેટ્સ/બેસિલી ગુણોત્તરમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો જોવા મળ્યો (નિયંત્રણ: 9.66, PPA: 3.02; p-મૂલ્ય = 0.0011). આ તફાવત નિયંત્રણોની તુલનામાં PPA ઉંદરોમાં બેક્ટેરોઇડેટ્સનું પ્રમાણ વધુ હોવાને કારણે હતો, જોકે તફાવત નોંધપાત્ર ન હતો (નિયંત્રણ સરેરાશ CLR: 5.51, PPA સરેરાશ CLR: 6.62; p-મૂલ્ય = 0.054), જ્યારે બેક્ટેરોઇડેટ્સનું પ્રમાણ સમાન હતું (નિયંત્રણ સરેરાશ CLR: 7.76, PPA સરેરાશ CLR: 7.60; p-મૂલ્ય = 0.18).
ગટ માઇક્રોબાયોમના વર્ગીકરણ સભ્યોની વિપુલતાના વિશ્લેષણથી જાણવા મળ્યું કે 1 ફિલમ અને 77 પ્રજાતિઓ PPA અને નિયંત્રણ નમૂનાઓ વચ્ચે નોંધપાત્ર રીતે અલગ હતી (પૂરક કોષ્ટક 2). PPA નમૂનાઓમાં 59 પ્રજાતિઓની વિપુલતા નિયંત્રણ નમૂનાઓ કરતા નોંધપાત્ર રીતે વધારે હતી, જ્યારે નિયંત્રણ નમૂનાઓમાં ફક્ત 16 પ્રજાતિઓની વિપુલતા PPA નમૂનાઓ કરતા વધારે હતી (આકૃતિ 3).
આકૃતિ 3. PPA અને નિયંત્રણ ઉંદરોના આંતરડાના માઇક્રોબાયોમમાં ટેક્સાની વિભેદક વિપુલતા. જ્વાળામુખીના પ્લોટ PPA અને નિયંત્રણ નમૂનાઓ વચ્ચે જાતિ (A) અથવા પ્રજાતિ (B) ની વિપુલતામાં તફાવત દર્શાવે છે. ગ્રે બિંદુઓ ટેક્સાની વિપુલતામાં કોઈ નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે. રંગીન બિંદુઓ વિપુલતામાં નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે (p-મૂલ્ય ≤ 0.05). નમૂના પ્રકારો વચ્ચે વિપુલતામાં સૌથી મોટો તફાવત ધરાવતા ટોચના 20 ટેક્સા અનુક્રમે લાલ અને આછા વાદળી (નિયંત્રણ અને PPA નમૂનાઓ) માં દર્શાવવામાં આવ્યા છે. પીળા અને જાંબલી બિંદુઓ નિયંત્રણો કરતાં નિયંત્રણ અથવા PPA નમૂનાઓમાં ઓછામાં ઓછા 2.7 ગણા વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં હતા. કાળા બિંદુઓ નોંધપાત્ર રીતે અલગ વિપુલતાવાળા ટેક્સાનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, જેમાં સરેરાશ CLR તફાવત -1 અને 1 વચ્ચે હોય છે. P મૂલ્યોની ગણતરી માન-વ્હીટની U પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી અને બેન્જામિની-હોચબર્ગ પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરીને બહુવિધ પરીક્ષણ માટે સુધારેલ હતી. બોલ્ડ સરેરાશ CLR તફાવતો વિપુલતામાં નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે.
આંતરડાના માઇક્રોબાયલ રચનાનું વિશ્લેષણ કર્યા પછી, અમે માઇક્રોબાયોમનું કાર્યાત્મક એનોટેશન કર્યું. ઓછી ગુણવત્તાવાળા જનીનોને ફિલ્ટર કર્યા પછી, બધા નમૂનાઓમાં કુલ 378,355 અનન્ય જનીનો ઓળખાયા. આ જનીનોની રૂપાંતરિત વિપુલતાનો ઉપયોગ મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ (PCA) માટે કરવામાં આવ્યો હતો, અને પરિણામોએ તેમના કાર્યાત્મક પ્રોફાઇલ્સ (આકૃતિ 4) ના આધારે નમૂના પ્રકારોનું ઉચ્ચ સ્તરનું ક્લસ્ટરિંગ દર્શાવ્યું હતું.
આકૃતિ 4. માઉસ ગટ માઇક્રોબાયોમના કાર્યાત્મક પ્રોફાઇલનો ઉપયોગ કરીને PCA પરિણામો. PCA પ્લોટ તેમના પ્રથમ બે મુખ્ય ઘટકોમાં નમૂનાઓનું વિતરણ દર્શાવે છે. રંગો નમૂના પ્રકાર સૂચવે છે: PPA-ખુલ્લા ઉંદર જાંબલી છે અને નિયંત્રણ ઉંદર પીળા છે. મુખ્ય ઘટકો 1 અને 2 અનુક્રમે x-અક્ષ અને y-અક્ષ પર પ્લોટ કરવામાં આવ્યા છે, અને તેમના સમજાવેલ ભિન્નતા ગુણોત્તર તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવ્યા છે.
આગળ અમે વિવિધ નમૂના પ્રકારોમાં KEGG નોકઆઉટ્સની વિપુલતાની તપાસ કરી. કુલ 3648 અનન્ય નોકઆઉટ ઓળખાયા, જેમાંથી 196 નિયંત્રણ નમૂનાઓમાં નોંધપાત્ર રીતે વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં હતા અને 106 PPA નમૂનાઓમાં વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં હતા (આકૃતિ 5). નિયંત્રણ નમૂનાઓમાં કુલ 145 જનીનો અને PPA નમૂનાઓમાં 61 જનીનો શોધી કાઢવામાં આવ્યા, જેમાં નોંધપાત્ર રીતે અલગ વિપુલતા હતી. લિપિડ અને એમિનોસુગર ચયાપચય સંબંધિત માર્ગો PPA નમૂનાઓમાં નોંધપાત્ર રીતે વધુ સમૃદ્ધ હતા (પૂરક કોષ્ટક 3). નાઇટ્રોજન ચયાપચય અને સલ્ફર રિલે સિસ્ટમ્સ સાથે સંબંધિત માર્ગો નિયંત્રણ નમૂનાઓમાં નોંધપાત્ર રીતે વધુ સમૃદ્ધ હતા (પૂરક કોષ્ટક 3). PPA નમૂનાઓમાં એમિનોસુગર/ન્યુક્લિયોટાઇડ ચયાપચય (ko:K21279) અને ઇનોસિટોલ ફોસ્ફેટ ચયાપચય (ko:K07291) સંબંધિત જનીનોની વિપુલતા નોંધપાત્ર રીતે વધુ હતી (આકૃતિ 5). નિયંત્રણ નમૂનાઓમાં બેન્ઝોએટ ચયાપચય (ko:K22270), નાઇટ્રોજન ચયાપચય (ko:K00368), અને ગ્લાયકોલિસિસ/ગ્લુકોનિયોજેનેસિસ (ko:K00131) (આકૃતિ 5) સંબંધિત નોંધપાત્ર રીતે વધુ જનીનો હતા.
આકૃતિ 5. PPA અને નિયંત્રણ ઉંદરોના આંતરડાના માઇક્રોબાયોમમાં KOs ની વિભેદક વિપુલતા. જ્વાળામુખી પ્લોટ કાર્યાત્મક જૂથો (KOs) ની વિપુલતામાં તફાવત દર્શાવે છે. ગ્રે બિંદુઓ એવા KOs દર્શાવે છે જેમની વિપુલતા નમૂના પ્રકારો (p-મૂલ્ય > 0.05) વચ્ચે નોંધપાત્ર રીતે અલગ ન હતી. રંગીન બિંદુઓ વિપુલતામાં નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે (p-મૂલ્ય ≤ 0.05). નમૂના પ્રકારો વચ્ચે વિપુલતામાં સૌથી મોટા તફાવત ધરાવતા 20 KOs અનુક્રમે લાલ અને આછા વાદળી રંગમાં દર્શાવવામાં આવ્યા છે, જે નિયંત્રણ અને PPA નમૂનાઓને અનુરૂપ છે. પીળા અને જાંબલી બિંદુઓ એવા KOs દર્શાવે છે જે નિયંત્રણ અને PPA નમૂનાઓમાં અનુક્રમે ઓછામાં ઓછા 2.7 ગણા વધુ વિપુલ હતા. કાળા બિંદુઓ નોંધપાત્ર રીતે અલગ વિપુલતા ધરાવતા KOs દર્શાવે છે, જેમાં -1 અને 1 વચ્ચે સરેરાશ CLR તફાવત છે. P મૂલ્યોની ગણતરી માન-વ્હીટની U પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી અને બેન્જામિની-હોચબર્ગ પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરીને બહુવિધ સરખામણીઓ માટે ગોઠવવામાં આવી હતી. NaN સૂચવે છે કે KO KEGG માં કોઈ માર્ગ સાથે સંબંધિત નથી. બોલ્ડ સરેરાશ CLR તફાવત મૂલ્યો વિપુલતામાં નોંધપાત્ર તફાવત સૂચવે છે. સૂચિબદ્ધ KO કયા માર્ગો સાથે સંબંધિત છે તેની વિગતવાર માહિતી માટે, પૂરક કોષ્ટક 3 જુઓ.
ટીકા કરાયેલા જનીનોમાં, ૧૬૦૧ જનીનોમાં નમૂના પ્રકારો (p ≤ ૦.૦૫) વચ્ચે નોંધપાત્ર રીતે અલગ વિપુલતા હતી, જેમાં દરેક જનીન ઓછામાં ઓછા ૨.૭ ગણું વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં હતું. આ જનીનોમાંથી, નિયંત્રણ નમૂનાઓમાં ૪ જનીનો વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં હતા અને PPA નમૂનાઓમાં ૧૫૯૭ જનીનો વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં હતા. કારણ કે PPA માં એન્ટિમાઇક્રોબાયલ ગુણધર્મો છે, અમે નમૂના પ્રકારો વચ્ચે PPA ચયાપચય અને ઉત્પાદન જનીનોની વિપુલતાની તપાસ કરી. ૧૩૩૨ PPA ચયાપચય-સંબંધિત જનીનોમાં, નિયંત્રણ નમૂનાઓમાં ૨૭ જનીનો નોંધપાત્ર રીતે વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં હતા અને PPA નમૂનાઓમાં ૧૨ જનીનો વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં હતા. ૨૨૩ PPA ઉત્પાદન-સંબંધિત જનીનોમાં, ૧ જનીન PPA નમૂનાઓમાં નોંધપાત્ર રીતે વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં હતું. આકૃતિ ૬એ PPA ચયાપચયમાં સામેલ જનીનોની ઉચ્ચ વિપુલતા દર્શાવે છે, નિયંત્રણ નમૂનાઓમાં નોંધપાત્ર રીતે વધુ વિપુલતા અને મોટા અસર કદ સાથે, જ્યારે આકૃતિ ૬બી PPA નમૂનાઓમાં નોંધપાત્ર રીતે વધુ વિપુલતા ધરાવતા વ્યક્તિગત જનીનોને પ્રકાશિત કરે છે.
આકૃતિ 6. ઉંદરના આંતરડાના માઇક્રોબાયોમમાં PPA-સંબંધિત જનીનોની વિભેદક વિપુલતા. જ્વાળામુખીના પ્લોટ PPA ચયાપચય (A) અને PPA ઉત્પાદન (B) સાથે સંકળાયેલા જનીનોની વિપુલતામાં તફાવત દર્શાવે છે. ગ્રે બિંદુઓ એવા જનીનો સૂચવે છે જેમની વિપુલતા નમૂના પ્રકારો (p-મૂલ્ય > 0.05) વચ્ચે નોંધપાત્ર રીતે અલગ ન હતી. રંગીન બિંદુઓ વિપુલતામાં નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે (p-મૂલ્ય ≤ 0.05). વિપુલતામાં સૌથી મોટા તફાવત ધરાવતા 20 જનીનો અનુક્રમે લાલ અને આછા વાદળી (નિયંત્રણ અને PPA નમૂનાઓ) માં દર્શાવવામાં આવ્યા છે. પીળા અને જાંબલી બિંદુઓની વિપુલતા નિયંત્રણ નમૂનાઓ કરતાં નિયંત્રણ અને PPA નમૂનાઓમાં ઓછામાં ઓછી 2.7 ગણી વધારે હતી. કાળા બિંદુઓ નોંધપાત્ર રીતે અલગ વિપુલતા ધરાવતા જનીનોનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, જેમાં સરેરાશ CLR તફાવત -1 અને 1 વચ્ચે હોય છે. P મૂલ્યોની ગણતરી માન-વ્હીટની U પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી અને બેન્જામિની-હોચબર્ગ પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરીને બહુવિધ સરખામણીઓ માટે સુધારેલ છે. જનીનો બિન-રિડન્ડન્ટ જનીન સૂચિમાં પ્રતિનિધિ જનીનોને અનુરૂપ છે. જનીન નામોમાં KO જનીન દર્શાવતું KEGG પ્રતીક હોય છે. બોલ્ડ સરેરાશ CLR તફાવતો નોંધપાત્ર રીતે અલગ વિપુલતા દર્શાવે છે. ડેશ (-) સૂચવે છે કે KEGG ડેટાબેઝમાં જનીન માટે કોઈ પ્રતીક નથી.
પીપીએ ચયાપચય અને/અથવા ઉત્પાદન સાથે સંબંધિત જનીનો ધરાવતા ટેક્સાને જનીનના કોન્ટિગ ID સાથે કોન્ટિગ્સની વર્ગીકરણ ઓળખ સાથે મેચ કરીને ઓળખવામાં આવ્યા હતા. જીનસ સ્તરે, 130 જાતિઓમાં પીપીએ ચયાપચય સાથે સંબંધિત જનીનો જોવા મળ્યા અને 61 જાતિઓમાં પીપીએ ઉત્પાદન સાથે સંબંધિત જનીનો જોવા મળ્યા (પૂરક કોષ્ટક 4). જોકે, કોઈ પણ જાતિમાં વિપુલતામાં નોંધપાત્ર તફાવત જોવા મળ્યો નથી (p > 0.05).
પ્રજાતિ સ્તરે, ૧૪૪ બેક્ટેરિયાની પ્રજાતિઓમાં PPA ચયાપચય સાથે સંકળાયેલા જનીનો જોવા મળ્યા અને ૬૮ બેક્ટેરિયાની પ્રજાતિઓમાં PPA ઉત્પાદન સાથે સંકળાયેલા જનીનો જોવા મળ્યા (પૂરક કોષ્ટક ૫). PPA ચયાપચયકર્તાઓમાં, આઠ બેક્ટેરિયાએ નમૂના પ્રકારો વચ્ચે વિપુલ પ્રમાણમાં નોંધપાત્ર વધારો દર્શાવ્યો, અને બધાએ અસરમાં નોંધપાત્ર ફેરફારો દર્શાવ્યા (પૂરક કોષ્ટક ૬). વિપુલ પ્રમાણમાં નોંધપાત્ર તફાવત ધરાવતા બધા ઓળખાયેલા PPA ચયાપચયકર્તાઓ PPA નમૂનાઓમાં વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં હતા. પ્રજાતિ-સ્તરના વર્ગીકરણમાં એવા જનરાના પ્રતિનિધિઓ જાહેર થયા જે નમૂના પ્રકારો વચ્ચે નોંધપાત્ર રીતે અલગ નહોતા, જેમાં ઘણી બેક્ટેરોઇડ્સ અને રુમિનોકોકસ પ્રજાતિઓ, તેમજ ડંકનિયા ડુબોઇસ, માયક્સોબેક્ટેરિયમ એન્ટરિકા, મોનોકોકસ પેક્ટીનોલિટીકસ અને અલ્કેલિજેન્સ પોલીમોર્ફાનો સમાવેશ થાય છે. PPA-ઉત્પાદક બેક્ટેરિયામાં, ચાર બેક્ટેરિયાએ નમૂના પ્રકારો વચ્ચે વિપુલ પ્રમાણમાં નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવ્યો. વિપુલ પ્રમાણમાં નોંધપાત્ર તફાવત ધરાવતી પ્રજાતિઓમાં બેક્ટેરોઇડ્સ નોવોરોસી, ડંકનિયા ડુબોઇસ, માયક્સોબેક્ટેરિયમ એન્ટરિટિડિસ અને રુમિનોકોકસ બોવિસનો સમાવેશ થાય છે.
આ અભ્યાસમાં, અમે ઉંદરોના આંતરડાના માઇક્રોબાયોટા પર PPA ના સંપર્કની અસરોની તપાસ કરી. PPA બેક્ટેરિયામાં વિવિધ પ્રતિભાવો ઉત્પન્ન કરી શકે છે કારણ કે તે ચોક્કસ પ્રજાતિઓ દ્વારા ઉત્પન્ન થાય છે, અન્ય પ્રજાતિઓ દ્વારા ખોરાક સ્ત્રોત તરીકે ઉપયોગમાં લેવાય છે, અથવા એન્ટિમાઇક્રોબાયલ અસરો ધરાવે છે. તેથી, આહાર પૂરવણી દ્વારા આંતરડાના વાતાવરણમાં તેનો ઉમેરો સહનશીલતા, સંવેદનશીલતા અને પોષક સ્ત્રોત તરીકે તેનો ઉપયોગ કરવાની ક્ષમતાના આધારે અલગ અલગ અસરો કરી શકે છે. સંવેદનશીલ બેક્ટેરિયલ પ્રજાતિઓને દૂર કરી શકાય છે અને તે પ્રજાતિઓ દ્વારા બદલી શકાય છે જે PPA પ્રત્યે વધુ પ્રતિરોધક છે અથવા તેનો ખોરાક સ્ત્રોત તરીકે ઉપયોગ કરી શકે છે, જેના કારણે આંતરડાના માઇક્રોબાયોટાની રચનામાં ફેરફાર થાય છે. અમારા પરિણામોએ માઇક્રોબાયોટાની રચનામાં નોંધપાત્ર તફાવતો જાહેર કર્યા પરંતુ એકંદર માઇક્રોબાયોટા વિવિધતા પર કોઈ અસર થઈ નહીં. સૌથી મોટી અસરો પ્રજાતિ સ્તરે જોવા મળી, જેમાં PPA અને નિયંત્રણ નમૂનાઓ વચ્ચે 70 થી વધુ ટેક્સા વિપુલ પ્રમાણમાં નોંધપાત્ર રીતે અલગ છે (પૂરક કોષ્ટક 2). PPA-ખુલ્લા નમૂનાઓની રચનાના વધુ મૂલ્યાંકનથી ખુલ્લા ન થયેલા નમૂનાઓની તુલનામાં માઇક્રોબાયલ પ્રજાતિઓની વધુ વિજાતીયતા જાહેર થઈ, જે સૂચવે છે કે PPA બેક્ટેરિયાના વિકાસની લાક્ષણિકતાઓમાં વધારો કરી શકે છે અને PPA-સમૃદ્ધ વાતાવરણમાં ટકી શકે તેવા બેક્ટેરિયાની વસ્તીને મર્યાદિત કરી શકે છે. આમ, PPA આંતરડાના માઇક્રોબાયોટા વિવિધતામાં વ્યાપક વિક્ષેપ લાવવાને બદલે પસંદગીયુક્ત રીતે ફેરફારો લાવી શકે છે.
PPA જેવા ફૂડ પ્રિઝર્વેટિવ્સ અગાઉ એકંદર વિવિધતાને અસર કર્યા વિના આંતરડાના માઇક્રોબાયોમ ઘટકોની વિપુલતાને બદલવા માટે દર્શાવવામાં આવ્યા છે (નાગપાલ એટ અલ., 2021). અહીં, અમે ફિલમ બેક્ટેરોઇડેટ્સ (અગાઉ બેક્ટેરોઇડેટ્સ તરીકે ઓળખાતા) માં બેક્ટેરોઇડેટ્સ પ્રજાતિઓ વચ્ચેના સૌથી આકર્ષક તફાવતો જોયા, જે PPA-સંપન્ન ઉંદરોમાં નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ હતા. બેક્ટેરોઇડ્સ પ્રજાતિઓની વધતી જતી વિપુલતા લાળના અધોગતિમાં વધારો સાથે સંકળાયેલ છે, જે ચેપનું જોખમ વધારી શકે છે અને બળતરાને પ્રોત્સાહન આપી શકે છે (કોર્નિક એટ અલ., 2015; દેસાઈ એટ અલ., 2016; પેન્ઝોલ એટ અલ., 2019). એક અભ્યાસમાં જાણવા મળ્યું છે કે બેક્ટેરોઇડ્સ ફ્રેજીલિસ સાથે સારવાર કરાયેલા નવજાત નર ઉંદરોએ ઓટીઝમ સ્પેક્ટ્રમ ડિસઓર્ડર (ASD) (કાર્મેલ એટ અલ., 2023) ની યાદ અપાવે તેવા સામાજિક વર્તણૂકો દર્શાવ્યા છે, અને અન્ય અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે બેક્ટેરોઇડ્સ પ્રજાતિઓ રોગપ્રતિકારક પ્રવૃત્તિમાં ફેરફાર કરી શકે છે અને ઓટોઇમ્યુન ઇન્ફ્લેમેટરી કાર્ડિયોમાયોપથી તરફ દોરી શકે છે (ગિલ-ક્રુઝ એટ અલ., 2019). PPA (કોરેટ્ટી એટ અલ., 2018) ના સંપર્કમાં આવેલા ઉંદરોમાં રુમિનોકોકસ, પ્રેવોટેલા અને પેરાબેક્ટેરોઇડ્સ જાતિની પ્રજાતિઓમાં પણ નોંધપાત્ર વધારો થયો હતો. રુમિનોકોકસની કેટલીક પ્રજાતિઓ પ્રોઇન્ફ્લેમેટરી સાયટોકાઇન્સના ઉત્પાદન દ્વારા ક્રોહન રોગ જેવા રોગો સાથે સંકળાયેલી છે (હેન્કે એટ અલ., 2019), જ્યારે પ્રેવોટેલા હ્યુમાની જેવી પ્રીવોટેલા પ્રજાતિઓ હાઇપરટેન્શન અને ઇન્સ્યુલિન સંવેદનશીલતા જેવા મેટાબોલિક રોગો સાથે સંકળાયેલી છે (પેડરસન એટ અલ., 2016; લી એટ અલ., 2017). અંતે, અમને જાણવા મળ્યું કે બેક્ટેરોઇડેટ્સ (અગાઉ ફર્મિક્યુટ્સ તરીકે ઓળખાતા) અને બેક્ટેરોઇડેટ્સનો ગુણોત્તર PPA-સંપર્કમાં આવેલા ઉંદરોમાં નિયંત્રણ ઉંદરો કરતાં નોંધપાત્ર રીતે ઓછો હતો કારણ કે બેક્ટેરોઇડેટ્સ પ્રજાતિઓની કુલ વિપુલતા વધારે હતી. આ ગુણોત્તર અગાઉ આંતરડાના હોમિયોસ્ટેસિસનું એક મહત્વપૂર્ણ સૂચક તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યું છે, અને આ ગુણોત્તરમાં વિક્ષેપ વિવિધ રોગની સ્થિતિઓ સાથે સંકળાયેલા છે (ટર્પિન એટ અલ., 2016; ટેકઝાવા એટ અલ., 2021; એન એટ અલ., 2023), જેમાં બળતરા આંતરડાના રોગોનો સમાવેશ થાય છે (સ્ટોજાનોવ એટ અલ., 2020). સામૂહિક રીતે, બેક્ટેરોઇડેટ્સની પ્રજાતિઓ ઉચ્ચ આહાર PPA દ્વારા સૌથી વધુ પ્રભાવિત હોય તેવું લાગે છે. આ PPA પ્રત્યે વધુ સહિષ્ણુતા અથવા ઉર્જા સ્ત્રોત તરીકે PPA નો ઉપયોગ કરવાની ક્ષમતાને કારણે હોઈ શકે છે, જે ઓછામાં ઓછી એક પ્રજાતિ, હોયલેસેલા એનોસીઆ (હિચ એટ અલ., 2022) માટે સાચું હોવાનું દર્શાવવામાં આવ્યું છે. વૈકલ્પિક રીતે, માતાના PPA સંપર્કમાં ઉંદરના સંતાનના આંતરડાને બેક્ટેરોઇડેટ્સના વસાહતીકરણ માટે વધુ સંવેદનશીલ બનાવીને ગર્ભ વિકાસમાં વધારો થઈ શકે છે; જો કે, અમારા અભ્યાસ ડિઝાઇને આવા મૂલ્યાંકનને મંજૂરી આપી ન હતી.
મેટાજેનોમિક સામગ્રી મૂલ્યાંકનમાં PPA ચયાપચય અને ઉત્પાદન સાથે સંકળાયેલા જનીનોની વિપુલતામાં નોંધપાત્ર તફાવત જોવા મળ્યો, જેમાં PPA-સંપર્ક પામેલા ઉંદરોમાં PPA ઉત્પાદન માટે જવાબદાર જનીનોની વધુ વિપુલતા જોવા મળી, જ્યારે બિન-PPA-સંપર્ક પામેલા ઉંદરોમાં PAA ચયાપચય માટે જવાબદાર જનીનોની વધુ વિપુલતા જોવા મળી (આકૃતિ 6). આ પરિણામો સૂચવે છે કે માઇક્રોબાયલ રચના પર PPA ની અસર ફક્ત તેના ઉપયોગને કારણે ન હોઈ શકે, અન્યથા PPA ચયાપચય સાથે સંકળાયેલા જનીનોની વિપુલતા PPA-સંપર્ક પામેલા ઉંદરોના આંતરડાના માઇક્રોબાયોમમાં વધુ વિપુલતા જોવા મળી હોત. એક સમજૂતી એ છે કે PPA મુખ્યત્વે તેના એન્ટિમાઇક્રોબાયલ અસરો દ્વારા બેક્ટેરિયાની વિપુલતાને મધ્યસ્થી કરે છે, બેક્ટેરિયા દ્વારા પોષક તત્વો તરીકે ઉપયોગ કરીને નહીં. અગાઉના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે PPA ડોઝ-આધારિત રીતે સૅલ્મોનેલા ટાઇફીમ્યુરિયમના વિકાસને અટકાવે છે (જેકોબ્સન એટ અલ., 2018). PPA ની ઉચ્ચ સાંદ્રતાના સંપર્કમાં એવા બેક્ટેરિયા હોઈ શકે છે જે તેના એન્ટિમાઇક્રોબાયલ ગુણધર્મો પ્રત્યે પ્રતિરોધક હોય અને તેને ચયાપચય અથવા ઉત્પાદન કરી શકતા નથી. ઉદાહરણ તરીકે, ઘણી પેરાબેક્ટેરોઇડ પ્રજાતિઓએ PPA નમૂનાઓમાં નોંધપાત્ર રીતે વધુ વિપુલતા દર્શાવી હતી, પરંતુ PPA ચયાપચય અથવા ઉત્પાદન સાથે સંબંધિત કોઈ જનીનો શોધી કાઢવામાં આવ્યા ન હતા (પૂરક કોષ્ટકો 2, 4, અને 5). વધુમાં, આથો આડપેદાશ તરીકે PPA ઉત્પાદન વિવિધ બેક્ટેરિયામાં વ્યાપકપણે વિતરિત થાય છે (ગોન્ઝાલેઝ-ગાર્સિયા એટ અલ., 2017). નિયંત્રણ નમૂનાઓમાં PPA ચયાપચય સાથે સંબંધિત જનીનોની વધુ વિપુલતાનું કારણ ઉચ્ચ બેક્ટેરિયલ વિવિધતા હોઈ શકે છે (એવેરીના એટ અલ., 2020). વધુમાં, 1332 જનીનોમાંથી ફક્ત 27 (2.14%) જનીનો ફક્ત PPA ચયાપચય સાથે સંકળાયેલા હોવાનું અનુમાન કરવામાં આવ્યું હતું. PPA ચયાપચય સાથે સંકળાયેલા ઘણા જનીનો અન્ય મેટાબોલિક માર્ગોમાં પણ સામેલ છે. આ આગળ દર્શાવે છે કે નિયંત્રણ નમૂનાઓમાં PPA ચયાપચયમાં સામેલ જનીનોની વિપુલતા વધુ હતી; આ જનીનો એવા માર્ગોમાં કાર્ય કરી શકે છે જે PPA ઉપયોગ અથવા ઉપઉત્પાદન તરીકે રચનામાં પરિણમતા નથી. આ કિસ્સામાં, PPA જનરેશન સાથે સંકળાયેલા ફક્ત એક જ જનીને નમૂના પ્રકારો વચ્ચે વિપુલતામાં નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવ્યો હતો. PPA ચયાપચય સાથે સંકળાયેલા જનીનોથી વિપરીત, PPA ઉત્પાદન માટે માર્કર જનીનો પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા કારણ કે તેઓ PPA ઉત્પાદન માટે બેક્ટેરિયલ માર્ગમાં સીધા સંકળાયેલા છે. PPA-સંપર્કમાં આવેલા ઉંદરોમાં, બધી પ્રજાતિઓમાં PPA ઉત્પન્ન કરવાની વિપુલતા અને ક્ષમતામાં નોંધપાત્ર વધારો જોવા મળ્યો. આ આગાહીને સમર્થન આપે છે કે PPA PPA ઉત્પાદકોને પસંદ કરશે અને તેથી આગાહી કરે છે કે PPA ઉત્પાદન ક્ષમતામાં વધારો થશે. જો કે, જનીન વિપુલતા જનીન અભિવ્યક્તિ સાથે સંબંધિત નથી; આમ, નિયંત્રણ નમૂનાઓમાં PPA ચયાપચય સાથે સંકળાયેલા જનીનોની વિપુલતા વધારે હોવા છતાં, અભિવ્યક્તિ દર અલગ હોઈ શકે છે (શી એટ અલ., 2014). PPA-ઉત્પાદક જનીનો અને PPA ઉત્પાદનના વ્યાપ વચ્ચેના સંબંધની પુષ્ટિ કરવા માટે, PPA ઉત્પાદનમાં સામેલ જનીનોની અભિવ્યક્તિનો અભ્યાસ જરૂરી છે.
PPA અને નિયંત્રણ મેટાજેનોમ્સના કાર્યાત્મક એનોટેશનથી કેટલાક તફાવતો જાહેર થયા. જનીન સામગ્રીના PCA વિશ્લેષણથી PPA અને નિયંત્રણ નમૂનાઓ વચ્ચેના અલગ ક્લસ્ટરો જાહેર થયા (આકૃતિ 5). અંદર-નમૂના ક્લસ્ટરિંગમાં જાણવા મળ્યું કે નિયંત્રણ જનીન સામગ્રી વધુ વૈવિધ્યસભર હતી, જ્યારે PPA નમૂનાઓ એકસાથે ક્લસ્ટર થયા હતા. જનીન સામગ્રી દ્વારા ક્લસ્ટરિંગ પ્રજાતિઓની રચના દ્વારા ક્લસ્ટરિંગ સાથે તુલનાત્મક હતું. આમ, પાથવે વિપુલતામાં તફાવત ચોક્કસ પ્રજાતિઓ અને તેમની અંદરના તાણની વિપુલતામાં ફેરફાર સાથે સુસંગત છે. PPA નમૂનાઓમાં, નોંધપાત્ર રીતે વધુ વિપુલતાવાળા બે માર્ગો એમિનોસુગર/ન્યુક્લિયોટાઇડ ખાંડ ચયાપચય (ko:K21279) અને બહુવિધ લિપિડ ચયાપચય માર્ગો (ko:K00647, ko:K03801; પૂરક કોષ્ટક 3) સાથે સંબંધિત હતા. ko:K21279 સાથે સંકળાયેલા જનીનો જીનસ બેક્ટેરોઇડ્સ સાથે સંકળાયેલા હોવાનું જાણીતું છે, જે PPA નમૂનાઓમાં નોંધપાત્ર રીતે વધુ સંખ્યામાં પ્રજાતિઓ ધરાવતી જાતિઓમાંની એક છે. આ એન્ઝાઇમ કેપ્સ્યુલર પોલિસેકરાઇડ્સ વ્યક્ત કરીને રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવને ટાળી શકે છે (વાંગ એટ અલ., 2008). આ PPA-સંપર્કમાં આવેલા ઉંદરોમાં જોવા મળતા બેક્ટેરોઇડેટ્સમાં વધારો માટે જવાબદાર હોઈ શકે છે. આ PPA માઇક્રોબાયોમમાં જોવા મળતા વધેલા ફેટી એસિડ સંશ્લેષણને પૂરક બનાવે છે. બેક્ટેરિયા ફેટી એસિડ ઉત્પન્ન કરવા માટે FASIIko:K00647 (fabB) માર્ગનો ઉપયોગ કરે છે, જે યજમાન મેટાબોલિક માર્ગોને પ્રભાવિત કરી શકે છે (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020), અને લિપિડ ચયાપચયમાં ફેરફાર ન્યુરોડેવલપમેન્ટમાં ભૂમિકા ભજવી શકે છે (Yu et al., 2020). PPA નમૂનાઓમાં વધેલી વિપુલતા દર્શાવતો બીજો માર્ગ સ્ટીરોઈડ હોર્મોન બાયોસિન્થેસિસ (ko:K12343) હતો. એવા પુરાવા વધી રહ્યા છે કે આંતરડાના માઇક્રોબાયોટાની હોર્મોન સ્તરોને પ્રભાવિત કરવાની અને હોર્મોન્સથી પ્રભાવિત થવાની ક્ષમતા વચ્ચે વિપરીત સંબંધ છે, જેમ કે એલિવેટેડ સ્ટીરોઈડ સ્તરો ડાઉનસ્ટ્રીમ આરોગ્ય પરિણામો લાવી શકે છે (Tetel et al., 2018).
આ અભ્યાસ મર્યાદાઓ અને વિચારણાઓ વિનાનો નથી. એક મહત્વપૂર્ણ તફાવત એ છે કે અમે પ્રાણીઓનું શારીરિક મૂલ્યાંકન કર્યું નથી. તેથી, માઇક્રોબાયોમમાં થતા ફેરફારો કોઈ રોગ સાથે સંકળાયેલા છે કે નહીં તે સીધું તારણ કાઢવું ​​શક્ય નથી. બીજી વિચારણા એ છે કે આ અભ્યાસમાં ઉંદરોને તેમની માતાઓ જેવો જ ખોરાક આપવામાં આવ્યો હતો. ભવિષ્યના અભ્યાસો નક્કી કરી શકે છે કે PPA-સમૃદ્ધ આહારમાંથી PPA-મુક્ત આહારમાં સ્વિચ કરવાથી માઇક્રોબાયોમ પર તેની અસરોમાં સુધારો થાય છે કે નહીં. અમારા અભ્યાસની એક મર્યાદા, અન્ય ઘણા લોકોની જેમ, મર્યાદિત નમૂનાનું કદ છે. જોકે માન્ય તારણો કાઢી શકાય છે, પરિણામોનું વિશ્લેષણ કરતી વખતે મોટા નમૂનાનું કદ વધુ આંકડાકીય શક્તિ પ્રદાન કરશે. અમે આંતરડાના માઇક્રોબાયોમમાં ફેરફારો અને કોઈપણ રોગ વચ્ચેના જોડાણ વિશે તારણો કાઢવામાં પણ સાવધ છીએ (યાપ એટ અલ., 2021). ઉંમર, લિંગ અને આહાર સહિતના મૂંઝવણભર્યા પરિબળો સુક્ષ્મસજીવોની રચનાને નોંધપાત્ર રીતે પ્રભાવિત કરી શકે છે. આ પરિબળો જટિલ રોગો સાથે આંતરડાના માઇક્રોબાયોમના જોડાણ અંગે સાહિત્યમાં જોવા મળતી અસંગતતાઓને સમજાવી શકે છે (જોહ્ન્સન એટ અલ., 2019; લાગોડ અને નાસર, 2023). ઉદાહરણ તરીકે, ASD ધરાવતા પ્રાણીઓ અને મનુષ્યોમાં બેક્ટેરોઇડેટ્સ જાતિના સભ્યોમાં વધારો અથવા ઘટાડો જોવા મળ્યો છે (એન્જેલિસ એટ અલ., 2013; કુશક એટ અલ., 2017). તેવી જ રીતે, બળતરા આંતરડાના રોગો ધરાવતા દર્દીઓમાં આંતરડાની રચનાના અભ્યાસમાં સમાન ટેક્સામાં વધારો અને ઘટાડો બંને જોવા મળ્યા છે (વોલ્ટર્સ એટ અલ., 2014; ફોર્બ્સ એટ અલ., 2018; ઉપાધ્યાય એટ અલ., 2023). લિંગ પૂર્વગ્રહની અસરને મર્યાદિત કરવા માટે, અમે જાતિઓનું સમાન પ્રતિનિધિત્વ સુનિશ્ચિત કરવાનો પ્રયાસ કર્યો જેથી તફાવતો મોટાભાગે આહાર દ્વારા સંચાલિત થાય. કાર્યાત્મક ટીકાનો એક પડકાર એ બિનજરૂરી જનીન ક્રમ દૂર કરવાનો છે. અમારી જનીન ક્લસ્ટરિંગ પદ્ધતિમાં 95% ક્રમ ઓળખ અને 85% લંબાઈ સમાનતા, તેમજ ખોટા ક્લસ્ટરિંગને દૂર કરવા માટે 90% સંરેખણ કવરેજની જરૂર છે. જો કે, કેટલાક કિસ્સાઓમાં, અમે સમાન ટીકાઓ (દા.ત., MUT) (આકૃતિ 6) સાથે COGs અવલોકન કર્યા. આ ઓર્થોલોગ્સ અલગ છે કે નહીં, ચોક્કસ જનરા સાથે સંકળાયેલા છે કે નહીં તે નક્કી કરવા માટે વધુ અભ્યાસની જરૂર છે, અથવા આ જનીન ક્લસ્ટરિંગ અભિગમની મર્યાદા છે કે નહીં તે નક્કી કરવા માટે વધુ અભ્યાસની જરૂર છે. કાર્યાત્મક ટીકાની બીજી મર્યાદા સંભવિત ખોટી વર્ગીકરણ છે; બેક્ટેરિયલ જનીન mmdA એ પ્રોપિયોનેટ સંશ્લેષણમાં સામેલ એક જાણીતું એન્ઝાઇમ છે, પરંતુ KEGG તેને પ્રોપિયોનેટ મેટાબોલિક માર્ગ સાથે સાંકળતું નથી. તેનાથી વિપરીત, scpB અને mmcD ઓર્થોલોગ્સ સંબંધિત છે. નિયુક્ત નોકઆઉટ્સ વિના મોટી સંખ્યામાં જનીનો જનીન વિપુલતાનું મૂલ્યાંકન કરતી વખતે PPA-સંબંધિત જનીનોને ઓળખવામાં અસમર્થતા તરફ દોરી શકે છે. ભવિષ્યના અભ્યાસોને મેટાટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ વિશ્લેષણથી ફાયદો થશે, જે ગટ માઇક્રોબાયોટાની કાર્યાત્મક લાક્ષણિકતાઓની ઊંડી સમજ પ્રદાન કરી શકે છે અને જનીન અભિવ્યક્તિને સંભવિત ડાઉનસ્ટ્રીમ અસરો સાથે જોડી શકે છે. ચોક્કસ ન્યુરોડેવલપમેન્ટલ ડિસઓર્ડર અથવા બળતરા આંતરડાના રોગોને લગતા અભ્યાસો માટે, માઇક્રોબાયોમ રચનામાં ફેરફારોને આ વિકારો સાથે જોડવા માટે પ્રાણીઓના શારીરિક અને વર્તણૂકીય મૂલ્યાંકનની જરૂર છે. ગટ માઇક્રોબાયોમને જર્મ-મુક્ત ઉંદરમાં ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કરવાના વધારાના અભ્યાસો પણ માઇક્રોબાયોમ રોગનું ડ્રાઇવર છે કે લાક્ષણિકતા છે તે નક્કી કરવા માટે ઉપયોગી થશે.
સારાંશમાં, અમે દર્શાવ્યું કે ડાયેટરી PPA ગટ માઇક્રોબાયોટાની રચનામાં ફેરફાર કરવામાં પરિબળ તરીકે કાર્ય કરે છે. PPA એ FDA-મંજૂર પ્રિઝર્વેટિવ છે જે વિવિધ ખોરાકમાં વ્યાપકપણે જોવા મળે છે, જે લાંબા સમય સુધી સંપર્કમાં રહેવાથી સામાન્ય ગટ ફ્લોરામાં વિક્ષેપ પડી શકે છે. અમને ઘણા બેક્ટેરિયાની વિપુલતામાં ફેરફાર જોવા મળ્યા, જે સૂચવે છે કે PPA ગટ માઇક્રોબાયોટાની રચનાને પ્રભાવિત કરી શકે છે. માઇક્રોબાયોટામાં ફેરફાર ચોક્કસ મેટાબોલિક માર્ગોના સ્તરમાં ફેરફાર તરફ દોરી શકે છે, જે યજમાન સ્વાસ્થ્ય માટે સંબંધિત શારીરિક ફેરફારો તરફ દોરી શકે છે. માઇક્રોબાયોટાની રચના પર ડાયેટરી PPA ની અસરો ડિસબાયોસિસ અથવા અન્ય રોગો તરફ દોરી શકે છે કે કેમ તે નક્કી કરવા માટે વધુ અભ્યાસની જરૂર છે. આ અભ્યાસ ગટ રચના પર PPA ની અસરો માનવ સ્વાસ્થ્યને કેવી રીતે અસર કરી શકે છે તેના પર ભવિષ્યના અભ્યાસ માટે પાયો નાખે છે.
આ અભ્યાસમાં રજૂ કરાયેલા ડેટાસેટ્સ ઓનલાઈન રિપોઝીટરીઓમાં ઉપલબ્ધ છે. રિપોઝીટરીઓનું નામ અને એક્સેસન નંબર છે: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
આ પ્રાણી અભ્યાસને યુનિવર્સિટી ઓફ સેન્ટ્રલ ફ્લોરિડા ઇન્સ્ટિટ્યૂશનલ એનિમલ કેર એન્ડ યુઝ કમિટી (UCF-IACUC) (એનિમલ યુઝ પરમિટ નંબર: PROTO202000002) દ્વારા મંજૂરી આપવામાં આવી હતી. આ અભ્યાસ સ્થાનિક કાયદાઓ, નિયમો અને સંસ્થાકીય જરૂરિયાતોનું પાલન કરે છે.
NG: કન્સેપ્ટ્યુલાઇઝેશન, ડેટા ક્યુરેશન, ઔપચારિક વિશ્લેષણ, તપાસ, પદ્ધતિ, સોફ્ટવેર, વિઝ્યુલાઇઝેશન, લેખન (મૂળ ડ્રાફ્ટ), લેખન (સમીક્ષા અને સંપાદન). LA: કન્સેપ્ટ્યુલાઇઝેશન, ડેટા ક્યુરેશન, પદ્ધતિ, સંસાધનો, લેખન (સમીક્ષા અને સંપાદન). SH: ઔપચારિક વિશ્લેષણ, સોફ્ટવેર, લેખન (સમીક્ષા અને સંપાદન). SA: તપાસ, લેખન (સમીક્ષા અને સંપાદન). મુખ્ય ન્યાયાધીશ: તપાસ, લેખન (સમીક્ષા અને સંપાદન). SN: કન્સેપ્ટ્યુલાઇઝેશન, પ્રોજેક્ટ વહીવટ, સંસાધનો, દેખરેખ, લેખન (સમીક્ષા અને સંપાદન). TA: કન્સેપ્ટ્યુલાઇઝેશન, પ્રોજેક્ટ વહીવટ, દેખરેખ, લેખન (સમીક્ષા અને સંપાદન).
લેખકોએ જાહેર કર્યું કે તેમને આ લેખના સંશોધન, લેખકત્વ અને/અથવા પ્રકાશન માટે કોઈ નાણાકીય સહાય મળી નથી.
લેખકો જાહેર કરે છે કે આ સંશોધન એવા કોઈપણ વ્યાપારી અથવા નાણાકીય સંબંધોના અભાવે હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું જેને હિતોના સંભવિત સંઘર્ષ તરીકે અર્થઘટન કરી શકાય. લાગુ પડતું નથી.
આ લેખમાં વ્યક્ત કરાયેલા બધા મંતવ્યો ફક્ત લેખકોના છે અને તે જરૂરી નથી કે તે તેમની સંસ્થાઓ, પ્રકાશકો, સંપાદકો અથવા સમીક્ષકોના મંતવ્યો પ્રતિબિંબિત કરે. આ લેખમાં મૂલ્યાંકન કરાયેલ કોઈપણ ઉત્પાદનો, અથવા તેમના ઉત્પાદકો દ્વારા કરવામાં આવેલા કોઈપણ દાવાઓ, પ્રકાશક દ્વારા ગેરંટીકૃત અથવા સમર્થન આપવામાં આવતા નથી.
આ લેખ માટે પૂરક સામગ્રી ઓનલાઈન મળી શકે છે: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
અબ્દેલી એલએસ, સમસમ એ, નાસેર એસએ (2019). ઓટીઝમ સ્પેક્ટ્રમ ડિસઓર્ડરમાં PTEN/AKT માર્ગને નિયંત્રિત કરીને પ્રોપિયોનિક એસિડ ગ્લિઓસિસ અને ન્યુરોઇન્ફ્લેમેશનને પ્રેરિત કરે છે. વૈજ્ઞાનિક અહેવાલો 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
એચિસન, જે. (૧૯૮૨). રચનાત્મક ડેટાનું આંકડાકીય વિશ્લેષણ. જેઆર સ્ટેટ સોક સેર બી મેથોડોલ. ૪૪, ૧૩૯–૧૬૦. doi: ૧૦.૧૧૧૧/j.૨૫૧૭-૬૧૬૧.૧૯૮૨.tb01195.x
આહ્ન જે, ક્વોન એચ, કિમ વાયજે (2023). સ્તન કેન્સર માટે જોખમ પરિબળ તરીકે ફર્મિક્યુટ્સ/બેક્ટેરોઇડેટ્સ ગુણોત્તર. જર્નલ ઓફ ક્લિનિકલ મેડિસિન, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
એન્ડર્સ એસ., હ્યુબર ડબલ્યુ. (2010). ક્રમ ગણતરી ડેટાનું વિભેદક અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ. નેટ પાછલું. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
એન્જેલિસ, એમડી, પિકોલો, એમ., વેનીની, એલ., સિરાગુસા, એસ., ગિયાકોમો, એડી, સેરાઝાનેટી, ડીઆઈ, એટ અલ. (2013). ઓટીઝમ અને વ્યાપક વિકાસલક્ષી વિકાર ધરાવતા બાળકોમાં ફેકલ માઇક્રોબાયોટા અને મેટાબોલોમ જે અન્યથા ઉલ્લેખિત નથી. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
એવેરીના ઓવી, કોવટુન એએસ, પોલિઆકોવા એસઆઈ, સેવિલોવા એએમ, રેબ્રિકોવ ડીવી, ડેનિલેન્કો વીએન (2020). ઓટીઝમ સ્પેક્ટ્રમ ડિસઓર્ડર ધરાવતા નાના બાળકોમાં આંતરડાના માઇક્રોબાયોટાના બેક્ટેરિયલ ન્યુરોમેટાબોલિક લાક્ષણિકતાઓ. જર્નલ ઓફ મેડિકલ માઇક્રોબાયોલોજી 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
બાક્વેરો એફ., નોમ્બેલા કે. (2012). માનવ અંગ તરીકે માઇક્રોબાયોમ. ક્લિનિકલ માઇક્રોબાયોલોજી અને ચેપ 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
બૌર ટી., ડ્યુરે પી. (2023). પ્રોપિયોનિક એસિડ ઉત્પન્ન કરતા બેક્ટેરિયાના શરીરવિજ્ઞાનમાં નવી આંતરદૃષ્ટિ: એનારોટિગ્નમ પ્રોપિયોનિકમ અને એનારોટિગ્નમ નિયોપ્રોપિયોનિકમ (અગાઉ ક્લોસ્ટ્રિડિયમ પ્રોપિયોનિકમ અને ક્લોસ્ટ્રિડિયમ નિયોપ્રોપિયોનિકમ). સૂક્ષ્મજીવો 11, 685. doi: 10.3390/સૂક્ષ્મજીવો11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). માતાનું પોષણ અને ગર્ભ વિકાસ. જે ન્યુટર. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
બેન્જામિની, વાય., અને હોચબર્ગ, જે. (૧૯૯૫). ખોટા-સકારાત્મક દરને નિયંત્રિત કરવો: બહુવિધ પરીક્ષણ માટે એક વ્યવહારુ અને કાર્યક્ષમ અભિગમ. જેઆર સ્ટેટ સોક સેર બી મેથોડોલ. ૫૭, ૨૮૯–૩૦૦. doi: ૧૦.૧૧૧૧/j.૨૫૧૭-૬૧૬૧.૧૯૯૫.tb02031.x