Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર. તમે જે બ્રાઉઝર વર્ઝનનો ઉપયોગ કરી રહ્યા છો તેમાં CSS માટે મર્યાદિત સપોર્ટ છે. શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટેડ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા ઇન્ટરનેટ એક્સપ્લોરરમાં સુસંગતતા મોડ બંધ કરો). આ દરમિયાન, સતત સપોર્ટ સુનિશ્ચિત કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને જાવાસ્ક્રિપ્ટ વિના સાઇટ પ્રદર્શિત કરીશું.
કરોડઅસ્થિધારી પ્રાણીઓથી વિપરીત, જંતુઓમાં પુરુષ-પક્ષપાતી સેક્સ સ્ટીરોઈડ હોર્મોન્સનો અભાવ હોવાનું વ્યાપકપણે માનવામાં આવે છે. એનોફિલિસ ગેમ્બિયામાં, એકડીસોન સ્ટીરોઈડ 20-હાઈડ્રોક્સીએકડીસોન (20E) માદા દ્વારા સંશ્લેષણ કરવામાં આવે ત્યારે ઇંડાના વિકાસને નિયંત્રિત કરવા અને નર દ્વારા જાતીય સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવે ત્યારે સમાગમના પ્રત્યાવર્તન સમયગાળાને પ્રેરિત કરવા માટે વિકસિત થયું હોય તેવું લાગે છે. ઇંડા વિકાસ અને સમાગમ આવશ્યક પ્રજનન લક્ષણો હોવાથી, માદા એનોફિલિસ મચ્છર આ હોર્મોનલ સંકેતોને કેવી રીતે એકીકૃત કરે છે તે સમજવાથી નવા મેલેરિયા નિયંત્રણ કાર્યક્રમોની રચનાને સરળ બનાવી શકાય છે. અહીં, અમે જાહેર કરીએ છીએ કે આ પ્રજનન કાર્યો એકડીસ્ટેરોઇડ-સક્રિય/નિષ્ક્રિય ઉત્સેચકોના જટિલ નેટવર્ક દ્વારા અલગ સેક્સ સ્ટીરોઈડ્સ દ્વારા નિયંત્રિત થાય છે. અમે એક પુરુષ-વિશિષ્ટ ઓક્સિડાઇઝ્ડ એકડીસોન, 3-ડિહાઇડ્રો-20E (3D20E) ઓળખી કાઢ્યા છે, જે ડિફોસ્ફોરાયલેશન દ્વારા જાતીય સ્થાનાંતરણ અને સક્રિયકરણ પછી સ્ત્રી જાતીય ગ્રહણશીલતાને બંધ કરીને પિતૃત્વનું રક્ષણ કરે છે. નોંધપાત્ર રીતે, 3D20E ટ્રાન્સફરે પ્રજનન જનીનોની અભિવ્યક્તિને પણ પ્રેરિત કરી જે પ્લાઝમોડિયમ ચેપ દરમિયાન ઇંડા વિકાસને જાળવી રાખે છે, ચેપગ્રસ્ત માદાઓના સ્વાસ્થ્યને સુનિશ્ચિત કરે છે. સ્ત્રી-ઉત્પન્ન 20E જાતીય પ્રતિભાવ ઉત્પન્ન કરતું નથી, પરંતુ 20E-ઇન્હિબિટિંગ કાઇનેસિસને અવરોધિત કર્યા પછી સમાગમ કરનારા વ્યક્તિઓને ઇંડા મૂકવાની મંજૂરી આપે છે. આ પુરુષ-વિશિષ્ટ જંતુ સ્ટીરોઈડ હોર્મોનની ઓળખ અને સ્ત્રી જાતીય ગ્રહણશક્તિ, પ્રજનનક્ષમતા અને પ્લાઝમોડિયમ સાથેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને નિયંત્રિત કરવામાં તેની ભૂમિકા મેલેરિયા-પ્રસારિત મચ્છરોની પ્રજનન સફળતા ઘટાડવાની સંભાવના સૂચવે છે.
માનવ મેલેરિયા પરોપજીવીઓના એકમાત્ર વાહક એનોફિલિસ મચ્છરોમાં વ્યાપક જંતુનાશક પ્રતિકારને કારણે મેલેરિયાના કેસ અને મૃત્યુ ફરી વધી રહ્યા છે. આ મચ્છરોનું સંવનન જીવવિજ્ઞાન નવા મેલેરિયા નિયંત્રણ હસ્તક્ષેપો માટે ખાસ આકર્ષક લક્ષ્ય છે કારણ કે માદાઓ ફક્ત એક જ વાર સંવનન કરે છે5; આ એક જ સંવનન ઘટનાને જંતુરહિત બનાવવાથી ખેતરમાં મચ્છરોની વસ્તી ઘટાડવાની મોટી સંભાવના રહેશે.
પુરુષો પાસેથી ઉચ્ચ-ટાઇટર સ્ટીરોઈડ હોર્મોન્સ પ્રાપ્ત કર્યા પછી સ્ત્રીઓ જાતીય રીતે અક્ષમ થઈ જાય છે. અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે વધુ સમાગમમાં મુશ્કેલીનું કારણ 20-હાઈડ્રોક્સીએકડિસોન (20E) છે, જે લાર્વા તબક્કામાં પીગળવાના ચક્રના નિયમનકાર તરીકે વધુ જાણીતું સ્ટીરોઈડ હોર્મોન છે. 20E ને સંશ્લેષણ અને સ્થાનાંતરિત કરવાની પુરુષોની ક્ષમતા ખાસ કરીને એનોફિલ્સ પ્રજાતિઓમાં વિકસિત થઈ છે જે સબજેનસ સેલિયા7 નો ભાગ છે, જે આફ્રિકામાં વિતરિત થાય છે અને તેમાં મેલેરિયાના સૌથી ખતરનાક વાહકોનો સમાવેશ થાય છે, જેમાં એનોફિલ્સ ગેમ્બિયાનો સમાવેશ થાય છે. આ ખાસ કરીને નોંધપાત્ર છે કારણ કે આ પ્રજાતિઓમાં માદાઓ પણ દરેક રક્ત ભોજન પછી 20E ઉત્પન્ન કરે છે, અને 20E ઓજેનેસિસ ચક્ર ચલાવે છે (સંદર્ભ 8 જુઓ). જો કે, માદાઓ તેમની પોતાની સમાગમ કરવાની ક્ષમતા સાથે સમાધાન કર્યા વિના એકડિસોન (પુરુષ ટ્રાન્સફર અને રક્ત ખોરાક ઇન્ડક્શન) ના બે અલગ અલગ સ્ત્રોતોમાંથી સિગ્નલોને કેવી રીતે એકીકૃત કરે છે તે વિશે બહુ ઓછું જાણીતું છે. હકીકતમાં, જો માદાઓ દ્વારા ઉત્પાદિત 20E જાતીય અસહિષ્ણુતાને ઉત્તેજિત કરે છે, તો આ કુંવારી ખોરાક આપતી વ્યક્તિઓમાં વંધ્યત્વ તરફ દોરી જશે, જે આ મચ્છરોમાં ખૂબ જ સામાન્ય વર્તન છે.
એક સંભવિત સમજૂતી એ છે કે A. gambiae નર એક સંશોધિત પુરુષ-વિશિષ્ટ એકડીસોન સ્થાનાંતરિત કરે છે, જે સ્ત્રી પ્રજનન માર્ગમાં સિગ્નલિંગ કાસ્કેડને સક્રિય કરે છે, જેના પરિણામે સમાગમ અસ્થિરતા આવે છે. જો કે, કરોડઅસ્થિધારી પ્રાણીઓમાં એસ્ટ્રોજન અને એન્ડ્રોજન (સંદર્ભ 9 માં સમીક્ષા કરાયેલ) જેવા બહુવિધ સ્ટીરોઈડ હોર્મોન્સ હોવા છતાં, અમારા જ્ઞાન મુજબ, જંતુઓમાં એન્ડ્રોજેનિક-પક્ષપાતી સ્ટેરોઈડ ઓળખાયા નથી.
અમે શક્ય ફેરફાર કરનારા સ્ટેરોઇડ્સની શોધમાં લૈંગિક રીતે પરિપક્વ A. gambiae ના પુરુષ સહાયક ગ્રંથિ (MAG) માં સ્ટીરોઈડ હોર્મોન્સનો ભંડાર નક્કી કરવા માટે નીકળ્યા. અગાઉ ઉપયોગમાં લેવાતી ઓછી ચોક્કસ પદ્ધતિને બદલે ટેન્ડમ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (HPLC-MS/MS) સાથે જોડાયેલ ઉચ્ચ પ્રદર્શન પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફીનો ઉપયોગ કરીને, અમે આ પેશીઓમાં એકડીસોન (E) અને 20E શોધી કાઢ્યા, જે અગાઉના પરિણામની પુષ્ટિ કરે છે. જો કે, નમૂનામાં ઓક્સિડાઇઝ્ડ ફોસ્ફોરીલેટેડ સ્ટેરોઇડ્સનું પ્રભુત્વ હતું, જે સૂત્ર 3-ડિહાઇડ્રો-20E-22-ફોસ્ફેટ (3D20E22P)12 (આકૃતિ 1) સાથે સુસંગત હતું. અન્ય સ્વરૂપોમાં 3-ડિહાઇડ્રો-20E (3D20E) અને 20E-22-ફોસ્ફેટ (20E22P) શામેલ છે. 3D20E22P ની HPLC-MS/MS સિગ્નલ તીવ્રતા તેના ડિફોસ્ફોરીલેટેડ સ્વરૂપ, 3D20E કરતા બે ક્રમની તીવ્રતા વધારે હતી, અને E અને 20E કરતા ત્રણ ક્રમની તીવ્રતા વધારે હતી (આકૃતિ ૧). જોકે શરીરના અન્ય ભાગોમાં અને નીચલા પ્રજનન માર્ગમાં (LRT; વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ ૧a). અમે નવા બંધ (<૧ દિવસ જૂના) પુરુષો અને સ્ત્રીઓમાં એકડિસ્ટેરોઇડ્સનું પણ વિશ્લેષણ કર્યું અને ફક્ત MAG માં 3D20E અને 3D20E22P શોધી કાઢ્યું; બંને જાતિઓમાં E, 20E અને 20E22P હાજર હતા (વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ ૧b). આ ડેટા સૂચવે છે કે A. gambiae પુખ્ત પુરુષો તેમના MAG માં સંશોધિત હોર્મોન્સના ઉચ્ચ ટાઇટર્સ ઉત્પન્ન કરે છે જે સ્ત્રીઓ દ્વારા સંશ્લેષિત થતા નથી.
MAG અને સ્ત્રી LRT (એટ્રિયા, સેમિનલ વેસિકલ્સ અને પેરોવેરિયમ સહિત) 4-દિવસના (4-દિવસના) કુંવારા પુરુષો અને કુંવારા અને સંવનન કરેલી સ્ત્રીઓ (0.5, 3, અને 12 hpm) માંથી વિચ્છેદિત કરવામાં આવ્યા હતા. આ પેશીઓમાં એક્ડાયસોનનું વિશ્લેષણ HPLC-MS/MS (સરેરાશ ± sem; અનપેયર્ડ ટી-ટેસ્ટ, બે-બાજુવાળા, ખોટા શોધ દર (FDR) સુધારેલ; NS, નોંધપાત્ર નથી; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 કલાક વિરુદ્ધ 0.5 કલાક, P = 0.035; 12 કલાક વિરુદ્ધ 3 કલાક, P = 0.0015; 12 કલાક વિરુદ્ધ 0.5 કલાક, P = 0.030. 3D20E22P: 3 કલાક વિરુદ્ધ 0.5 કલાક, P = 0.25; 12 કલાક વિરુદ્ધ 3 કલાક, P = 0.0032; 12 કલાક વિરુદ્ધ 0.5 કલાક, P = 0.015). ડેટા ત્રણ જૈવિક પ્રતિકૃતિઓમાંથી લેવામાં આવ્યો છે. રસ ધરાવતા દરેક એક્ડીસોન માટે ટોચનો વિસ્તાર મચ્છરોની સંખ્યા દ્વારા ગણવામાં આવ્યો હતો અને સામાન્ય કરવામાં આવ્યો હતો. એક્ડીસોનને નીચે મુજબ રંગ દ્વારા દર્શાવવામાં આવે છે: E, લીલો; 20E, નારંગી; 20E22P, જાંબલી; 3D20E, વાદળી; 3D20E22P, ગુલાબી. ઇનસેટ નીચા એક્ડીસોન સ્તરો બતાવવા માટે y-અક્ષ પર સ્કેલ વધારે છે.
સમાગમ દરમિયાન 3D20E22P અને 3D20E ટ્રાન્સફર થાય છે કે કેમ તેની તપાસ કરવા માટે, અમે સમાગમ પછી વિવિધ સમયે માદા LRTs નું વિચ્છેદન કર્યું. જોકે કુમારિકાઓમાં ecdysone જોવા મળ્યું ન હતું, અમે સમાગમ પછી તરત જ LRT માં 3D20E22P ની નોંધપાત્ર માત્રા (0.5 કલાક પછી સમાગમ, hpm) જોઈ, જે સમય જતાં ઘટતી ગઈ, જ્યારે 3D20E સ્તર નોંધપાત્ર રીતે વધ્યું (આકૃતિ 1). રાસાયણિક રીતે સંશ્લેષિત 3D20E ને ધોરણ તરીકે ઉપયોગ કરીને, અમે નક્કી કર્યું કે સમાગમ LRTs માં આ સ્ટીરોઈડ હોર્મોનનું સ્તર 20E કરતા ઓછામાં ઓછું 100 ગણું વધારે હતું (વિસ્તૃત ડેટા કોષ્ટક 1). આમ, 3D20E22P એ મુખ્ય પુરુષ ecdysone છે જે સમાગમ દરમિયાન માદા LRT માં ટ્રાન્સફર થાય છે, અને તેનું ડિફોસ્ફોરીલેટેડ સ્વરૂપ, 3D20E, સમાગમ પછી તરત જ ખૂબ જ વિપુલ પ્રમાણમાં બને છે. આ માદા સમાગમ પછીના જીવવિજ્ઞાનમાં બાદમાં ecdysone માટે મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા સૂચવે છે.
કસ્ટમ-બિલ્ટ બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ પાઇપલાઇનનો ઉપયોગ કરીને, એક નવું RNA સિક્વન્સિંગ (RNA-seq) ડેટાસેટ (આકૃતિ 2a) જનરેટ કર્યા પછી, અમે ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO) અને ecdysone એન્કોડિંગ 20E-સંશોધિત ફોસ્ફેટેઝ જનીન શોધ્યું. EPP) પ્રજનન પેશીઓમાં વ્યક્ત થાય છે. અમે એક ઉમેદવાર EPP જનીન અને બે સંભવિત EcK જનીનો (EcK1 અને EcK2) ઓળખ્યા, પરંતુ સારા ઉમેદવાર EO જનીન શોધી શક્યા નહીં. નોંધપાત્ર રીતે, વ્યક્તિગત EPP જનીનો ગેમ્બિયન MAGs માં ઉચ્ચ સ્તરે (98.9મા ટકાવારી) વ્યક્ત કરવામાં આવ્યા હતા પરંતુ સ્ત્રી LRTs (આકૃતિ 2b) માં નહીં, કારણ કે આ સ્ત્રી પેશીઓમાં 3D20E22P નું ડિફોસ્ફોરાયલેશન થયું હોવાથી અમારી અપેક્ષાઓથી વિપરીત. તેથી, અમે માનીએ છીએ કે પુરુષ EPP સમાગમ દરમિયાન સ્થાનાંતરિત થઈ શકે છે. ખરેખર, અમે સમાગમ પછી સ્ત્રી પ્રોટીનને માસ્ક કરવા માટે ઇન વિવો સ્ટેબલ આઇસોટોપ લેબલિંગનો ઉપયોગ કર્યો, સ્ત્રી કર્ણકમાં MS દ્વારા ઓળખાયેલ એન્ઝાઇમ (આકૃતિ 2c અને પૂરક કોષ્ટક) 1). MAG અને સંવનન પામેલી (પરંતુ કુંવારી નહીં) સ્ત્રી LRT માં EPP ની હાજરીની પુષ્ટિ ચોક્કસ એન્ટિબોડીઝ (આકૃતિ 2d) નો ઉપયોગ કરીને પણ કરવામાં આવી હતી.
a, EcKs, EOs અને EPPs ને એન્કોડ કરતા જનીનો માટે દરેક લિંગના પ્રજનન પેશીઓ શોધવા માટે એક કસ્ટમ-બિલ્ટ બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ પાઇપલાઇન. તીરની બાજુમાં આપેલા નંબરો દરેક પગલા પર પુરુષ અને સ્ત્રી ઉમેદવારોની સંખ્યા દર્શાવે છે. આ વિશ્લેષણમાં એક EPP જનીન (EPP) અને એક EcK જનીન (EcK1) ઓળખવામાં આવ્યું છે જે પુરુષોમાં વ્યક્ત થાય છે, અને એક EcK જનીન (EcK2) જે બંને જાતિઓમાં વ્યક્ત થાય છે પરંતુ ઉમેદવાર EO જનીન ઉત્પન્ન કરતું નથી.b, હીટમેપ વર્જિન (V) અને સમાગમ (M) એનોફિલિસ ગેમ્બિયા અને એનોફિલિસ આલ્બિકન્સ પેશીઓમાં ઉમેદવાર જનીન અભિવ્યક્તિની તુલના કરે છે.Spca, ગર્ભાધાન; MAGs, પુરુષોમાં સહાયક ગ્રંથીઓ; શરીરના અન્ય ભાગો, જેમાં સ્તન, પાંખો, પગ, ચરબીયુક્ત શરીર અને બંને જાતિના આંતરિક અવયવો અને સ્ત્રીઓમાં અંડાશયનો સમાવેશ થાય છે. EcK2 ગામ્બિયાના MAG અને એટ્રિયા બંનેમાં ખૂબ જ વ્યક્ત થાય છે, જ્યારે EPP ફક્ત MAG માં જોવા મળે છે.c, પુરુષ સ્ખલન જૂથના સ્ત્રી એટ્રિયામાં સ્થાનાંતરણનું પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ 3, 12 અને 24 hpm પર, જે 67 સૌથી વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં પ્રોટીન દર્શાવે છે. સ્ત્રીઓને બધા પ્રોટીનને લેબલ (અને માસ્ક) કરવા માટે 15N ધરાવતા આહાર પર ઉછેરવામાં આવ્યા હતા. ટેગ ન કરેલા પુરુષોને ટેગ કરેલી સ્ત્રીઓ સાથે સમાગમ કરવામાં આવ્યો હતો, અને પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ માટે સ્ત્રી LRT ને 3, 12 અને 24 hpm પર વિચ્છેદિત કરવામાં આવ્યા હતા (સ્ખલન પ્રોટીનની સંપૂર્ણ સૂચિ માટે પૂરક કોષ્ટક 1 જુઓ). આ પેશીઓના પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ દ્વારા કુંવારી પુરુષોના MAG માં ઇનસેટ, EPP, Eck1 અને EcK2 શોધી કાઢવામાં આવ્યા હતા.d, MAG માં વેસ્ટર્ન બ્લોટ અને સંવનન કરાયેલ સ્ત્રીઓના LRT દ્વારા EPP શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું, પરંતુ કુંવારી સ્ત્રીઓ અથવા પુરુષો અથવા બાકીની સ્ત્રીઓમાં નહીં. શરીર. પટલની એક સાથે એન્ટિ-એક્ટિન (લોડિંગ કંટ્રોલ) અને એન્ટિ-EPP એન્ટિબોડીઝ સાથે તપાસ કરવામાં આવી હતી. બધા પુરુષો કુંવારા છે. જેલ સ્ત્રોત ડેટા માટે પૂરક આકૃતિ 1 જુઓ. સમાન પરિણામો સાથે વેસ્ટર્ન બ્લોટ્સ બે વાર કરવામાં આવ્યા હતા.
MAG (વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 2a) થી અલગ કરાયેલ 3D20E22P સાથે HPLC-MS/MS દ્વારા ઇન્ક્યુબેશન પછી EPP ની એકડિસ્ટેરોઇડ ફોસ્ફોફોસ્ફેટેઝ પ્રવૃત્તિ ચકાસવામાં આવી હતી. વધુમાં, જ્યારે અમે RNA-મધ્યસ્થી હસ્તક્ષેપ (RNAi) દ્વારા EPP ને શાંત કર્યું, ત્યારે અમને આ પુરુષોના પ્રજનન પેશીઓમાં ફોસ્ફેટેઝ પ્રવૃત્તિમાં મજબૂત ઘટાડો જોવા મળ્યો (આકૃતિ 3a), અને EPP-શાંત પુરુષો સાથે સમાગમ કરતી સ્ત્રીઓએ આંશિક જનીન શાંત હોવા છતાં ડિફોસ્ફોરીલેટેડ 3D20E (આકૃતિ 3b) નું ઓછું પ્રમાણ દર્શાવ્યું (વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 2b,c). તેનાથી વિપરીત, અમને સમાન મચ્છરોમાં 20E22P/20E ગુણોત્તરમાં નોંધપાત્ર ફેરફારો જોવા મળ્યા નથી, જે સૂચવે છે કે એન્ઝાઇમ 3D20E22P (આકૃતિ 3b) માટે વિશિષ્ટ છે.
a, ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ EPP RNA (dsEPP) અથવા ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ GFP RNA (dsGFP) નિયંત્રણોનો ઉપયોગ કરીને EPP મૌન થવાને કારણે MAG માં ફોસ્ફેટેઝ પ્રવૃત્તિમાં ઘટાડો થયો. દરેક પ્રતિકૃતિમાં વીસ MAG પૂલનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો (P = 0.0046, જોડી કરેલ ટી-ટેસ્ટ, બે-બાજુ), જે અલગ બિંદુઓ દ્વારા રજૂ થાય છે. b, EPP-સાયલન્સ્ડ પુરુષો સાથે સમાગમ કરતી સ્ત્રીઓમાં 3 hpm (P = 0.0043, જોડી વગરનો ટી-ટેસ્ટ, બે-બાજુ) પર ડિફોસ્ફોરીલેટેડ 3D20E નું પ્રમાણ નોંધપાત્ર રીતે ઓછું હતું, જ્યારે 20E સ્તરો અપ્રભાવિત હતા (P = 0.063, જોડી વગરનો). t-પરીક્ષણ, બે-બાજુવાળા). ૧૩, ૧૬ અને ૧૯ માદાઓના ત્રણ પૂલમાંથી ડેટા સરેરાશ ± સેમ તરીકે રજૂ કરવામાં આવ્યો છે. c, EPP-શાંત પુરુષો સાથે સમાગમ કરતી સ્ત્રીઓમાં પુનઃ સમાગમનો દર નોંધપાત્ર રીતે વધારે હતો (P = 0.0002, ફિશરનો ચોક્કસ પરીક્ષણ, બે-બાજુવાળા). સ્ત્રીઓને તેમની સમાગમની સ્થિતિ સુનિશ્ચિત કરવા માટે સૌપ્રથમ સમાગમ કરવાની ફરજ પાડવામાં આવી હતી; 2 દિવસ પછી, ટ્રાન્સજેનિક શુક્રાણુ ધરાવતા અન્ય પુરુષો સાથે તેમનો સંપર્ક કરવામાં આવ્યો જેથી ટ્રાન્સજીનના જથ્થાત્મક પીસીઆર શોધ દ્વારા પુનઃસંવનન દરનું મૂલ્યાંકન કરી શકાય. ડી, EPP-શાંત પુરુષો સાથે સંવનન કરતી રક્ત-પીતી સ્ત્રીઓએ પ્રજનનક્ષમતામાં નોંધપાત્ર ઘટાડો કર્યો હતો (P < 0.0001; માન-વ્હીટની પરીક્ષણ, બે-બાજુ) અને ઇંડાની સંખ્યામાં થોડો ઘટાડો થયો હતો (P = 0.088, માન-વ્હીટની પરીક્ષણ, બે-બાજુ), જ્યારે સ્પાવિંગ દર પર કોઈ અસર થઈ ન હતી (P = 0.94, ફિશરનો ચોક્કસ પરીક્ષણ, બે-બાજુ). બધા પેનલમાં, n જૈવિક રીતે સ્વતંત્ર મચ્છર નમૂનાઓની સંખ્યા દર્શાવે છે.NS, નોંધપાત્ર નથી.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
આગળ, અમે મૂલ્યાંકન કર્યું કે સ્ત્રીઓમાં સમાગમ પ્રતિકાર પ્રેરિત કરવા માટે એકડીસોન ડિફોસ્ફોરાયલેશન મહત્વપૂર્ણ છે કે કેમ. નોંધનીય છે કે, EPP-ક્ષતિગ્રસ્ત નર સાથે સમાગમ કરતી સ્ત્રીઓ વધારાના (ટ્રાન્સજેનિક) નર (આકૃતિ 3c) ના સંપર્કમાં આવતા નિયંત્રણ માદા (10.4%) કરતા ઘણી વધારે આવર્તન (44.9%) પર ફરીથી સમાગમ કરતી હતી. અમે પ્રજનનક્ષમતામાં નોંધપાત્ર ઘટાડો (આકૃતિ 3d, ડાબે) અને આ માદાઓ દ્વારા મુકવામાં આવેલા ઇંડાની સંખ્યામાં થોડો ઘટાડો (આકૃતિ 3d, મધ્યમાં) પણ જોયો, જ્યારે માદાઓ દ્વારા મુકવામાં આવેલા ઇંડાની ટકાવારી (સગપણ દ્વારા માદાઓમાં ઉત્પન્ન થતી બીજી પ્રતિક્રિયા)) પ્રભાવિત થઈ ન હતી (આકૃતિ 3d, જમણે). 3D20E22P માટે EPP ની અવલોકન કરેલ વિશિષ્ટતાને જોતાં, આ પરિણામો સૂચવે છે કે સમાગમ દરમિયાન સ્થાનાંતરિત EPP દ્વારા 3D20E નું સક્રિયકરણ વધુ સમાગમ માટે માદા ગ્રહણશીલતાને બંધ કરવામાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવી શકે છે, જે વર્તન અગાઉ 20E ના જાતીય સ્થાનાંતરણને આભારી હતું. તેથી, આ પુરુષ-વિશિષ્ટ હોર્મોન સ્ત્રી પ્રજનનક્ષમતાને પણ મજબૂત રીતે અસર કરે છે.
આગળ, અમે રાસાયણિક રીતે સંશ્લેષિત 3D20E (આકૃતિ 4a–c) અને વ્યાપારી રીતે ઉપલબ્ધ 20E નો ઉપયોગ કરીને જાતીય રીતે પરિપક્વ કુમારિકાઓમાં ઇન્જેક્શન પ્રયોગોમાં 20E અને 3D20E ની પ્રવૃત્તિઓની તુલના કરી. અમે અવલોકન કર્યું કે 3D20E બંને સાંદ્રતામાં સમાગમ પ્રત્યે સ્ત્રી સંવેદનશીલતાને બંધ કરવામાં 20E કરતાં નોંધપાત્ર રીતે વધુ અસરકારક હતું (આકૃતિ 4d). નોંધપાત્ર રીતે, LRT માં 3D20E ના અડધા શારીરિક સ્તર (1,066 pg પોસ્ટ-ઇન્જેક્શન વિરુદ્ધ 2,022 pg પોસ્ટ-ઇન્જેક્શન) એ પ્રત્યાવર્તનશીલ સ્ત્રીઓનું પ્રમાણ પ્રેરિત કર્યું જે 24 કલાક પછી 18 pg પોસ્ટ-ઇન્જેક્શન પર ઇન્જેક્શન પછી 20E (361 pg પોસ્ટ-ઇન્જેક્શન) ના શારીરિક સ્તર કરતા 20 ગણું વધારે હતું; વિસ્તૃત ડેટા કોષ્ટક 1). આ પરિણામ એ ખ્યાલ સાથે સુસંગત છે કે 20E ના જાતીય સ્થાનાંતરણથી સમાગમના પ્રત્યાવર્તન સમયગાળા થતા નથી, અને માતાપિતા-બાળક સંબંધ સુનિશ્ચિત કરવામાં 3D20E એક મુખ્ય પરિબળ તરીકે આગળ નિર્દેશ કરે છે. કુંવારી સ્ત્રીઓમાં ઇંડા મૂકવાના પરીક્ષણોમાં 3D20E 20E કરતાં નોંધપાત્ર રીતે વધુ સક્રિય હતું (આકૃતિ 4e), જે સૂચવે છે કે આંશિક EPP મૌન પછી અમે જે સામાન્ય ઇંડા મૂકવાનો દર જોયો તે સમાગમ-પ્રેરિત સ્ત્રી પરિબળો દ્વારા ઉત્પાદિત અવશેષ 3D20E પ્રવૃત્તિની હાજરીને કારણે હતો.
(a,b) 20E (a) માંથી રાસાયણિક રીતે સંશ્લેષિત 3D20E ખૂબ જ ઉચ્ચ રૂપાંતરણ/કાર્યક્ષમતા સાથે (ત્રણ સ્વતંત્ર સંશ્લેષણ પ્રતિક્રિયાઓમાંથી સરેરાશ ± સેમ તરીકે રજૂ કરાયેલ ડેટા) (b).c, માસ સ્પેક્ટ્રમ (નીચલું અડધું) સંવનન કરાયેલ સ્ત્રી LRT (ટોચનું અડધું) માં મળેલા એકડીસોન સાથે બરાબર મેળ ખાય છે.d, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; ફિશરનું ચોક્કસ પરીક્ષણ, બે-બાજુવાળા) અને 10% ઇથેનોલ (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; ફિશરનું ચોક્કસ પરીક્ષણ, 2-બાજુવાળા) ની તુલનામાં, જ્યારે 20E ફક્ત ઉચ્ચ ડોઝ પર નિયંત્રણ કરતાં નોંધપાત્ર રીતે વધારે હતું (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; ફિશરનું ચોક્કસ પરીક્ષણ, 2-બાજુવાળા).e, 3D20E ઇન્જેક્શન 10% ઇથેનોલ નિયંત્રણો (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; ફિશરનો ચોક્કસ પરીક્ષણ, બે-બાજુવાળા) કરતાં કુંવારી સ્ત્રીઓમાં નોંધપાત્ર રીતે વધુ સ્પાવિંગ દર પ્રેરિત કરે છે, જ્યારે 20E નિયંત્રણોની તુલનામાં માત્ર ઉચ્ચ ડોઝ પર (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; ફિશરનો ચોક્કસ પરીક્ષણ, બે-બાજુવાળા).3D20E ઉચ્ચ ડોઝ પર 20E કરતા નોંધપાત્ર રીતે વધુ સ્પાવિંગ દર પ્રેરિત કરે છે (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; ફિશરનો ચોક્કસ પરીક્ષણ, બે-બાજુવાળા). બધા પેનલમાં, n જૈવિક રીતે સ્વતંત્ર મચ્છર નમૂનાઓની સંખ્યા દર્શાવે છે.NS, નોંધપાત્ર નથી.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. ડેટા ત્રણ પ્રતિકૃતિઓમાંથી લેવામાં આવ્યો છે.
અગાઉના અભ્યાસોમાં, અમે નક્કી કર્યું હતું કે સ્ટીરોઈડ હોર્મોન્સનું જાતીય ટ્રાન્સફર MISO (મેટિંગ-ઈન્ડ્યુસ્ડ સ્ટીમ્યુલેટર ઓફ ઓજેનેસિસ 11) ની અભિવ્યક્તિને પ્રેરિત કરે છે, જે સ્ત્રી પ્રજનન જનીન છે જે A. ગેમ્બિયા માદાઓને P. ફાલ્સીપેરમ ચેપથી રક્ષણ આપે છે. 13 દ્વારા થતા આરોગ્ય ખર્ચ, જે સૌથી ઘાતક માનવ મેલેરિયા પરોપજીવી છે. મેલેરિયા-સ્થાનિક વિસ્તારોમાં એનોફિલિસની પ્રજનન યોગ્યતા માટે MISO ના મહત્વને ધ્યાનમાં રાખીને, અમે નક્કી કરવાનું નક્કી કર્યું કે કયો હોર્મોન 3D20E અથવા 20E આ જનીનની અભિવ્યક્તિને ટ્રિગર કરે છે. અમે જોયું કે જ્યારે 20E ઇન્જેક્શન ખાસ કરીને અથવા વધુ શક્તિશાળી રીતે કેટલાક ન્યુક્લિયર હોર્મોન રીસેપ્ટર્સ (HR), જેમ કે HR3 અને HR4, અને લાક્ષણિક ડાઉનસ્ટ્રીમ સ્ટીરોઈડ લક્ષ્યો, જેમ કે યોલ્કોજેનિક જનીનો Vg14, 15, 16, MISO વધુ મજબૂત રીતે 3D20E (વિસ્તૃત ડેટા ફિગ. 3) દ્વારા પ્રેરિત કરવામાં આવ્યું હતું. આમ, આ એન્ડ્રોજેનિક સ્ટીરોઈડ હોર્મોનનું જાતીય ટ્રાન્સફર એવી પદ્ધતિઓને પ્રેરિત કરે છે જે પરોપજીવી ચેપ દ્વારા થતા ખર્ચથી સ્ત્રીઓને રક્ષણ આપે છે. વધુમાં, 3D20E E રીસેપ્ટર EcR ના બંને આઇસોફોર્મ્સને અલગ રીતે અસર કરે છે, EcR-A ને પ્રેરિત કરે છે અને EcR-B ને દબાવી દે છે, અને HPX15 સહિત અન્ય સમાગમ-પ્રેરિત જનીનોને વધુ મજબૂત રીતે ઉત્તેજિત કરે છે, જે સ્ત્રી પ્રજનનક્ષમતાને અસર કરે છે. આ EPP-શાંત પુરુષો સાથે સમાગમ કરતી સ્ત્રીઓમાં જોવા મળતી નોંધપાત્ર વંધ્યત્વને સમજાવી શકે છે (વિસ્તૃત ડેટા ફિગ. 3). આ ડેટા સૂચવે છે કે બે એક્ડીસોન હોર્મોન્સ દ્વારા પ્રાધાન્ય રીતે સક્રિય કરાયેલા ડાઉનસ્ટ્રીમ માર્ગોનું અસ્તિત્વ છે જે લૈંગિક-વિશિષ્ટ કાર્યને આધાર આપી શકે છે.
આગળ, અમે અમારી બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ પાઇપલાઇનમાં ઓળખાયેલા બે EcK જનીનોના કાર્યનું પરીક્ષણ કર્યું. EcK1 અથવા EcK2 ને શાંત કરવાથી પુરુષોમાં નોંધપાત્ર મૃત્યુદર થયો (વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 4a), જે સૂચવે છે કે ecdysone ફોસ્ફોરાયલેશન, અને તેથી નિષ્ક્રિયતા, અસ્તિત્વ માટે મહત્વપૂર્ણ છે. કારણ કે EcK2 EcK1 કરતા ઊંચા સ્તરે વ્યક્ત થયું હતું અને પ્રોટીઓમિક્સ દ્વારા MAGs માં શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું (આકૃતિ 2b,c અને પૂરક કોષ્ટક 2), અમે તેની ecdysteroid kinase પ્રવૃત્તિને 20E સાથે ઇન્ક્યુબેટ કરીને માન્ય કરી, જેના પરિણામે ફોસ્ફોરાયલેશન 20E22P (વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 2).4b). 3D20E ને સબસ્ટ્રેટ તરીકે ઉપયોગ કરતી વખતે, અમે ફોસ્ફોરાયલેટેડ ઉત્પાદન 3D20E22P (વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 4c) શોધી શક્યા નહીં, જે સૂચવે છે કે 3D20E ને બદલે 20E EcK2 નું પસંદગીનું લક્ષ્ય હોઈ શકે છે.
અમારા RNA-seq વિશ્લેષણ મુજબ, કુંવારી સ્ત્રીઓના LRT માં EcK2 પણ ખૂબ જ વ્યક્ત થયું હતું, જ્યાં તે સમાગમ પછી બંધ થઈ ગયું હતું (આકૃતિ 2b). અમે આ ડેટાની પુષ્ટિ કરી અને નક્કી કર્યું કે EcK2 અભિવ્યક્તિ રક્ત ખોરાકથી પ્રભાવિત થઈ નથી (વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 5a). અમારા પ્રારંભિક MS પ્રયોગોને વિસ્તૃત કરીને, અમે નક્કી કર્યું કે 20E22P ની ટોચ 20E ની ટોચ સાથે નજીકથી સંબંધિત હતી (રક્ત ભોજન પછી 22-26 કલાક; વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 5b). કુંવારી સ્ત્રીઓમાં EcK2 ને મૌન રાખવાથી રક્ત ભોજન પછી 26 કલાકમાં 20E થી 20E22P ના સંબંધિત ગુણોત્તરમાં 3 ગણો વધારો થયો (વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 2c અને 5c), પુષ્ટિ કરે છે કે EcK2 સ્ત્રીઓમાં 20E ને ફોસ્ફોરીલેટ પણ કરે છે. નોંધપાત્ર રીતે, EcK2-ક્ષતિગ્રસ્ત કુંવારી સ્ત્રીઓએ સંપૂર્ણ જાતીય ગ્રહણશીલતા જાળવી રાખી છે (વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 5d,e), આગળ સૂચવે છે કે 20E નું સ્ત્રી ઉત્પાદન સમાગમ પ્રત્યાવર્તન પ્રેરિત કરતું નથી પીરિયડ્સ.જોકે, આ માદાઓમાં નિયંત્રણોની તુલનામાં ઇંડા મૂકવાના દરમાં નોંધપાત્ર વધારો થયો હતો, જેમાં 30% થી વધુ કુમારિકાઓ ઇંડા મૂકે છે (વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 5f). જો રક્તદાન પછી ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ Eck2 RNA (dsEcK2) ઇન્જેક્શન આપવામાં આવ્યા હતા, તો સ્પાવિંગ થયું ન હતું, તે સમયે રક્તદાનને કારણે 20E પીક ઘટ્યું હતું.એકંદરે, આ પરિણામો એક મોડેલને સમર્થન આપે છે કે રક્તદાન પછી ઉત્પન્ન થયેલ 20E સ્પાવિંગને પ્રેરિત કરી શકે છે, પરંતુ ત્યારે જ જ્યારે સ્પાવિંગ બ્લોક (EcK2 અને કદાચ અન્ય પરિબળો) સમાગમ દ્વારા બંધ કરવામાં આવે છે. 20E કે 3D20E ઇન્જેક્શન કુમારિકાઓમાં EcK2 અભિવ્યક્તિને અટકાવતા નહોતા (વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 5g), જે સૂચવે છે કે અન્ય પરિબળો આ કિનેઝના અવરોધમાં મધ્યસ્થી કરે છે.જોકે, રક્તદાન પછી 20E સ્તર સમાગમની અગવડતા લાવવા માટે પૂરતા ન હતા, પરંતુ સેક્સ્યુઅલી ટ્રાન્સફર થયેલ 3D20E ના ઉચ્ચ ટાઇટર્સ દ્વારા અસરકારક રીતે ટ્રિગર થયા હતા.
અમારા પરિણામો A. gambiae ની પ્રજનન સફળતાને નિયંત્રિત કરતી પદ્ધતિઓમાં મહત્વપૂર્ણ આંતરદૃષ્ટિ પ્રદાન કરે છે. એક મોડેલ ઉભરી આવ્યું છે જ્યાં નર 3D20E ના ઉચ્ચ ટાઇટર્સને સંશ્લેષણ કરવા માટે વિકસિત થયા છે, એક પુરુષ-વિશિષ્ટ સંશોધિત એકડીસોન જે માદાઓને વધુ સમાગમ માટે અસંવેદનશીલ બનાવીને પિતૃત્વની ખાતરી આપે છે. તે જ સમયે, આ મેલેરિયા વેક્ટરોએ પુરુષ-વિશિષ્ટ EPP ના જાતીય સ્થાનાંતરણના પ્રતિભાવમાં સ્ત્રીઓમાં 3D20E ને સક્રિય કરવા માટે એક કાર્યક્ષમ સિસ્ટમ પણ વિકસાવી છે. અમારા જ્ઞાન મુજબ, આ પુરુષ- અને સ્ત્રી-પ્રભુત્વ ધરાવતી સ્ટીરોઈડ હોર્મોન સિસ્ટમનું પ્રથમ ઉદાહરણ છે જે જંતુઓમાં એક અનન્ય અને મહત્વપૂર્ણ કાર્ય કરે છે. પુરુષ-વિશિષ્ટ એકડીસોન કાર્યને અનુમાનિત કરવામાં આવ્યું છે પરંતુ નિશ્ચિતપણે દર્શાવવામાં આવ્યું નથી. ઉદાહરણ તરીકે, મોટાભાગે ખોટા સાબિત થયેલા પૂર્વધારણા 18 એ છે કે આ કાર્યો 20E પુરોગામી E1 દ્વારા કરી શકાય છે. તે જાણીતું છે કે ડ્રોસોફિલામાં, મોનાન્ડ્રી નાના સેક્સ પેપ્ટાઇડ્સ 19,20 ના જાતીય સ્થાનાંતરણ દ્વારા શરૂ થાય છે જે ચોક્કસ સેક્સ પેપ્ટાઇડ રીસેપ્ટર્સ 21,22 દ્વારા માદા પ્રજનન માર્ગને ઉત્તેજિત કરતા ચેતાકોષો સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે. વધુ કાર્ય છે A. gambiae માદાઓમાં 3D20E દ્વારા નિયંત્રિત ડાઉનસ્ટ્રીમ સિગ્નલિંગ કેસ્કેડ નક્કી કરવા અને મચ્છર અને ડ્રોસોફિલા વચ્ચે આ કેસ્કેડનું સંરક્ષણ કરી શકાય છે કે કેમ તે નક્કી કરવા માટે જરૂરી છે.
અમારા અભ્યાસમાં ઓળખાયેલ સ્ત્રી પ્રજનનક્ષમતા અને વર્તન પર 3D20E ની મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકાને ધ્યાનમાં રાખીને, 3D20E સંશ્લેષણ અને સક્રિયકરણ તરફ દોરી જતા માર્ગો ભવિષ્યના મચ્છર નિયંત્રણ વ્યૂહરચનાઓ માટે નવી તકો પ્રદાન કરે છે, જેમ કે જંતુરહિત જંતુ ટેકનોલોજી વ્યૂહરચનાઓ માં સ્પર્ધાત્મક જંતુરહિત નરનું ઉત્પાદન જંગલી મુક્તિ માટે ઉપયોગ કરો અથવા કુંવારી રમતમાં 3D20E નું અનુકરણ કરો. 3D20E નું પુરુષ-વિશિષ્ટ કાર્ય ત્યારે વિકસિત થયું હશે જ્યારે A. gambiae અને અન્ય Cellia પ્રજાતિઓએ તેમના વીર્યને સમાગમ પ્લગમાં જમા કરવાની ક્ષમતા પ્રાપ્ત કરી, કારણ કે આ મોટી સંખ્યામાં હોર્મોન્સ અને હોર્મોન-સક્રિય કરનારા ઉત્સેચકોના કાર્યક્ષમ સ્થાનાંતરણને મંજૂરી આપે છે. બદલામાં, 3D20E ઉત્ક્રાંતિ અમલીકરણ મોનાન્ડ્રી ઉચ્ચ મેલેરિયા વ્યાપ ધરાવતા વિસ્તારોમાં તેમની પ્રજનન યોગ્યતાને અનુકૂળ કરવા માટે માદાઓ (MISO ના ઉચ્ચ અભિવ્યક્તિ દ્વારા) માટે એક પદ્ધતિ પૂરી પાડે છે, જે પરોક્ષ રીતે પ્લાઝમોડિયમ ટ્રાન્સમિશનમાં ફાળો આપે છે. માદા 20E એ માદા એનોફિલિસ મચ્છરોમાં P. ફાલ્સીપેરમના અસ્તિત્વ અને વૃદ્ધિ પર ઊંડી અસર કરે છે તે જોતાં, 24 નર અને માદા બંને સ્ટીરોઈડ હોર્મોન માર્ગો હવે મચ્છર-પરોપજીવી ના મુખ્ય પાસાં છે. ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ.
A. gambiae G3 જાતોને પ્રમાણભૂત જંતુઓની સ્થિતિમાં ઉછેરવામાં આવ્યા હતા (26-28 °C, 65-80% સાપેક્ષ ભેજ, 12:12 કલાક પ્રકાશ/ઘેરો ફોટોપીરિયડ). લાર્વાને પાઉડર માછલીનો ખોરાક (ટેટ્રામિન ટ્રોપિકલ ફ્લેક્સ, કોઈ પેલેટ્સ અને ટેટ્રા પોન્ડ સ્ટિક્સ 7:7:2 ના ગુણોત્તરમાં) ખવડાવવામાં આવ્યા હતા. પુખ્ત મચ્છરોને એડ લિબિટમ 10% ડેક્સ્ટ્રોઝ સોલ્યુશન અને સાપ્તાહિક માનવ રક્ત (રક્ત ઘટકોનો અભ્યાસ કરો) ખવડાવવામાં આવ્યા હતા. માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા છેડાની તપાસ કર્યા પછી પ્યુપલ તબક્કામાં જાતિઓને અલગ કરીને વર્જિન મચ્છર મેળવવામાં આવ્યા હતા. DsRed ટ્રાન્સજીન ધરાવતા નરનું અગાઉ વર્ણન કરવામાં આવ્યું છે.
અગાઉ વર્ણવેલ પ્રોટોકોલ અનુસાર બળજબરીથી સમાગમના પ્રયોગો કરવામાં આવ્યા હતા. કુદરતી સમાગમ માટે, 4 દિવસની કુંવારી માદાઓને બે રાત માટે જાતીય રીતે પરિપક્વ કુંવારી નર સાથે 1:3 ના ગુણોત્તરમાં રાખવામાં આવી હતી. એવા પ્રયોગો માટે જેમાં નરોને dsEPP નું ઇન્જેક્શન આપવામાં આવ્યું હતું, કો-કેજિંગ ઇન્જેક્શન પછીના 3-4 દિવસો સાથે સુસંગત હતું, જ્યારે ફોસ્ફેટેઝ પ્રવૃત્તિ મહત્તમ રીતે શાંત કરવામાં આવી હતી (વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 2b).
મચ્છરના પેશીઓ, બાકીના મૃતદેહ (શરીરનો બાકીનો ભાગ), અથવા આખા શરીરને 100% મિથેનોલમાં વિચ્છેદિત કરવામાં આવ્યા હતા અને બીડર (2 મીમી ગ્લાસ માળા, 2,400 rpm, 90 સેકન્ડ) સાથે એકરૂપ કરવામાં આવ્યા હતા. પેશીઓની માત્રા અને મિથેનોલનું પ્રમાણ નીચે મુજબ હતું: શરીરનો બાકીનો ભાગ, 1,000 µl માં 50; MAG, 50–100 80 µl; માદા LRT, 25–50 80 µl. મિથેનોલના સમાન જથ્થા સાથે અવક્ષેપને બીજા મિથેનોલ નિષ્કર્ષણને આધિન કરવામાં આવ્યું હતું. કોષના કાટમાળને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા દૂર કરવામાં આવ્યો હતો. બંને નિષ્કર્ષણમાંથી મિથેનોલને ભેળવીને નાઇટ્રોજન પ્રવાહ હેઠળ સૂકવવામાં આવ્યું હતું, પછી પાણીમાં 80% મિથેનોલના નીચેના જથ્થામાં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યું હતું: શરીરનો બાકીનો ભાગ, 50 µl; MAG અને માદા LRT, 30 µl.
નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર (ID-X, થર્મો ફિશર) પર LC સાધન (Vanquish, Thermo Fisher) સાથે જોડીને કરવામાં આવ્યું. 5 µl નમૂનાને 3 µm, 100 × 4.6 mm સ્તંભ (Inspire C8, Dikma) પર 25 °C પર રાખવામાં આવ્યા હતા. LC માટે મોબાઇલ તબક્કાઓ A (પાણી, 0.1% ફોર્મિક એસિડ) અને B (acetonitrile, 0.1% ફોર્મિક એસિડ) હતા. LC ગ્રેડિયન્ટ નીચે મુજબ હતું: 1 મિનિટ માટે 5% B, પછી 11 મિનિટમાં 100% B સુધી વધારીને. 100% પર 8 મિનિટ પછી, 4 મિનિટ માટે 5% B પર સ્તંભને ફરીથી સંતુલિત કરો. પ્રવાહ દર 0.3 ml min-1 હતો. MS સ્ત્રોતમાં આયનોઇઝેશન હકારાત્મક અને નકારાત્મક સ્થિતિમાં ગરમ ​​ઇલેક્ટ્રોસ્પ્રે આયનીકરણ દ્વારા પૂર્ણ થાય છે.
માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર 60,000 રિઝોલ્યુશન પર 350 થી 680 સુધીના m/z રેન્જમાં ડેટાને સંપૂર્ણ MS મોડમાં માપે છે. MS/MS ડેટા [M + H]+ (બધા લક્ષ્યો), [M - H2O + H]+ (બધા લક્ષ્યો), અને [M - H]- (ફોસ્ફોરીલેટેડ લક્ષ્યો) પર મેળવવામાં આવ્યો હતો. MS/MS ડેટાનો ઉપયોગ લક્ષ્યોના એક્ડીસોન ગુણધર્મોની પુષ્ટિ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો જેના માટે કોઈ ધોરણ ઉપલબ્ધ ન હતું. બિન-લક્ષિત એક્ડીસ્ટેરોઇડ્સને ઓળખવા માટે, 15% થી વધુ સંબંધિત વિપુલતા ધરાવતા તમામ HPLC શિખરો માટે MS/MS ડેટાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. શુદ્ધ ધોરણો (20E, 3D20E) માંથી બનાવેલા પ્રમાણભૂત વળાંકોનો ઉપયોગ કરીને એક ચોક્કસ નમૂના (અન્ય તમામ લક્ષ્યો) ની સંપૂર્ણ માત્રા અથવા મંદનની ગણતરી કરવા માટે ક્વોન્ટિફાઇ કરો જેથી એક પુરુષમાં જોવા મળતી માત્રાની સમકક્ષતા ગણતરી કરી શકાય. 3D20E માટે, નીચેના ઉમેરણોના સરવાળાનો ઉપયોગ કરીને ક્વોન્ટિફિકેશન કરવામાં આવ્યું હતું: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.ટ્રેસફાઇન્ડર (સંસ્કરણ 4.1) નો ઉપયોગ કરીને ડેટા કાઢવામાં આવ્યો અને તેનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવ્યું. Xcalibur (સંસ્કરણ 4.4) નો ઉપયોગ કરીને MS/MS ડેટાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. E, 20E અને 3D20E ના MS સ્પેક્ટ્રાની તુલના સંબંધિત ધોરણો સાથે કરવામાં આવી.3D20E22P નું વિશ્લેષણ ગિરાર્ડના રીએજન્ટ સાથે ડેરિવેટાઇઝેશન દ્વારા કરવામાં આવ્યું.20E22P નું વિશ્લેષણ m/z ગુણોત્તર દ્વારા કરવામાં આવ્યું.
3D20E22P ને MAG માંથી શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું. HPLC-MS/MS વિશ્લેષણ જેવી જ LC પરિસ્થિતિઓ હેઠળ ક્વાડ્રપોલ માસ-આધારિત ડિટેક્ટર (QDa, Acquity, Waters) સાથે અલ્ટ્રા-પર્ફોર્મન્સ લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફ (Acquity, Waters) નો ઉપયોગ કરીને વિશ્લેષણાત્મક સ્કેલ પર શુદ્ધિકરણ કરવામાં આવ્યું હતું. જ્યારે 3D20E22P ને અનુરૂપ m/z અગાઉ નક્કી કરેલા રીટેન્શન સમયે શોધી કાઢવામાં આવ્યું ત્યારે અપૂર્ણાંક સંગ્રહ શરૂ થયો. પછી ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ HPLC-MS/MS દ્વારા કાઢવામાં આવેલા સંયોજનોની શુદ્ધતા તપાસવામાં આવી.
ઉત્પાદકની સૂચનાઓનું પાલન કરીને TRI રીએજન્ટ (થર્મો ફિશર) નો ઉપયોગ કરીને 10-12 પ્રજનન પેશીઓ અથવા શરીરના અન્ય ભાગો (હેડલેસ) માંથી કુલ RNA કાઢવામાં આવ્યું હતું. RNA ને TURBO DNase (થર્મો ફિશર) થી સારવાર આપવામાં આવી હતી. ઉત્પાદકની સૂચનાઓનું પાલન કરીને મોલોની મુરિન લ્યુકેમિયા વાયરસ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ (M-MLV RT; થર્મો ફિશર) નો ઉપયોગ કરીને cDNA નું સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન ક્વોન્ટિટેટિવ ​​PCR (RT-qPCR; એક્સટેન્ડેડ ડેટા ટેબલ 2) માટેના પ્રાઈમર્સ અગાઉ પ્રકાશિત કરવામાં આવ્યા હતા24 અથવા પ્રાઈમર-BLAST26 નો ઉપયોગ કરીને ડિઝાઇન કરવામાં આવ્યા હતા, જેમાં 70-150 bp કદ અને એક્સોન-એક્સોન જંકશન અથવા પ્રાઈમર પેર પ્રાઈમર અલગ એક્સોન્સના ઉત્પાદનોને પ્રાધાન્ય આપવામાં આવ્યું હતું. ત્રણ થી ચાર જૈવિક પ્રતિકૃતિઓમાંથી cDNA નમૂનાઓ RT-qPCR માટે પાણીમાં ચાર ગણા પાતળા કરવામાં આવ્યા હતા. ક્વોન્ટિફિકેશન 1× PowerUp SYBR ગ્રીન માસ્ટર મિક્સ (થર્મો ફિશર), પ્રાઇમર્સ અને 5 µl પાતળું cDNA ધરાવતી 15 µl પ્રતિકૃતિ પ્રતિક્રિયાઓમાં કરવામાં આવ્યું હતું. પ્રતિક્રિયાઓ એક પર ચલાવવામાં આવી હતી ક્વોન્ટસ્ટુડિયો 6 પ્રો રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર સિસ્ટમ (થર્મો ફિશર) અને ડેટા ડિઝાઇન અને વિશ્લેષણ (સંસ્કરણ 2.4.3) નો ઉપયોગ કરીને એકત્રિત અને વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યા હતા. આ અભ્યાસમાં દર્શાવ્યા મુજબ, રિબોસોમલ જનીન RpL19 (AGAP004422) માં સંબંધિત માત્રાને સામાન્ય બનાવવામાં આવી હતી, જેની અભિવ્યક્તિ રક્ત ખોરાક 27 અથવા સમાગમ 3 સાથે નોંધપાત્ર રીતે બદલાઈ ન હતી.
એજિલેન્ટ બાયોએનાલિઝર 2100 બાયોએનાલિઝર (એજિલેન્ટ) નો ઉપયોગ કરીને RNA ગુણવત્તા તપાસવામાં આવી હતી. MIT અને હાર્વર્ડના બ્રોડ ઇન્સ્ટિટ્યૂટ ખાતે ઇલ્યુમિના જોડી-એન્ડ લાઇબ્રેરીઓ તૈયાર કરવામાં આવી હતી અને ચલાવવામાં આવી હતી. ડિફોલ્ટ પરિમાણો સાથે HISAT2 (સંસ્કરણ 2.0.5) નો ઉપયોગ કરીને A. gambiae જીનોમ (PEST સ્ટ્રેન, સંસ્કરણ 4.12) સાથે સિક્વન્સિંગ રીડ્સ ગોઠવવામાં આવ્યા હતા. સેમટૂલ્સ (સંસ્કરણ 1.3.1) નો ઉપયોગ કરીને મેપિંગ ગુણવત્તા (MAPQ) સ્કોર્સ <30 સાથે રીડ્સ દૂર કરવામાં આવ્યા હતા. ડિફોલ્ટ પરિમાણો સાથે htseq-count (સંસ્કરણ 0.9.1) નો ઉપયોગ કરીને જનીનો સાથે મેપ કરેલા રીડ્સની સંખ્યા ગણવામાં આવી હતી. R (સંસ્કરણ 4.0.3) માં DESeq2 પેકેજ (સંસ્કરણ 1.28.1) નો ઉપયોગ કરીને સામાન્ય વાંચન ગણતરીઓની ગણતરી કરવામાં આવી હતી અને વિભેદક જનીન અભિવ્યક્તિનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
PSI-BLAST અલ્ગોરિધમ (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) નો ઉપયોગ કરીને A. gambiae જીનોમ શોધીને Ecdysone-સંશોધિત જનીન ઉમેદવારોને ઓળખવામાં આવ્યા હતા, જેમાં ડિફોલ્ટ મૂલ્યોનો ઉપયોગ કરીને નીચેના ક્વેરી પ્રોટીન સિક્વન્સ સાથેના પરિમાણોનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો: Bombyx mori (Accession No. NP_001038956.1), Musca domestica (Accession No. XP_005182020.1, XP_005175332.1 અને XP_011294434.1) અને Microplitis demolitor (Accession No. XP_008552646.1 અને XP_008552645.1) માંથી EcK B. mori (Accession No. NP_001036900), Drosophila melanogaster (Accession No. NP_651202), એપિસ મેલીફેરા (એક્સેશન નં. XP_394838) અને એસિર્થોસિફોન પિસમ (એક્સેશન નં. XP_001947166); અને બી. મોરી (એક્સેશન નં. XP_001947166) NP_001177919.1 અને NP_001243996.1) અને ડી. મેલાનોગાસ્ટર (એક્સેશન નં. NP_572986.1) ના EO (પગલું 1) માંથી EPP. આગળ, ગેમ્બિયામાં પ્રજનન પેશીઓ (સ્ત્રી LRT અથવા MAG) માં ઉચ્ચ mRNA અભિવ્યક્તિ (> 100 ટુકડાઓ/કિલોબેઝ એક્સોન્સ પ્રતિ મિલિયન મેપ્ડ રીડ્સ (FPKM) અથવા >85%) પર આધારિત ફિલ્ટર હિટ (પગલું 2). વિશિષ્ટતા સુધારવા માટે, અમે ઉમેદવાર ઉત્સેચકો પસંદ કર્યા જે A. albimanus ના પ્રજનન પેશીઓમાં પણ વ્યક્ત થાય છે, જે એક એનોફિલિસ પ્રજાતિ છે જે સમાગમ દરમિયાન એકડીસોનનું સંશ્લેષણ અથવા સ્થાનાંતરણ કરતી નથી. ઉમેદવાર જનીનોને A. albimanus પ્રજનન પેશીઓ (પગલું 3) માં ઓછી અભિવ્યક્તિ (<100 FPKM અથવા <85th પર્સેન્ટાઇલ) ના આધારે ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યા હતા. અંતિમ ફિલ્ટર (પગલું 4) તરીકે, ઉમેદવાર જનીનોને નીચેનામાંથી ઓછામાં ઓછા એકને સંતોષવાની જરૂર છે: (1) સમાગમ પછી નોંધપાત્ર રીતે અપ-રેગ્યુલેટેડ (P < 0.05) વિભેદક રીતે વ્યક્ત જનીનોના વિશ્લેષણ અનુસાર અને (2) બિન-પ્રજનન પેશીઓમાં (< 85% અથવા < 100 FPKM).
અમે પહેલા વર્ણવેલ પદ્ધતિઓ 28,29,30 માં ફેરફાર કરીને સંપૂર્ણ જીવતંત્રના આઇસોટોપિક લેબલિંગ પ્રાપ્ત કર્યું. સંક્ષિપ્તમાં, જંગલી-પ્રકારના સેકરોમીસીસ સેરેવિસીયા પ્રકાર II (YSC2, સિગ્મા) નું પરીક્ષણ યીસ્ટ નાઇટ્રોજન બેઝ (BD Difco, DF0335) માં કરવામાં આવ્યું હતું જેમાં (wt/vol) 2% ગ્લુકોઝ (G7528, સિગ્મા), 1.7% એમિનો એસિડ-મુક્ત અને એમોનિયમ સલ્ફેટ. કલ્ચર માધ્યમ) અને 5% 15N એમોનિયમ સલ્ફેટ (NLM-713, >99%, કેમ્બ્રિજ આઇસોટોપ લેબોરેટરીઝ) નાઇટ્રોજનના એકમાત્ર સ્ત્રોત તરીકે હતા. યીસ્ટને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા પુનઃપ્રાપ્ત કરવામાં આવ્યું હતું અને મચ્છરના લાર્વાને પ્યુપેશન સુધી એડ લિબિટમ ખવડાવવામાં આવ્યા હતા. ચોથા તબક્કાના મૃત્યુદરને રોકવા માટે ફિશમીલ (300 લાર્વા દીઠ 0.5 મિલિગ્રામ) સાથે પૂરક. ત્યારબાદ સમાગમ દરમિયાન સ્થાનાંતરિત નર પ્રોટીઓમનું વિશ્લેષણ કરવા માટે લેબલ વગરના નર સાથે સમાગમ પ્રયોગોમાં ફક્ત માદાઓનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.
૪-૬ દિવસની ૧૫N-ટેગવાળી કુંવારી માદાઓને ઉંમર સાથે મેળ ખાતા અનટેગવાળા કુંવારી નર સાથે સમાગમ કરવાની ફરજ પાડવામાં આવી હતી. એપિફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોસ્કોપી હેઠળ સમાગમ પ્લગ શોધીને સફળ સમાગમ ચકાસવામાં આવ્યો હતો. ૩, ૧૨ અને ૨૪ hpm પર, ૪૫-૫૫ સમાગમવાળી માદાઓના એટ્રિયાને ૫૦ µl એમોનિયમ બાયકાર્બોનેટ બફર (pH ૭.૮) માં વિચ્છેદિત કરવામાં આવ્યા હતા અને પેસ્ટલ સાથે એકરૂપ કરવામાં આવ્યા હતા. હોમોજેનેટને સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું અને સુપરનેટન્ટને ૫૦ µl ૦.૧% રેપિજેસ્ટ (૧૮૬૦૦૧૮૬૦, વોટર્સ) ના ૫૦ µl સાથે ૫૦ mM એમોનિયમ બાયકાર્બોનેટમાં ભેળવવામાં આવ્યું હતું. દરેક નમૂનામાંથી સુપરનેટન્ટ અને પેલેટને સૂકા બરફ પર સ્નેપ ફ્રીઝ કરવામાં આવ્યા હતા અને રાતોરાત વોશિંગ્ટન યુનિવર્સિટી ખાતે મેકકોસ પ્રયોગશાળામાં મોકલવામાં આવ્યા હતા, જ્યાં LC-MS/MS માટે નમૂનાની તૈયારી પૂર્ણ થઈ હતી. ૫૦ µl ૦.૧% રેપિજેસ્ટના ૫૦ µl માં પેલેટને ફરીથી સસ્પેન્ડ કરો. પાણીના સ્નાનમાં એમોનિયમ બાયકાર્બોનેટ અને સોનિકેટ. પેલેટ અને સુપરનેટન્ટની પ્રોટીન સાંદ્રતા BCA પરીક્ષણ દ્વારા માપવામાં આવી હતી, નમૂનાઓને 5 mM ડાયથિઓથ્રેઇટોલ (DTT; સિગ્મા) સાથે ઘટાડવામાં આવ્યા હતા, 15 mM આયોડોએસેટામાઇડ (સિગ્મા) સાથે આલ્કાઇલેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા અને ટ્રિપ્સિનાઇઝેશન સાથે 1 કલાક માટે 37 °C (1:0 50) પર ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા: ટ્રિપ્સિન: સબસ્ટ્રેટ રેશિયો). રેપિજેસ્ટને 200 mM HCl ઉમેરીને લિઝ કરવામાં આવ્યું હતું, ત્યારબાદ 45 મિનિટ માટે 37 °C પર ઇન્ક્યુબેશન અને કાટમાળ દૂર કરવા માટે 4 °C પર 10 મિનિટ માટે 14,000 rpm પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન કરવામાં આવ્યું હતું. નમૂનાઓને ડ્યુઅલ-મોડ સોલિડ-ફેઝ એક્સટ્રેક્શન (ઓએસિસ MCX કારતુસ, વોટર્સ) દ્વારા ધોવામાં આવ્યા હતા અને 0.33 µg µl-1 ની અંતિમ પ્રોટીન સાંદ્રતા માટે 0.1% ફોર્મિક એસિડમાં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા. લેબલ વગરના MAG પ્રોટીઓમ્સનું કુંવારી પુરુષોમાંથી સમાન રીતે વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. બે દરેક નમૂના માટે વિશ્લેષણાત્મક પ્રતિકૃતિઓનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. આગળ, દરેક નમૂનાના 1 µg નું વિશ્લેષણ 25-cm ફ્યુઝ્ડ સિલિકા 75-μm કોલમનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું જેમાં 4-cm ફ્યુઝ્ડ સિલિકા Kasil1 (PQ) ફ્રિટ ટ્રેપ હતું જે Jupiter C12 રિવર્સ્ડ-ફેઝ રેઝિન (ફેનોમેનેક્સ) અને 180-મિનિટ લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફીથી ભરેલું હતું. નમૂના ડાયજેસ્ટ - MS/MS ને નેનોએક્વિટી યુપીએલસી સિસ્ટમ (વોટર્સ) સાથે Q-એક્સએક્ટિવ HF માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર (થર્મો ફિશર) પર ચલાવવામાં આવ્યું હતું. દરેક રન માટે જનરેટ થયેલ ડેટા-સંબંધિત સંપાદન ડેટાને પ્રોટીઓવિઝાર્ડ (સંસ્કરણ 3.0.20287) નો ઉપયોગ કરીને અને કોમેટ31 (સંસ્કરણ 3.2) નો ઉપયોગ કરીને FASTA ડેટાબેઝ સામે રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યો હતો જેમાં એનોફિલ્સ ગેમ્બિયા (વેક્ટરબેઝ સંસ્કરણ 54), એનોફિલ્સ કોલુઝીમાંથી પ્રોટીન સિક્વન્સ હતા. માલી-એનઆઈએચ (વેક્ટરબેઝ સંસ્કરણ 54), સેકરોમીસીસ સેરેવિસીયા (યુનિપ્રોટ, માર્ચ 2021), એ. ગેમ્બિયા RNA-seq, અને જાણીતા માનવ દૂષકોના ત્રણ-ફ્રેમ અનુવાદો પર શોધ કરવામાં આવી હતી. પેપ્ટાઇડ નકશા સાથે મેળ ખાતા FDRs ને Percolator32 (સંસ્કરણ 3.05) નો ઉપયોગ કરીને 0.01 ની થ્રેશોલ્ડ સાથે નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા, અને લાઇમલાઇટ33 માં પ્રોટીન પાર્સિમોનીનો ઉપયોગ કરીને પેપ્ટાઇડ્સને પ્રોટીન ઓળખમાં એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યા હતા. (સંસ્કરણ 2.2.0). અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ દરેક રનમાં દરેક પ્રોટીન માટે ગણતરી કરાયેલ નોર્મલાઇઝ્ડ સ્પેક્ટ્રલ એવિડન્સિટી ફેક્ટર (NSAF) નો ઉપયોગ કરીને સંબંધિત પ્રોટીન વિપુલતાનો અંદાજ કાઢવામાં આવ્યો હતો. દરેક પ્રોટીનની તુલનામાં NSAF બે અલગ અલગ જૈવિક પ્રતિકૃતિઓમાંથી નમૂનાઓમાં સરેરાશ કરવામાં આવ્યું હતું. 15N લેબલિંગે માદા પ્રોટીઓમને સફળતાપૂર્વક માસ્ક કર્યું, જોકે લેબલવાળી કુમારિકાઓમાંથી થોડી માત્રામાં અનલેબલ્ડ પ્રોટીન શોધી શકાયું. અમે માદા કાચા નમૂનાઓમાં પુરુષ પ્રોટીન ઘટાડા (1-5 સ્પેક્ટ્રા) ની શોધ ફક્ત ટેકનિકલ રનમાં રેકોર્ડ કરી, જ્યાં કાચા નમૂનાઓ પુરુષ/સમાગમના નમૂનાઓ પછી ચલાવવામાં આવતા હતા, HPLC "કેરી ઓવર" ના પરિણામે. લેબલવાળી કુમારિકાઓમાંથી 'દૂષકો' તરીકે જોવા મળતા પ્રસંગોપાત પ્રોટીન પૂરક કોષ્ટક 1 માં સૂચિબદ્ધ છે.
જેનસ્ક્રિપ્ટમાં બે એન્ટિજેનિક પેપ્ટાઇડ્સ, QTTDRVAPAPDQQQ (આઇસોટાઇપ PA ની અંદર) અને MESDGTTPSGDSEQ (આઇસોટાઇપ PA અને PB ની અંદર). બે પેપ્ટાઇડ્સને જોડવામાં આવ્યા હતા, પછી વાહક પ્રોટીન KLH સાથે જોડવામાં આવ્યા હતા અને ન્યુઝીલેન્ડના સસલામાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા. ચોથા ઇન્જેક્શન પછી સસલાંઓનું બલિદાન આપવામાં આવ્યું હતું, અને કુલ IgG ને એફિનિટી શુદ્ધિકરણ દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યું હતું. સૌથી વધુ EPP-વિશિષ્ટ સસલામાંથી IgG નો ઉપયોગ વધુ પશ્ચિમી બ્લોટિંગ માટે કરવામાં આવ્યો હતો.
પશ્ચિમી બ્લોટ્સ માટે, MAG (n = 10, જ્યાં n જૈવિક રીતે સ્વતંત્ર મચ્છરના નમૂનાઓની સંખ્યા દર્શાવે છે) અને માદા LRT (n = 30) 4-દિવસના કુંવારી નર અને કુંવારી અથવા બળજબરીથી સમાગમ કરાયેલી માદા (<10 પોસ્ટ-મેટિંગ), પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ બફર (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% સોડિયમ ડીઓક્સીકોલેટ; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× પ્રોટીઝ ઇન્હિબિટર કોકટેલ (રોશે)) અલગથી ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. બીડર (2 mm ગ્લાસ બીડ્સ, 2,400 rpm, 90 સેકન્ડ) વડે વિચ્છેદન પછી તરત જ નમૂનાઓને એકરૂપ કરવામાં આવ્યા હતા. 4 °C પર 20,000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા અદ્રાવ્ય કાટમાળ દૂર કરવામાં આવ્યો હતો. બ્રેડફોર્ડ એસે (બાયો-રેડ) દ્વારા પ્રોટીનનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું. પછી, 20 µg MAG પ્રોટીન, 40 µg LRT પ્રોટીન, અને 20 µg શેષ બલ્ક પ્રોટીનને MOPS બફરનો ઉપયોગ કરીને 10% Bis-Tris NuPAGE દ્વારા વિકૃત અને અલગ કરવામાં આવ્યું હતું. iBlot2 ટ્રાન્સફર સિસ્ટમ (થર્મો ફિશર) નો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીનને પોલીવિનાઇલિડેન ફ્લોરાઇડ પટલમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા. પટલને 1× PBS-T (PBS માં 0.1% Tween-20) માં બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા અને પછી 22°C પર 1 કલાક માટે Odyssey બ્લોકિંગ બફર (Li-Cor) માં અવરોધિત કરવામાં આવ્યા હતા. પટલને 4 °C પર કસ્ટમ રેબિટ એન્ટી-EPP પોલીક્લોનલ પ્રાઇમરી એન્ટિબોડી (બ્લોકિંગ બફરમાં 1:700) અને ઉંદર વિરોધી એક્ટિન મોનોક્લોનલ પ્રાઇમરી એન્ટિબોડી MAC237 (Abeam; 1:4,000) સાથે રાતોરાત હલાવવામાં આવ્યા હતા. પટલને PBS-T થી ધોવામાં આવ્યા હતા અને પછી સેકન્ડરી એન્ટિબોડીઝ (ગધેડા વિરોધી સસલા 800CW અને બકરી વિરોધી ઉંદર 680LT (Li-Cor), બંને 1:20,000) સાથે 0.01% SDS ધરાવતા બ્લોકિંગ બફરમાં ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા અને 22 °C પર 1 કલાક માટે 0.2% ટ્વીન -20. પટલને PBS-T વડે ધોવામાં આવ્યા હતા અને ઓડિસી CLx સ્કેનર વડે છબીઓ લેવામાં આવી હતી. છબીઓ ઇમેજ સ્ટુડિયો (સંસ્કરણ 5.2) માં એકત્રિત અને પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી. EPP-RA આઇસોફોર્મ (82 kDa) ને અનુરૂપ ચોક્કસ બેન્ડ શોધી શકાયો ન હતો.
EPP ના કોડિંગ પ્રદેશો (હિસ્ટીડાઇન ફોસ્ફેટેઝ ડોમેન ધરાવતા આઇસોફોર્મ AGAP002463-RB તરીકે, NCBI સંરક્ષિત ડોમેન શોધ 34) અને EcK2 (AGAP002181) ને pET-21a(+) પ્લાઝમિડ (નોવેજન મિલિપોર સિગ્મા) માં ક્લોન કરવામાં આવ્યા હતા; પ્રાઈમર્સ વિસ્તૃત ડેટા કોષ્ટક 2 માં સૂચિબદ્ધ છે. pET-21a(+)-EcK2 કન્સ્ટ્રક્ટના C-ટર્મિનલ 6xHis ટેગ પહેલાં આઠ GS4 લિંકર્સ (ટેન્ડમમાં) દાખલ કરવામાં આવ્યા હતા. NEBExpress સેલ-ફ્રી E. coli પ્રોટીન સંશ્લેષણ પ્રતિક્રિયા (ન્યૂ ઇંગ્લેન્ડ બાયોલેબ્સ) નો ઉપયોગ કરીને રિકોમ્બિનન્ટ પ્રોટીનનું ઉત્પાદન કરવામાં આવ્યું હતું. NEBExpress Ni સ્પિન કોલમ (ન્યૂ ઇંગ્લેન્ડ બાયોલેબ્સ) નો ઉપયોગ કરીને રિકોમ્બિનન્ટ પ્રોટીનનું શુદ્ધિકરણ કરવામાં આવ્યું હતું. NEBExpress સેલ-ફ્રી E. coli પ્રોટીન સંશ્લેષણ કિટમાંથી DNA ટેમ્પલેટનો ઉપયોગ કરીને ડાયહાઇડ્રોફોલેટ રીડક્ટેઝ (DHFR) નિયંત્રણ પ્રોટીનનું ઉત્પાદન કરવામાં આવ્યું હતું. પ્રોટીનને PBS માં 50% ગ્લિસરોલમાં -20 °C પર 3 મહિના સુધી સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા.
EPP અને ટીશ્યુ અર્કની ફોસ્ફેટેઝ પ્રવૃત્તિ 4-નાઇટ્રોફિનાઇલ ફોસ્ફેટ (pNPP; સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) નો ઉપયોગ કરીને માપવામાં આવી હતી. પ્રતિક્રિયા બફરમાં 25 mM Tris, 50 mM એસિટિક એસિડ, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, અને 1 mM DTT હતું. પ્રતિક્રિયા બફરમાં પેશીઓને એકરૂપ કરવામાં આવ્યા હતા અને કોષના કાટમાળને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા દૂર કરવામાં આવ્યો હતો. 2.5 mg ml-1 pNPP ધરાવતા પ્રતિક્રિયા બફરમાં એન્ઝાઇમ અથવા ટીશ્યુ અર્ક ઉમેરીને પ્રતિક્રિયા શરૂ કરો. પ્રતિક્રિયા મિશ્રણને ઓરડાના તાપમાને અંધારામાં ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું હતું, અને pNPP માંથી રૂપાંતરિત pNP ની માત્રા વિવિધ સમયે 405 nm પર શોષકતા માપીને માપવામાં આવી હતી.
ઇન વિટ્રો EcK પ્રવૃત્તિ માટે, પ્રોટીનને 0.2 mg 20E અથવા 3D20E સાથે 200 µl બફર (pH 7.5) માં 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP અને 10 mM MgCl2 ધરાવતા 27 °C તાપમાને 2 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યું હતું. 800 µl મિથેનોલ ઉમેરીને પ્રતિક્રિયા બંધ કરવામાં આવી હતી, પછી -20 °C પર 1 કલાક માટે ઠંડુ કરવામાં આવ્યું હતું, પછી 4 °C પર 10 મિનિટ માટે 20,000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ સુપરનેટન્ટનું HPLC-MS/MS દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. નિયંત્રણ જૂથમાં ઉપયોગમાં લેવાતા પ્રોટીનને ગરમી-નિષ્ક્રિય કરવા માટે, પ્રોટીનને PBS માં 50% ગ્લિસરોલમાં 95°C પર 20 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા.
ઇન વિટ્રો EPP પ્રવૃત્તિ માટે, પ્રોટીનને 100 μl બફર (pH 7.5) માં 3D20E22P (HPLC-MS/MS દ્વારા શુદ્ધ કરાયેલ 18 જોડી MAG માં મળેલ જથ્થાની સમકક્ષ) સાથે ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યું હતું જેમાં 25 mM Tris, 50 mM એસિટિક એસિડ, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, અને 1 mM DTT 27 °C પર 3 કલાક માટે હતું. 400 μl મિથેનોલ ઉમેરીને પ્રતિક્રિયા બંધ કરવામાં આવી હતી અને -20 °C પર 1 કલાક માટે ઠંડુ કરવામાં આવ્યું હતું, પછી 4 °C પર 10 મિનિટ માટે 20,000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું. HPLC-MS/MS દ્વારા સુપરનેટન્ટનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) અને EcK2 (556 bp) માટેના PCR ટુકડાઓ મિશ્ર-જાતિના માથા વગરના મચ્છરના મૃતદેહમાંથી તૈયાર કરાયેલ cDNA માંથી વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યા હતા. eGFP નિયંત્રણ (495 bp) ના PCR ટુકડાને અગાઉ વર્ણવેલ pCR2.1-eGFP માંથી વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યા હતા; PCR પ્રાઇમર્સ વિસ્તૃત ડેટા કોષ્ટક 2 માં સૂચિબદ્ધ છે. PCR ટુકડો pL4440 પ્લાઝમિડ પર ઇન્વર્ટેડ T7 પ્રમોટર્સ વચ્ચે દાખલ કરવામાં આવ્યો હતો. NEB 5-α સક્ષમ E. coli (ન્યૂ ઇંગ્લેન્ડ બાયોલેબ્સ) માંથી પ્લાઝમિડ રચનાઓ પુનઃપ્રાપ્ત કરવામાં આવી હતી અને ઉપયોગ પહેલાં DNA સિક્વન્સિંગ દ્વારા ચકાસવામાં આવી હતી (ઇન્સર્ટ સિક્વન્સ માટે પૂરક ડેટા 1 જુઓ). T7 પ્રમોટર (એક્સટેન્ડેડ ડેટા ટેબલ 2) સાથે મેળ ખાતા પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ pL4440-આધારિત પ્લાઝમિડમાંથી ઇન્સર્ટને વિસ્તૃત કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. PCR ઉત્પાદન કદ એગારોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી. dsRNA ને મેગાસ્ક્રિપ્ટ T7 ટ્રાન્સક્રિપ્શન કીટ (થર્મો ફિશર) નો ઉપયોગ કરીને PCR ટેમ્પ્લેટ્સમાંથી ટ્રાન્સક્રિપ્ટ કરવામાં આવ્યું હતું અને ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર અગાઉ વર્ણવેલ ફેરફારો સાથે શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું.
dsRNA ઇન્જેક્શન માટે, 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) 10 ng nl-1 ની સાંદ્રતા પર પુખ્ત નર અથવા માદા (Nanoject III, Drummond) ના છાતીમાં એક્ક્લોઝન પછી 1 દિવસની અંદર ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યું હતું. RNA નિષ્કર્ષણ, cDNA સંશ્લેષણ અને RT-qPCR દ્વારા ઓછામાં ઓછા ત્રણ જૈવિક પ્રતિકૃતિઓમાં જનીન નોકડાઉન સ્તર નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું. ecdysone ઇન્જેક્શન માટે, 4-દિવસની કુંવારી અથવા 6-દિવસની કુંવારી રક્ત પીતી સ્ત્રીઓને પ્રાયોગિક ડિઝાઇન અથવા 6.3 ng nl-1 પર આધાર રાખીને, અનુક્રમે 1.3, 2.1 ની સાંદ્રતા પર 0.13, 0.21, અથવા 0.63 µg 20E અથવા 3D20E (Nanoject III, Drummond) સાથે ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યું હતું. 10% (વોલ્યુમ/વોલ્યુમ) ઇથેનોલનું 100 nl ઇન્જેક્ટ કરો. પાણીમાં; ૧૦% ઇથેનોલમાં ૧૦૦ nl 3D20E22P (MAGs ની જોડીમાં જોવા મળતી માત્રાના ૭૫% જેટલું). મચ્છરોને રેન્ડમલી ઇન્જેક્શન જૂથમાં સોંપવામાં આવ્યા હતા.
સ્પાવિંગ પરીક્ષણો માટે, 3 દિવસની માદાઓને માનવ રક્ત પર લિબિટમ ખવડાવવામાં આવ્યું હતું. આંશિક રીતે ખવડાવેલા અથવા ન ખવડાવેલા મચ્છરોને દૂર કરો. સારવારના આધારે, માદાઓને રક્ત ભોજન પછી ઓછામાં ઓછા 48 કલાક માટે ચાર રાત માટે અલગ સ્પાવિંગ કપમાં મૂકવામાં આવી હતી. ઇંડાની ગણતરી સ્ટીરિયોસ્કોપ (સ્ટેમી 508, ઝીસ) હેઠળ કરવામાં આવી હતી; સંવનન કરાયેલ માદાઓ માટે, લાર્વામાં બહાર નીકળેલા ઇંડાને ફળદ્રુપ ગણવામાં આવ્યા હતા.
સમાગમના પરીક્ષણો માટે, માદાઓને સમાગમ સામે પ્રતિકાર વિકસાવવા માટે સારવારના આધારે ઓછામાં ઓછા 2 દિવસનો સમય આપવામાં આવ્યો હતો, અને જંગલી પ્રકારના વય-મેળ ખાતા નરને ત્યારબાદ તે જ પાંજરામાં દાખલ કરવામાં આવ્યા હતા. બે રાત પછી, માદા ફળદ્રુપ વેસિકલ્સનું વિચ્છેદન કરવામાં આવ્યું હતું અને 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, અને 25 mM NaCl (pH 8.2) ધરાવતા બફરમાં ફ્રીઝ-થો અને સોનિકેશન દ્વારા જીનોમિક DNA છોડવામાં આવ્યું હતું. નમૂનાઓને પ્રોટીનેઝ K (0.86 µg µl-1) સાથે 55 °C પર 15 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા, ત્યારબાદ 95 °C પર 10 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા. ક્રૂડ જીનોમિક DNA તૈયારીઓને 10 ગણી પાતળી કરવામાં આવી હતી અને Y રંગસૂત્ર ક્રમની qPCR શોધને આધિન કરવામાં આવી હતી; પ્રાઇમર્સ વિસ્તૃત ડેટા કોષ્ટક 2 માં સૂચિબદ્ધ છે. Y રંગસૂત્ર ક્રમની ગેરહાજરી કોઈ સમાગમ સૂચવે છે.
પુનઃસંવનન પરીક્ષણો માટે, બળજબરીથી સમાગમ કરાયેલી માદાઓની સંવનન સ્થિતિની પુષ્ટિ કરવા માટે સમાગમ પ્લગની હાજરી માટે તપાસ કરવામાં આવી હતી અને પુરુષોની ગેરહાજરીમાં સમાગમ માટે પ્રત્યાવર્તન વિકસાવવા માટે 2 દિવસનો સમય આપવામાં આવ્યો હતો, જેમ કે અગાઉ વર્ણવેલ 36. DsRed ટ્રાન્સજેનિક શુક્રાણુ ધરાવતા નરને પછી માદા પાંજરામાં દાખલ કરવામાં આવ્યા હતા. બે રાત પછી, માદાઓમાંથી ફળદ્રુપ વેસિકલ્સનું વિચ્છેદન કરવામાં આવ્યું હતું, અને ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ જીનોમિક DNA તૈયાર કરવામાં આવ્યું હતું અને DsRed ટ્રાન્સજીનની qPCR શોધને આધિન કરવામાં આવ્યું હતું; પ્રાઇમર્સ વિસ્તૃત ડેટા કોષ્ટક 2 માં સૂચિબદ્ધ છે. DsRed ટ્રાન્સજીનની ગેરહાજરી દર્શાવે છે કે કોઈ પુનઃસંવનન થયું નથી.
3D20E ને અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું 37. સંક્ષિપ્તમાં, 10 મિલિગ્રામ 20E (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) 10 મિલિગ્રામ પાણીમાં ઓગાળવામાં આવ્યું હતું, ત્યારબાદ 30 મિલિગ્રામ પ્લેટિનમ બ્લેક (પાવડર સ્વરૂપમાં, સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. પ્રતિક્રિયા મિશ્રણમાં O2 નો હળવો પ્રવાહ સતત બબલ કરવામાં આવ્યો હતો, જે ઓરડાના તાપમાને હલાવવામાં આવ્યો હતો. 6 કલાક પછી, પ્રતિક્રિયા રોકવા માટે 30 મિલી મિથેનોલ ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. ઉત્પ્રેરક કણોને દૂર કરવા માટે મિશ્રણને સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું. ઓરડાના તાપમાને શૂન્યાવકાશમાં સુકાતા માટે સુપરનેટન્ટનું બાષ્પીભવન કરવામાં આવ્યું હતું. HPLC-MS/MS વિશ્લેષણ માટે ઇન્જેક્શન માટે સૂકા પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદનને 10% ઇથેનોલ અને મિથેનોલમાં ઓગાળવામાં આવ્યું હતું. રૂપાંતર દર (20E થી 3D20E સુધી) લગભગ 97% (આકૃતિ 4b) હતો, અને સંશ્લેષિત 3D20E નો MS સ્પેક્ટ્રમ સંવનન પામેલી સ્ત્રીઓમાં જોવા મળતા સ્પેક્ટ્રમ સાથે મેળ ખાતો હતો (આકૃતિ 4c).
આ દંતકથામાં કરવામાં આવેલા આંકડાકીય પરીક્ષણોની ચોક્કસ વિગતો છે. ફિશરની ચોક્કસ કસોટી, મેન્ટેલ-કોક્સ ટેસ્ટ અને સ્ટુડન્ટ્સ ટી-ટેસ્ટ કરવા માટે ગ્રાફપેડ (સંસ્કરણ 9.0) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. કોક્રન-મેન્ટેલ-હેન્સેલ પરીક્ષણો કસ્ટમ R સ્ક્રિપ્ટનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યા હતા (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test પર ઉપલબ્ધ છે). 0.05 ના મહત્વ થ્રેશોલ્ડ સાથે શાપિરો-વિલ્ક પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને ડેટા વિતરણનું સામાન્યતા માટે પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું. જ્યારે ડેટા સામાન્યતા પરીક્ષણમાં નિષ્ફળ ગયો, ત્યારે માન-વ્હીટની પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું. મેન્ટેલ-કોક્સ પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને સર્વાઇવલ ડેટાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. RNA-seq જનીન-સ્તર વિભેદક અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ કરવા માટે DESeq2 પેકેજ (સંસ્કરણ 1.28.1) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. ગ્રાફ પરની આડી પટ્ટી મધ્યકનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. બધા પરીક્ષણો માટે થ્રેશોલ્ડ તરીકે P = 0.05 નું મહત્વ મૂલ્ય ઉપયોગમાં લેવાયું હતું.
અભ્યાસ ડિઝાઇન વિશે વધુ માહિતી માટે, આ લેખ સાથે જોડાયેલ નેચર રિસર્ચ રિપોર્ટનો સારાંશ જુઓ.
ડેટાસેટ ઓળખકર્તા PXD032157 સાથે PRIDE પાર્ટનર રિપોઝીટરી (https://www.ebi.ac.uk/pride/) દ્વારા MS પ્રોટીઓમિક ડેટા પ્રોટીઓમએક્સચેન્જ કન્સોર્ટિયમ (http://proteomecentral.proteomexchange.org) માં જમા કરવામાં આવ્યો હતો.
RNA-seq ડેટાસેટને GSE198665 સીરીયલ રેકોર્ડ હેઠળ જીન એક્સપ્રેશન કોમ્પ્રીહેન્સિવ લાઇબ્રેરી (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) માં જમા કરવામાં આવે છે.
વર્તમાન અભ્યાસ દરમિયાન જનરેટ થયેલા અને/અથવા વિશ્લેષણ કરાયેલા વધારાના ડેટાસેટ્સ વાજબી વિનંતી પર સંબંધિત લેખકો પાસેથી મેળવી શકાય છે. આ લેખ સ્રોત ડેટા પ્રદાન કરે છે.
ડી લૂફ, એ. એક્ડિસ્ટેરોઇડ્સ: ઉપેક્ષિત જંતુ સેક્સ સ્ટેરોઇડ્સ? પુરુષ: બ્લેક બોક્સ. જંતુ વિજ્ઞાન.13, 325–338 (2006).
રેડફર્ન, CPF 20-હાઈડ્રોક્સાયએકડાયસોન અને અંડાશય વિકાસ એનોફિલિસ સ્ટીફન્સ.જે. ઇન્સેક્ટ ફિઝિયોલોજી.28, 97–109 (1982).