સેલ કમ્પાર્ટમેન્ટલાઇઝેશન અને હોમિયોસ્ટેસિસ જાળવવા માટે સ્ત્રાવ માર્ગમાં પ્રોટીન સૉર્ટિંગ આવશ્યક છે. શેલ-મધ્યસ્થી સૉર્ટિંગ ઉપરાંત, સ્ત્રાવ પરિવહનની પ્રક્રિયામાં કિનેસિન સૉર્ટિંગમાં લિપિડ્સની ભૂમિકા એ લાંબા સમયથી ચાલતો મૂળભૂત પ્રશ્ન છે જેનો હજુ સુધી જવાબ મળ્યો નથી. અહીં, અમે 3D એક સાથે મલ્ટીકલર હાઇ-રિઝોલ્યુશન રીઅલ-ટાઇમ ઇમેજિંગ કરીએ છીએ જેથી ઇન વિવો સાબિત કરી શકાય કે ખૂબ લાંબા સિરામાઇડ લિપિડ મોઇટીઝ સાથે નવા સંશ્લેષિત ગ્લાયકોસિલ્ફોસ્ફેટિડિલિનોસિટોલ-સ્થિર પ્રોટીનને ક્લસ્ટર કરવામાં આવે છે અને વિશિષ્ટ એન્ડોપ્લાઝમ નેટ એક્ઝિટ સાઇટમાં વર્ગીકૃત કરવામાં આવે છે, જે ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન પ્રોટીન દ્વારા ઉપયોગમાં લેવાતા કરતા અલગ છે. વધુમાં, અમે બતાવીએ છીએ કે એન્ડોપ્લાઝમિક રેટિક્યુલમ મેમ્બ્રેનમાં સિરામાઇડની સાંકળ લંબાઈ આ સૉર્ટિંગ પસંદગી માટે મહત્વપૂર્ણ છે. અમારો અભ્યાસ લિપિડ સાંકળ લંબાઈના આધારે પ્રોટીન કાર્ગોને સ્ત્રાવ માર્ગમાં પસંદગીયુક્ત નિકાસ સ્થળોમાં વર્ગીકૃત કરવા માટેનો પ્રથમ સીધો ઇન વિવો પુરાવા પૂરો પાડે છે.
યુકેરીયોટિક કોષોમાં, એન્ડોપ્લાઝમિક રેટિક્યુલમ (ER) માં સંશ્લેષિત પ્રોટીનને તેમના યોગ્ય સેલ્યુલર ગંતવ્ય (1) સુધી પહોંચાડવા માટે સ્ત્રાવ માર્ગ દ્વારા પરિવહન દરમિયાન સૉર્ટ કરવામાં આવે છે. કોટ-મધ્યસ્થી સૉર્ટિંગ ઉપરાંત, લાંબા સમયથી એવું અનુમાન કરવામાં આવતું હતું કે ચોક્કસ લિપિડ્સ ચોક્કસ પ્રોટીન (2-5) ના ચોક્કસ પટલ ડોમેન્સમાં ક્લસ્ટર કરીને પસંદગીયુક્ત એક્ઝિટ પોઇન્ટ તરીકે પણ સેવા આપી શકે છે. જો કે, આ શક્ય લિપિડ-આધારિત મિકેનિઝમને સાબિત કરવા માટે હજુ પણ સીધા ઇન વિવો પુરાવાનો અભાવ છે. આ મૂળભૂત સમસ્યાને ઉકેલવા માટે, અમે યીસ્ટમાં અભ્યાસ કર્યો કે ગ્લાયકોસિલ્ફોસ્ફેટિડિલિનોસિટોલ (GPI) એન્કર્ડ પ્રોટીન (GPI-APs) ER માંથી કેવી રીતે અલગ રીતે નિકાસ કરવામાં આવે છે. GPI-APs લિપિડ-કનેક્ટેડ સેલ સપાટી પ્રોટીનની વિવિધતા છે (6, 7). GPI-AP એ ગ્લાયકોલિપિડ મોઇટી (GPI એન્કર) દ્વારા પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેનના બાહ્ય પત્રિકાઓ સાથે જોડાયેલ એક સ્ત્રાવ પ્રોટીન છે. તેઓ ER લ્યુમેનમાં રૂઢિચુસ્ત પોસ્ટ-ટ્રાન્સલેશનલ ફેરફારો તરીકે GPI એન્કરને સ્વીકારે છે (8). જોડાણ પછી, GPI-AP ગોલ્ગી ઉપકરણ (5, 9) ER થી પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેન સુધી પસાર થાય છે. GPI એન્કરની હાજરીને કારણે GPI-AP ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન સ્ત્રાવિત પ્રોટીન (અન્ય પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેન પ્રોટીન સહિત) થી સ્ત્રાવ માર્ગ (5, 9, 10) સાથે અલગથી પરિવહન થાય છે. યીસ્ટ કોષોમાં, GPI-AP ને એન્ડોપ્લાઝમિક રેટિક્યુલમમાં અન્ય સ્ત્રાવિત પ્રોટીનથી અલગ કરવામાં આવે છે, અને પછી કોટ પ્રોટીન કોમ્પ્લેક્સ II (COPII) (6, 7) દ્વારા લપેટેલા અનન્ય વેસિકલ્સમાં પેક કરવામાં આવે છે. ER નિકાસ પ્રક્રિયામાં આ વર્ગીકરણ પ્રક્રિયાના નિર્ધારકો અસ્પષ્ટ છે, પરંતુ એવું અનુમાન છે કે આ પદ્ધતિને લિપિડ્સની જરૂર પડી શકે છે, ખાસ કરીને GPI એન્કરના લિપિડ ભાગનું માળખાકીય રિમોડેલિંગ (5, 8). યીસ્ટમાં, GPI લિપિડ રિમોડેલિંગ GPI જોડાયા પછી તરત જ શરૂ થાય છે, અને ઘણા કિસ્સાઓમાં, તે સિરામાઇડને 26-કાર્બન લાંબા-સાંકળ સંતૃપ્ત ફેટી એસિડ (C26:0) (11, 12) સાથે જોડવાનું કારણ બને છે. C26 સિરામાઇડ એ અત્યાર સુધી યીસ્ટ કોષો દ્વારા ઉત્પાદિત મુખ્ય સિરામાઇડ છે. તે ER માં સંશ્લેષણ કરવામાં આવે છે અને તેમાંથી મોટાભાગનું COPII વેસિકલ્સ (13) દ્વારા ગોલ્ગી ઉપકરણમાં નિકાસ કરવામાં આવે છે. GPI-AP ના ER નિકાસ માટે ખાસ કરીને ચાલુ સિરામાઇડ સંશ્લેષણ (14, 15) ની જરૂર પડે છે, અને બદલામાં, ગોલ્ગી ઉપકરણમાં સિરામાઇડનું ઇનોસિટોલ ફોસ્ફેટ સિરામાઇડ (IPC) માં રૂપાંતર GPI એન્કર સંશ્લેષણ (16) પર આધાર રાખે છે. કૃત્રિમ પટલ સાથેના બાયોફિઝિકલ અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે ખૂબ લાંબા એસીલ ચેઇન સિરામાઇડ્સ અનન્ય ભૌતિક ગુણધર્મો (17, 18) સાથે ક્રમબદ્ધ ડોમેન્સ બનાવવા માટે એકીકૃત થઈ શકે છે. આ ડેટા એવી પૂર્વધારણા તરફ દોરી જાય છે કે C26 સિરામાઇડ અને GPI-AP C26 સિરામાઇડ સાથે તેમના ભૌતિક ગુણધર્મોનો ઉપયોગ પ્રમાણમાં અવ્યવસ્થિત ER પટલ લિપિડ વાતાવરણમાં વ્યવસ્થિત પ્રદેશો અથવા પ્રદેશોમાં એકીકૃત થવા માટે કરે છે. તે મુખ્યત્વે ટૂંકા અને અસંતૃપ્ત ગ્લિસરોલિપિડ્સ (C16:1 અને C18:1) (19, 20) થી બનેલું છે. આ પ્રદેશો ચોક્કસ ER એક્ઝિટ સાઇટ્સ (ERES) પર પસંદગીયુક્ત રીતે કેન્દ્રિત કરવામાં આવશે, જ્યાં સિરામાઇડ અને સિરામાઇડ-આધારિત GPI-AP ને સમાન સમર્પિત COPII વેસિકલ (5) માં ગોલ્ગીમાં સહ-પરિવહન કરી શકાય છે.
આ અભ્યાસમાં, અમે સુપર-રિઝોલ્યુશન કોન્ફોકલ રીઅલ-ટાઇમ ઇમેજિંગ માઇક્રોસ્કોપી (SCLIM) નો ઉપયોગ કરીને આ લિપિડ-આધારિત મિકેનિઝમનું સીધું પરીક્ષણ કર્યું છે, જે એક અત્યાધુનિક માઇક્રોસ્કોપી તકનીક છે જે એકસાથે ફ્લોરોસન્ટલી લેબલવાળા પ્રોટીનનું અવલોકન કરી શકે છે. જીવંત કોષોમાં ત્રિ-રંગી અને ત્રિ-પરિમાણીય (3D) છબીઓ અત્યંત ઉચ્ચ રીઝોલ્યુશન અને ગતિ ધરાવે છે (21, 22).
અમે સૌપ્રથમ SCLIM ટેકનોલોજીનો ઉપયોગ કરીને S. cerevisiae માં ER છોડ્યા પછી ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન સ્ત્રાવિત પ્રોટીનમાંથી C26 સિરામાઇડ જૂથ સાથે સામાન્ય GPI-AP કેવી રીતે તપાસવામાં આવ્યું તે વધુ વ્યાખ્યાયિત કર્યું. ER ના વર્ગીકરણને તપાસવા માટે, અમે એક આનુવંશિક સિસ્ટમનો ઉપયોગ કર્યો જે ERES માં પ્રવેશતા નવા સંશ્લેષિત કાર્ગોને સીધી રીતે કલ્પના કરી શકે છે (7, 23). કાર્ગો તરીકે, અમે ગ્રીન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન (GFP) સાથે લેબલ થયેલ C26 સિરામાઇડ-આધારિત GPI-AP Gas1 અને નજીકના-ઇન્ફ્રારેડ ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન (iRFP) સાથે લેબલ થયેલ ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન સ્ત્રાવિત પ્રોટીન Mid2 પસંદ કર્યું, જે બંને પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેનને લક્ષ્ય બનાવે છે (24-26). sec31-1 તાપમાન-સંવેદનશીલ મ્યુટન્ટમાં, આ બે કાર્ગો ગેલેક્ટોઝ-ઇન્ડ્યુસિબલ પ્રમોટર અને એક રચનાત્મક ERES માર્કર હેઠળ વ્યક્ત થાય છે. આત્યંતિક તાપમાન (37°C) પર, કારણ કે sec31-1 પરિવર્તન COPII અંકુરણ અને ER નિકાસને અટકાવવા માટે COPII કોટ ઘટક Sec31 ના કાર્યને અસર કરે છે, નવા સંશ્લેષિત કાર્ગો ER (23) પર એકઠા થાય છે. નીચા તાપમાન (24°C) સુધી ઠંડુ થયા પછી, sec31-1 મ્યુટન્ટ કોષો સ્ત્રાવ વિસ્તારમાંથી પુનઃપ્રાપ્ત થયા, અને સંચિત નવા કૃત્રિમ કાર્ગો ER માંથી નિકાસ થવા લાગ્યા. CLIM વિઝ્યુલાઇઝેશન દર્શાવે છે કે મોટાભાગના નવા સંશ્લેષિત Gas1-GFP અને Mid2-iRFP હજુ પણ sec31-1 મ્યુટન્ટ કોષોના ER માં 37°C પર ઇન્ક્યુબેશન પછી સંચિત થાય છે અને પછી 24°C પર 5 મિનિટ માટે છોડવામાં આવે છે (આકૃતિ 1). કારણ કે Mid2-iRFP સમગ્ર ER પટલ પર વિતરિત થાય છે, અને Gas1-GFP કેન્દ્રિત છે અને અસંતુષ્ટ ER પટલ વિસ્તારમાં એકત્રિત થાય છે, તેમનું વિતરણ સંપૂર્ણપણે અલગ છે (આકૃતિ 1, A થી C અને મૂવી S1). વધુમાં, આકૃતિ 1D માં બતાવ્યા પ્રમાણે, Gas1-GFP ક્લસ્ટરમાં Mid2-iRFP નથી. આ પરિણામો સૂચવે છે કે GPI-AP અને ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન પ્રોટીનને શરૂઆતમાં અલગ અલગ ER પટલ પ્રદેશોમાં અલગ કરવામાં આવ્યા હતા. ગેસ1-જીએફપી ક્લસ્ટર એક ચોક્કસ ERES ની બાજુમાં છે જે mCherry ના COPII કોટ પ્રોટીન Sec13 (આકૃતિ 1, E અને F, અને મૂવી S1) (23) સાથે લેબલ થયેલ છે.
sec31-1 કોષો ગેલેક્ટોઝ-પ્રેરિત સ્ત્રાવ, લાંબી એસીલ ચેઇન (C26) સિરામાઇડ GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, લીલો) અને ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન પ્રોટીન Mid2-iRFP (TMP, વાદળી) વ્યક્ત કરે છે અને આ રચનાત્મક ERES લેબલિંગ Sec13-mCherry (ERES, મેજેન્ટા) ને 30 મિનિટ માટે 37°C પર ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું હતું, 24°C પર ખસેડવામાં આવ્યું હતું, અને 5 મિનિટ પછી SCLIM દ્વારા છબી લેવામાં આવી હતી. (A થી C) પ્લેન (A) ની પ્રતિનિધિ મર્જ્ડ અથવા સિંગલ 2D છબી, 10 z-સેક્શન (B) ની 2D પ્રોજેક્શન છબી અથવા કાર્ગો અને ERES માર્કર્સ (C) ની 3D સેલ ગોળાર્ધ છબી દર્શાવે છે. સ્કેલ બાર 1μm (A અને B). સ્કેલ યુનિટ 0.551μm (C) છે. Gas1-GFP અલગ ER પ્રદેશો અથવા ક્લસ્ટરોમાં શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું, જ્યારે Mid2-iRFP સમગ્ર ER મેમ્બ્રેન (C) માં શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું અને વિતરિત કરવામાં આવ્યું હતું. (D) ગ્રાફ સફેદ તીર રેખા (ડાબે) સાથે Gas1-GFP ક્લસ્ટરમાં Gas1-GFP અને Mid2-iRFP ની સંબંધિત ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતા દર્શાવે છે. AU, મનસ્વી એકમ. (E અને F) 3D છબીનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે જે માલ અને ERES ચિહ્નને જોડે છે. ચોક્કસ ERES નજીક Gas1-GFP ક્લસ્ટરો શોધી કાઢવામાં આવ્યા હતા. સ્કેલ એકમ 0.551μm છે. (F) સફેદ ઘન તીર ERES સાથે સંકળાયેલ Gas1-GFP ક્લસ્ટરને ચિહ્નિત કરે છે. મધ્ય અને જમણી પેનલ મર્જ કરેલી વિસ્તૃત 3D છબી અને પસંદ કરેલા Gas1-GFP ક્લસ્ટરનો ફેરવાયેલ દૃશ્ય દર્શાવે છે.
Gas1-GFP ક્લસ્ટર અને ચોક્કસ ERES વચ્ચેનો ગાઢ અવકાશી સંબંધ સૂચવે છે કે Gas1-GFP પસંદગીયુક્ત ERES માં પ્રવેશી શકે છે, જે ER છોડવા માટે Mid2-iRFP દ્વારા ઉપયોગમાં લેવાતી પસંદગીયુક્તતાથી અલગ છે. આ શક્યતાને સંબોધવા માટે, અમે ફક્ત એક કે બે માલ માટે ERES ગુણોત્તરનું પ્રમાણ નક્કી કર્યું (આકૃતિ 2, A થી C). અમને જાણવા મળ્યું કે મોટાભાગના ERES (70%) માં ફક્ત એક જ પ્રકારનો કાર્ગો હોય છે. આકૃતિ 2C ની નીચેની છબી ફક્ત Gas1-GFP (આકૃતિ 1) અથવા ફક્ત Mid2-iRFP (આકૃતિ 2) સાથે ERES ના બે લાક્ષણિક ઉદાહરણો દર્શાવે છે. તેનાથી વિપરીત, લગભગ 20% ERES માં બે કાર્ગો હોય છે જે એક જ વિસ્તારમાં ઓવરલેપ થાય છે. એવું જાણવા મળ્યું કે કેટલાક ERES (10%) માં બે પ્રકારના કાર્ગો હોય છે, પરંતુ તે સ્પષ્ટ રીતે અલગ વિસ્તારોમાં અલગ હતા. તેથી, આ આંકડાકીય વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે ER નિકાસ થયા પછી, GPI-AP Gas1-GFP અને ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન કાર્ગો Mid2-iRFP ને અલગ ERES (આકૃતિ 2D) માં વિભાજિત કરવામાં આવે છે. આ સૉર્ટિંગ કાર્યક્ષમતા અગાઉના બાયોકેમિકલ વિશ્લેષણ (6) અને મોર્ફોલોજિકલ નિર્ધારણ (7) સાથે ખૂબ જ સુસંગત છે. આપણે ERES (આકૃતિ 2E અને મૂવી S2) માં પ્રવેશતા ક્વોરેન્ટાઇન કાર્ગોના વર્તનનું પણ અવલોકન કરી શકીએ છીએ. આકૃતિ 2E બતાવે છે કે Gas1-GFP (પેનલ 3) અથવા Mid2-iRFP (પેનલ 4) નો માત્ર એક નાનો ભાગ એક બાજુથી ERES માં પ્રવેશ કરે છે અને એક અલગ વિસ્તારમાં બંધાયેલ છે. આકૃતિ 2E નું પેનલ 5 બતાવે છે કે Gas1-GFP અને Mid2-iRFP ક્યારેક એક જ ERES માં જોવા મળે છે, પરંતુ તેઓ અલગ બાજુઓથી પ્રવેશ કરે છે અને અલગ પ્રદેશોમાં કેન્દ્રિત છે જે વિવિધ COPII વેસિકલ્સનું પ્રતિનિધિત્વ કરી શકે છે. અમે એ પણ પુષ્ટિ આપી છે કે C26 સિરામાઇડ-આધારિત GPI-AP Gas1 નું પસંદગીયુક્ત ERES તરીકે અવલોકન કરાયેલ અલગતા અને વર્ગીકરણ ચોક્કસ છે કારણ કે અન્ય ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન સ્ત્રાવ કાર્ગો, GFP-ટેગ કરેલ પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેન પ્રોટીન Axl2 (27), Mid2-iRFP જેવું જ વર્તન દર્શાવે છે. (ચિત્ર S1 અને મૂવી S3). નવા સંશ્લેષિત Axl2-GFP ને Mid2-iRFP (આકૃતિ S1, A અને B) જેવા ER પટલ દ્વારા વિતરિત કરવામાં આવે છે, અને મોટાભાગના ERES (આકૃતિ S1, B થી D) માં Mid2-iRFP સાથે સહ-સ્થાનિકીકરણ કરવામાં આવે છે. આકૃતિ 1 ના પેનલ 1 અને 2. S1C ERES ના બે લાક્ષણિક ઉદાહરણો દર્શાવે છે જ્યાં બે ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન કાર્ગો ઓવરલેપ થાય છે. આ કિસ્સાઓમાં, બંને માલ ERES માં એકસાથે પ્રવેશ કરે છે (આકૃતિ S1E, પેનલ 3 અને મૂવી S3).
ગેલેક્ટોઝ ઇન્ડ્યુસિબલ સ્ત્રાવ વ્યક્ત કરતા sec31-1 કોષો, Gas1-GFP (GPI-AP, લીલો) અને Mid2-iRFP (TMP, વાદળી) અને Sec13-mCherry (ERES, મેજેન્ટા) લેબલિંગ રચનાત્મક ERES 37 પર મૂકવામાં આવ્યા હતા. °C પર 30 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટ કર્યા પછી, સ્ત્રાવ બ્લોક છોડવા માટે 24 °C પર ખસેડો, અને 20 મિનિટ પછી SCLIM સાથે છબી બનાવો. (A થી C) પ્રતિનિધિ 2D પ્રોજેક્શન છબીઓ (A; સ્કેલ બાર, 1μm) અથવા 3D કોષ ગોળાર્ધ છબીઓ (B અને C; સ્કેલ એકમ, 0.456μm) કાર્ગોની અને ERES દ્વારા ચિહ્નિત 10 z-વિભાગો. (B) માં નીચલું પેનલ અને (C) માં પેનલ ફક્ત ERES (મેજેન્ટા) [Gas1-GFP (ગ્રે) અને Mid2-iRFP (આછો વાદળી)] માં હાજર માલ પ્રદર્શિત કરવા માટે પ્રોસેસ્ડ છબીઓ પ્રદર્શિત કરે છે. (C) ખુલ્લો તીર: ERES ફક્ત એક જ કાર્ગોનું વહન કરે છે (1 થી 4). ગ્રે એરો: ERES માં અલગ કાર્ગો (5) હોય છે. સફેદ ઘન તીર: સહ-સ્થિત કાર્ગો ધરાવતું ERES. નીચે: પસંદ કરેલ સિંગલ ERES માં ફક્ત Gas1-GFP (1) અથવા Mid2-iRFP (2) હોય છે. સ્કેલ બાર, 100 nm. (D) (C) માં વર્ણવેલ ફોટોમાઇક્રોગ્રાફનું પ્રમાણીકરણ. ERES ની સરેરાશ ટકાવારી જેમાં ફક્ત એક જ કાર્ગો (Gas1-GFP અથવા Mid2-iRFP), અલગ કાર્ગો અને ઓવરલેપિંગ કાર્ગો હોય છે. ત્રણ સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાં, 54 કોષોમાં n=432. ભૂલ બાર = SD. બે-પૂંછડી વગરનું t પરીક્ષણ. *** P = 0.0002. (E) (C) ચિહ્નિત થયેલ ક્વોરેન્ટાઇન કરેલા કાર્ગોના પસંદ કરેલ ERES ની 3D છબી. Gas1-GFP (લીલો) (3) અથવા Mid2-iRFP (વાદળી) (4) એક બાજુથી ERES (મેજેન્ટા) માં પ્રવેશ કરે છે અને ERES ની અંદરના નાના વિસ્તારમાં મર્યાદિત છે. ક્યારેક, બંને પ્રકારના કાર્ગો એક જ બાજુથી સમાન ERES (5) માં પ્રવેશ કરે છે અને ERES ની અંદર એક અલગ વિસ્તારમાં મર્યાદિત હોય છે. સ્કેલ બાર, 100 nm.
આગળ, અમે એક પૂર્વધારણાનું પરીક્ષણ કર્યું કે ER પટલમાં હાજર લાંબી એસીલ ચેઇન સિરામાઇડ (C26) ગેસ1 ના ચોક્કસ ક્લસ્ટરિંગ અને સૉર્ટિંગને પસંદગીયુક્ત ERES માં ચલાવે છે. આ માટે, અમે સંશોધિત યીસ્ટ સ્ટ્રેન GhLag1 નો ઉપયોગ કર્યો, જેમાં બે એન્ડોજેનસ સિરામાઇડ સિન્થેસેસ Lag1 અને Lac1 ને GhLag1 (કપાસના Lag1 હોમોલોગ) દ્વારા બદલવામાં આવ્યા, જેના પરિણામે કોષ પટલ સાથે યીસ્ટ સ્ટ્રેન બન્યું જે જંગલી પ્રકાર કરતા ટૂંકા સિરામાઇડ સ્ટ્રેન હતા (આકૃતિ 3A) (28). માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (MS) વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે જંગલી પ્રકારના સ્ટ્રેનમાં, કુલ સિરામાઇડનો 95% ખૂબ લાંબો (C26) ચેઇન સિરામાઇડ છે, જ્યારે GhLag1 માં, 85% સિરામાઇડ ખૂબ લાંબો (C18 અને C16) છે. ), સિરામાઇડનો માત્ર 2% ખૂબ લાંબો (C26) ચેઇન સિરામાઇડ છે. જોકે અત્યાર સુધી GhLag1 પટલમાં C18 અને C16 સિરામાઇડ મુખ્ય સિરામાઇડ છે, MS વિશ્લેષણે પણ પુષ્ટિ આપી છે કે GhLag1 સ્ટ્રેનમાં દર્શાવવામાં આવેલા Gas1-GFP ના GPI એન્કરમાં C26 સિરામાઇડ છે, જે જંગલી પ્રકારના લિપિડ્સ સાથે તુલનાત્મક છે. ગુણવત્તા સમાન છે (આકૃતિ 3A) (26). તેથી, આનો અર્થ એ છે કે સિરામાઇડ રિમોડેલિંગ એન્ઝાઇમ Cwh43 C26 સિરામાઇડ માટે ખૂબ જ પસંદગીયુક્ત છે, જેમ કે આકૃતિ 26 માં બતાવ્યા પ્રમાણે, તે GhLag1 સ્ટ્રેનમાં C26 સિરામાઇડની થોડી માત્રામાંથી GPI એન્કરને પ્રાધાન્યમાં સમાવિષ્ટ કરે છે. S2 (29). તેમ છતાં, GhLag1 ના કોષ પટલમાં મૂળભૂત રીતે ફક્ત C18-C16 સિરામાઇડ હોય છે, જ્યારે Gas1-GFP માં હજુ પણ C26 સિરામાઇડ હોય છે. આ હકીકત આ સ્ટ્રેનને ER માં મેમ્બ્રેન સિરામાઇડની એસિલ ચેઇન લંબાઈની સમસ્યાને ખાસ કરીને ઉકેલવા માટે એક આદર્શ સાધન બનાવે છે. વર્ગ અને સૉર્ટિંગની કાલ્પનિક ભૂમિકા. પછી, અમે સૌપ્રથમ પરંપરાગત ફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા sec31-1 ના તાપમાન-સંવેદનશીલ મ્યુટન્ટ એલીલ સાથે GhLag1 માં ક્લસ્ટરોમાં C26 Gas1-GFP ની સંચય કરવાની ક્ષમતાનો અભ્યાસ કર્યો, જ્યાં ER મેમ્બ્રેન સિરામાઇડમાં ફક્ત લાંબી (C18-C16) સાંકળ અસ્તિત્વમાં છે (આકૃતિ 3). અમે અવલોકન કર્યું કે sec31-1 માં, મોટાભાગની Gas1-GFP ક્લસ્ટરોમાં કેન્દ્રિત હતી, જ્યારે sec31-1 GhLag1 માં લાંબી (C18-C16) લાંબી સિરામાઇડ ER મેમ્બ્રેન સાથે Gas1-GFP મુખ્યત્વે ક્લસ્ટર અને સમગ્ર ER મેમ્બ્રેનમાં વિતરિત નહોતી. ચોક્કસ કહીએ તો, કારણ કે C26 સિરામાઇડ-આધારિત ક્લસ્ટરિંગ ચોક્કસ ERES (આકૃતિ 1) સાથે ગાઢ રીતે સંબંધિત છે, અમે આગળ તપાસ કરી કે શું આ પ્રક્રિયામાં ER નિકાસ પ્રોટીન મિકેનિઝમનું કાર્ય પણ શામેલ હોઈ શકે છે. GPI-AP ER નિકાસ માટે એક ખાસ COPII સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરે છે, જે GPI એન્કર (30, 31) ના ગ્લાયકન ભાગના Ted1 ના માળખાકીય રિમોડેલિંગ દ્વારા સક્રિય રીતે નિયંત્રિત થાય છે. ત્યારબાદ રિકોમ્બિનન્ટ GPI-ગ્લાયકેનને ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન કાર્ગો રીસેપ્ટર p24 કોમ્પ્લેક્સ દ્વારા ઓળખવામાં આવે છે, જે બદલામાં Lst1 ને પસંદગીયુક્ત રીતે ભરતી કરે છે, જે મુખ્ય COPII કાર્ગો બંધનકર્તા સબ્યુનિટ Sec24 નું ચોક્કસ આઇસોફોર્મ છે, જે GPI-AP-સમૃદ્ધ COPII વેસિકલ્સ બનાવે છે (31-33). તેથી, અમે એક ડબલ મ્યુટન્ટ બનાવ્યું જેણે આ સિંગલ પ્રોટીન (p24 કોમ્પ્લેક્સ ઘટક Emp24, GPI-ગ્લાયકેન રિમોડેલિંગ એન્ઝાઇમ Ted1 અને ચોક્કસ COPII સબ્યુનિટ Lst1) ના ડિલીશનને sec31-1 મ્યુટન્ટ સ્ટ્રેન સાથે જોડ્યું, અને તેમનો અભ્યાસ કર્યો કે શું Gas1-ક્લસ્ટર GFP (આકૃતિ 3) બનાવવાનું શક્ય છે. અમે અવલોકન કર્યું કે sec31-1emp24Δ અને sec31-1ted1Δ માં, Gas1-GFP મુખ્યત્વે અનક્લસ્ટર્ડ છે અને સમગ્ર ER મેમ્બ્રેનમાં વિતરિત થાય છે, જેમ કે અગાઉ sec31-1 GhLag1 માં જોવા મળ્યું હતું, જ્યારે sec31-1lst1Δ માં, Gas1-GFP sec31-1 ની જેમ. આ પરિણામો દર્શાવે છે કે ER પટલમાં C26 સિરામાઇડની હાજરી ઉપરાંત, Gas1-GFP ના ક્લસ્ટરિંગને p24 સંકુલ સાથે પણ જોડવાની જરૂર છે, અને તેને ચોક્કસ Lst1 ભરતીની જરૂર નથી. પછી, અમે એ શક્યતા શોધી કાઢી કે ER પટલમાં સિરામાઇડની સાંકળ લંબાઈ Gas1-GFP ના p24 સાથે બંધનને નિયંત્રિત કરી શકે છે. જો કે, અમને જાણવા મળ્યું કે પટલમાં C18-C16 સિરામાઇડની હાજરી p24 સંકુલ (આકૃતિઓ S3 અને S4, A અને B) દ્વારા પુનઃનિર્મિત GPI-ગ્લાયકેન્સને અથવા GPI-AP સાથે બંધન અને GPI-AP નિકાસ કરવાની ક્ષમતાને અસર કરતી નથી. ભરતી COPII સબટાઇપ Lst1 (આકૃતિ S4C). તેથી, C26 સિરામાઇડ-આધારિત ક્લસ્ટરિંગને વિવિધ ER નિકાસ પ્રોટીન મિકેનિઝમ્સ સાથે પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની જરૂર નથી, પરંતુ લિપિડ લંબાઈ દ્વારા સંચાલિત વૈકલ્પિક સૉર્ટિંગ મિકેનિઝમને સમર્થન આપે છે. પછી, અમે વિશ્લેષણ કર્યું કે ER પટલમાં સિરામાઇડ એસિલ સાંકળ લંબાઈ Gas1-GFP ના પસંદગીયુક્ત ERES તરીકે અસરકારક વર્ગીકરણ માટે મહત્વપૂર્ણ છે કે નહીં. શોર્ટ-ચેઈન સિરામાઈડ સાથે GhLag1 સ્ટ્રેનમાં રહેલ Gas1 ER છોડીને પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેનમાં પ્રવેશ કરે છે (આકૃતિ S5), તેથી અમારું માનવું છે કે જો સિરામાઈડ એસિલ ચેઈનની લંબાઈ દ્વારા સૉર્ટિંગ ચલાવવામાં આવે છે, તો GhLag1 સ્ટ્રેનમાં રહેલ Gas1 ને રીડાયરેક્ટ અને ક્રોસ કરી શકાય છે. સમાન મેમ્બ્રેન સાથે ERES માલ.
(A) GhLag1 ના કોષ પટલમાં મુખ્યત્વે ટૂંકા C18-C16 સિરામાઇડ હોય છે, જ્યારે Gas1-GFP ના GPI એન્કરમાં હજુ પણ વાઇલ્ડ-ટાઇપ કોષો જેટલા જ C26 IPC હોય છે. ઉપર: માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (MS) દ્વારા વાઇલ્ડ-ટાઇપ (Wt) અને GhLag1p સ્ટ્રેઇનના કોષ પટલમાં સિરામાઇડનું એસીલ ચેઇન લંબાઈ વિશ્લેષણ. ડેટા કુલ સિરામાઇડની ટકાવારી દર્શાવે છે. ત્રણ સ્વતંત્ર પ્રયોગોની સરેરાશ. ભૂલ બાર = SD. બે-પૂંછડીવાળા અનપેયર્ડ ટી ટેસ્ટ. **** P ＜0.0001. નીચેનું પેનલ: વાઇલ્ડ-ટાઇપ અને GhLag1p સ્ટ્રેઇનમાં વ્યક્ત કરાયેલ Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI એન્કરમાં હાજર IPC ની એસીલ ચેઇન લંબાઈનું MS વિશ્લેષણ. ડેટા કુલ IPC સિગ્નલની ટકાવારી દર્શાવે છે. પાંચ સ્વતંત્ર પ્રયોગોની સરેરાશ. ભૂલ બાર = SD. બે-પૂંછડીવાળા અનપેયર્ડ ટી ટેસ્ટ. ns, મહત્વપૂર્ણ નથી. P = 0.9134. (B) ગેલેક્ટોઝ-પ્રેરિત Gas1-GFP વ્યક્ત કરતા sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ અને sec31-1lst1Δ કોષોના ફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોગ્રાફ્સ 30 મિનિટ માટે 37°C પર ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા હતા અને 24°C પછી નિયમિત ફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોસ્કોપી કરવા માટે પસાર કરવામાં આવ્યા હતા. સફેદ તીર: ER Gas1-GFP ક્લસ્ટર. ખુલ્લો તીર: અનક્લસ્ટર્ડ ગેસ1-GFP સમગ્ર ER પટલ પર વિતરિત થાય છે, જે ER લાક્ષણિકતા ન્યુક્લિયર રિંગ સ્ટેનિંગ દર્શાવે છે. સ્કેલ બાર, 5μm. (C) (B) માં વર્ણવેલ ફોટોમાઇક્રોગ્રાફનું પ્રમાણીકરણ. પંકટેટ Gas1-GFP રચનાવાળા કોષોની સરેરાશ ટકાવારી. ત્રણ સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાં, n≥300 કોષો. ભૂલ બાર = SD. બે-પૂંછડીવાળા અનપેયર્ડ t પરીક્ષણ. **** P ＜0.0001.
આ સમસ્યાનો સીધો ઉકેલ લાવવા માટે, અમે sec31-1 તાપમાન-સંવેદનશીલ મ્યુટન્ટ એલીલ (આકૃતિ 4 અને મૂવી S4) સાથે GhLag1 માં Gas1-GFP અને Mid2-iRFP નું SCLIM વિઝ્યુલાઇઝેશન કર્યું. ER ને 37°C પર રાખવામાં આવ્યા પછી અને ત્યારબાદ 24°C પર છોડવામાં આવ્યા પછી, પરંપરાગત માઇક્રોસ્કોપ દ્વારા અવલોકન કર્યા મુજબ, મોટાભાગના નવા સંશ્લેષિત Gas1-GFP ક્લસ્ટર અને સમગ્ર ER પટલમાં વિતરિત કરવામાં આવ્યા ન હતા (આકૃતિ 4, A અને B). વધુમાં, ERES (67%) ની મોટી ટકાવારી તેમાં સહ-સ્થિત બે પ્રકારના કાર્ગો (આકૃતિ 4D) નો સમાવેશ કરે છે. આકૃતિ 4C ના પેનલ 1 અને 2 માં Gas1-GFP અને Mid2-GFP ને ઓવરલેપ કરતા ERES ના બે લાક્ષણિક ઉદાહરણો દર્શાવે છે. વધુમાં, બંને માલને સમાન ERES (આકૃતિ 4E, પેનલ 3 અને મૂવી S4) માં ભરતી કરવામાં આવ્યા હતા. તેથી, અમારા પરિણામો સૂચવે છે કે ER પટલમાં સિરામાઇડ એસિલ સાંકળની લંબાઈ ER પ્રોટીન એકત્રીકરણ અને વર્ગીકરણનો એક મહત્વપૂર્ણ નિર્ણાયક છે.
ગેલેક્ટોઝ-પ્રેરિત સ્ત્રાવને વ્યક્ત કરતા Sec31-1 GhLag1 કોષો, Gas1-GFP (GPI-AP, લીલો) અને Mid2-iRFP (TMP, વાદળી) અને રચનાત્મક ERES-લેબલવાળા Sec13-mCherry (ERES, મેજેન્ટા) 37°C પર ઇન્ક્યુબેટ કરે છે. 30 મિનિટ સુધી ચાલુ રાખો, સ્ત્રાવ છોડવા માટે 24°C પર નીચે કરો, અને 20 મિનિટ પછી SCLIM સાથે છબી બનાવો. (A થી C) કાર્ગો અને ERES દ્વારા ચિહ્નિત 10 z-વિભાગોની પ્રતિનિધિ 2D પ્રોજેક્શન છબીઓ (A; સ્કેલ બાર, 1μm) અથવા 3D કોષ ગોળાર્ધ છબીઓ (B અને C; સ્કેલ એકમ, 0.45μm). (B) માં નીચલું પેનલ અને (C) માં પેનલ ફક્ત ERES (મેજેન્ટા) [Gas1-GFP (ગ્રે) અને Mid2-iRFP (આછો વાદળી)] માં હાજર માલ પ્રદર્શિત કરવા માટે પ્રોસેસ્ડ છબીઓ પ્રદર્શિત કરે છે. (C) સફેદ ભરેલું તીર: ERES, માલ ઓવરલેપ થાય છે. ખુલ્લો તીર: ERES માં ફક્ત એક જ વસ્તુ છે. નીચલું પેનલ: પસંદ કરેલ ERES માં ઓવરલેપિંગ માલ (1 અને 2) (C) માં ચિહ્નિત થયેલ છે. સ્કેલ બાર, 100 nm. (D) (C) માં વર્ણવેલ ફોટોમાઇક્રોગ્રાફનું પ્રમાણીકરણ. sec31-1 અને sec31-1 GhLag1 એકમોમાં, ફક્ત એક જ કાર્ગો (Gas1-GFP અથવા Mid2-iRFP) શામેલ છે, અને અલગ કાર્ગો અને ઓવરલેપિંગ કાર્ગો માટે ERES ની સરેરાશ ટકાવારી. ત્રણ સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાં, 54 કોષોમાં n = 432 (sec31-1) અને 47 કોષોમાં n = 430 (sec31-1 GhLag1). ભૂલ બાર = SD. બે-પૂંછડી વગરનું t પરીક્ષણ. *** P = 0.0002 (sec31-1) અને ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) પસંદ કરેલ ERES ની 3D છબી જેમાં ઓવરલેપિંગ કાર્ગો (3) (C) માં ચિહ્નિત થયેલ છે. ગેસ1-જીએફપી (લીલો) અને મિડ2-આઇઆરએફપી (વાદળી) એક જ બાજુથી ERES (મેજેન્ટા) તરફ આવે છે અને તે જ ERES પ્રતિબંધિત ક્ષેત્રમાં રહે છે. સ્કેલ બાર, 100 એનએમ.
આ અભ્યાસ સીધો ઇન વિવો પુરાવો પૂરો પાડે છે કે લિપિડ-આધારિત પ્રોટીન કાર્ગોને સ્ત્રાવ માર્ગમાં પસંદગીયુક્ત નિકાસ સ્થળોમાં વર્ગીકૃત કરવામાં આવે છે, અને વર્ગીકરણ પસંદગી માટે એસિલ ચેઇન લંબાઈનું મહત્વ છતી કરે છે. SCLIM નામની શક્તિશાળી અને અત્યાધુનિક માઇક્રોસ્કોપી તકનીકનો ઉપયોગ કરીને, અમે યીસ્ટમાં નવા સંશ્લેષિત Gas1-GFP (ખૂબ લાંબી એસિલ ચેઇન (C26) સિરામાઇડ લિપિડ ભાગ સાથેનું મુખ્ય પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેન GPI-AP) દર્શાવ્યું. ડિસ્ક્રીટ ER માં ક્લસ્ટર થયેલા પ્રદેશો ચોક્કસ ERES સાથે સંકળાયેલા છે, જ્યારે ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન સ્ત્રાવિત પ્રોટીન સમગ્ર ER મેમ્બ્રેનમાં વિતરિત થાય છે (આકૃતિ 1). વધુમાં, આ બે પ્રકારના માલ વિવિધ ERES માં પસંદગીયુક્ત રીતે પ્રવેશ કરે છે (આકૃતિ 2). પટલમાં સેલ્યુલર સિરામાઇડની એસિલ ચેઇન લંબાઈ C26 થી C18-C16 સુધી ઘટાડી દેવામાં આવે છે, Gas1-GFP ક્લસ્ટર ડિસ્ક્રીટ ER ક્ષેત્રમાં વિક્ષેપિત થાય છે, અને Gas1-GFP ને ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન પ્રોટીન સાથે ER છોડવા માટે ફરીથી રૂટ કરવામાં આવે છે (આકૃતિ 3 અને આકૃતિ 3). 4).
જોકે GPI-AP ER માંથી બહાર નીકળવા માટે વિશિષ્ટ પ્રોટીન મિકેનિઝમનો ઉપયોગ કરે છે, અમે જોયું કે C26 સિરામાઇડ-આધારિત વિભાજન વિભેદક પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ પર આધાર રાખતું નથી જે ERES વિશેષતા તરફ દોરી શકે છે (આકૃતિઓ S4 અને S5). તેના બદલે, અમારા તારણો લિપિડ-આધારિત પ્રોટીન ક્લસ્ટરિંગ અને અન્ય કાર્ગોના અનુગામી બાકાત દ્વારા સંચાલિત વૈકલ્પિક વર્ગીકરણ પદ્ધતિને સમર્થન આપે છે. અમારા અવલોકનો સૂચવે છે કે ચોક્કસ ERES સાથે સંકળાયેલ Gas1-GFP પ્રદેશ અથવા ક્લસ્ટરમાં ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન સ્ત્રાવિત પ્રોટીન Mid2-iRFPનો અભાવ છે, જે સૂચવે છે કે C26 સિરામાઇડ-આધારિત GPI-AP ક્લસ્ટર સંબંધિત ERES માં તેમના પ્રવેશને સરળ બનાવશે, અને તે જ સમયે, ટ્રાન્સમેમ્બ્રેનને બાકાત રાખશે. સ્ત્રાવ આ ચોક્કસ ERES માં પ્રવેશ કરે છે (આકૃતિઓ 1 અને 2). તેનાથી વિપરીત, ER પટલમાં C18-C16 સિરામાઇડ્સની હાજરી GPI-AP ને પ્રદેશો અથવા ક્લસ્ટર બનાવવાનું કારણ બનતી નથી, તેથી તેઓ ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન સ્ત્રાવિત પ્રોટીનને સમાન ERES માં બાકાત રાખતા નથી અથવા બદલતા નથી (આકૃતિઓ 3 અને 4). તેથી, અમે પ્રસ્તાવ મૂકીએ છીએ કે C26 સિરામાઇડ ચોક્કસ ERES સાથે જોડાયેલા પ્રોટીનના ક્લસ્ટરિંગને સરળ બનાવીને અલગતા અને વર્ગીકરણને પ્રોત્સાહન આપે છે.
ચોક્કસ ER વિસ્તારમાં આ C26 સિરામાઇડ-આધારિત ક્લસ્ટરિંગ કેવી રીતે પ્રાપ્ત કરવું? પટલ સિરામાઇડની બાજુમાં અલગ થવાની વૃત્તિ GPI-AP અને C26 સિરામાઇડને ER પટલના વધુ અનિયમિત લિપિડ વાતાવરણમાં નાના અને તાત્કાલિક ક્રમબદ્ધ લિપિડ બનાવવાનું કારણ બની શકે છે જેમાં ટૂંકા અને અસંતૃપ્ત ગ્લિસરોલિપિડ્સ હોય છે. ગુણવત્તાયુક્ત ક્લસ્ટરો (17, 18). p24 કોમ્પ્લેક્સ (34) સાથે જોડાયા પછી આ નાના કામચલાઉ ક્લસ્ટરોને વધુ મોટા, વધુ સ્થિર ક્લસ્ટરોમાં ફ્યુઝ કરી શકાય છે. આ સાથે સુસંગત, અમે બતાવ્યું કે C26 Gas1-GFP ને મોટા દૃશ્યમાન ક્લસ્ટરો બનાવવા માટે p24 કોમ્પ્લેક્સ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરવાની જરૂર છે (આકૃતિ 3). p24 કોમ્પ્લેક્સ એ યીસ્ટ (35) માં ચાર અલગ અલગ p24 ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન પ્રોટીનથી બનેલું એક હેટરોઝાયગસ ઓલિગોમર છે, જે મલ્ટિવેલેન્ટ બંધન પૂરું પાડે છે, જે નાના GPI-AP ક્લસ્ટરોના ક્રોસ-લિંકિંગ તરફ દોરી શકે છે, જેનાથી મોટા સ્ટેબલ ક્લસ્ટર (34) ઉત્પન્ન થાય છે. GPI-APs ના પ્રોટીન એક્ટોડોમેન્સ વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા પણ તેમના એકત્રીકરણમાં ફાળો આપી શકે છે, જેમ કે સસ્તન પ્રાણીઓના ધ્રુવીકૃત ઉપકલા કોષોમાં તેમના ગોલ્ગી પરિવહન દરમિયાન દર્શાવવામાં આવ્યું છે (36). જો કે, જ્યારે C18-C16 સિરામાઇડ ER પટલમાં હાજર હોય છે, જ્યારે p24 સંકુલ Gas1-GFP સાથે જોડાય છે, ત્યારે મોટા અલગ ક્લસ્ટરો રચાશે નહીં. અંતર્ગત પદ્ધતિ લાંબા એસીલ ચેઇન સિરામાઇડના ચોક્કસ ભૌતિક અને રાસાયણિક ગુણધર્મો પર આધાર રાખી શકે છે. કૃત્રિમ પટલના બાયોફિઝિકલ અભ્યાસો દર્શાવે છે કે લાંબા (C24) અને ટૂંકા (C18-C16) એસિલ ચેઇન સિરામાઇડ બંને તબક્કાના વિભાજનનું કારણ બની શકે છે, પરંતુ ફક્ત લાંબા એસીલ ચેઇન સિરામાઇડ્સ (C24) ફિલ્મને ફરીથી આકાર આપવા માટે ઉચ્ચ વક્રતા અને ફિલ્મ બેન્ડિંગને પ્રોત્સાહન આપી શકે છે. પરસ્પર સંદર્ભ દ્વારા (17, 37, 38). એવું દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે TMED2 નું ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન હેલિક્સ, Emp24 નું માનવ હોમોલોગ, સાયટોપ્લાઝમિક લોબ્યુલ્સ (39) માં C18 સિરામાઇડ-આધારિત સ્ફિંગોમીલિન સાથે પસંદગીયુક્ત રીતે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે. મોલેક્યુલર ડાયનેમિક્સ (MD) સિમ્યુલેશનનો ઉપયોગ કરીને, અમે જોયું કે C18 અને C26 બંને સિરામાઇડ્સ Emp24 ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન હેલિક્સના સાયટોપ્લાઝમિક લોબ્યુલ્સની આસપાસ એકઠા થાય છે, અને તેમની પસંદગીઓ સમાન છે (આકૃતિ S6). એ નોંધવું યોગ્ય છે કે આ સૂચવે છે કે Emp24 નું ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન હેલિક્સ પટલમાં લિપિડ્સના અસમપ્રમાણ વિતરણ તરફ દોરી શકે છે. આ સસ્તન કોષો પર આધારિત તાજેતરનું પરિણામ છે. સમાન MD સિમ્યુલેશન્સ પણ ઈથર લિપિડ્સ (40) ની હાજરી દર્શાવે છે. તેથી, અમે અનુમાન કરીએ છીએ કે ER26 ના બે લોબ્યુલ્સમાં C26 સિરામાઇડ સ્થાનિક રીતે સમૃદ્ધ છે. જ્યારે લ્યુમિનલ લોબ્યુલ્સમાં GPI-AP સીધા મલ્ટિવેલેન્ટ p24 સાથે જોડાય છે અને સાયટોપ્લાઝમિક લોબ્યુલ્સમાં p24 ની આસપાસ C26 સિરામાઇડનું સંચય થાય છે, ત્યારે તે આંગળીઓ દ્વારા પ્રોટીન એકત્રીકરણ અને પટલ વક્રતા ઉત્પન્ન થવાને પ્રોત્સાહન આપી શકે છે (41), જેના કારણે GPI-AP ERES ને અડીને આવેલા અલગ પ્રદેશોમાં વિભાજિત થાય છે, જે ER પટલના અત્યંત વક્ર પ્રદેશોને પણ અનુકૂળ કરે છે (42). અગાઉના અહેવાલોએ પ્રસ્તાવિત પદ્ધતિને ટેકો આપ્યો હતો (43, 44). પ્લાઝ્મા પટલ પર ઓલિગોલેક્ટીન, પેથોજેન્સ અથવા એન્ટિબોડીઝનું સિરામાઇડ-આધારિત ગ્લાયકોસ્ફિન્ગોલિપિડ્સ (GSL) સાથે મલ્ટિવેલેન્ટ બંધન મોટા GSL એકત્રીકરણને ઉત્તેજિત કરે છે, તબક્કાના વિભાજનને વધારે છે અને પટલ વિકૃતિ અને આંતરિકકરણનું કારણ બને છે (44). ઇવાબુચી વગેરે (43) એવું જાણવા મળ્યું કે લાંબી (C24) પરંતુ ટૂંકી નહીં (C16) એસિલ સાંકળોની હાજરીમાં, GSL લેક્ટોસિલસેરામાઇડ સાથે બંધાયેલ મલ્ટિવેલેન્ટ લિગાન્ડ મોટા ક્લસ્ટરો અને મેમ્બ્રેન ઇન્વેજિનેશનનું નિર્માણ કરે છે, અને પત્રિકાઓ પર સાયટોપ્લાઝમ લિન-મધ્યસ્થી સિગ્નલ ટ્રાન્સડક્શન જોડાયેલ ન્યુટ્રોફિલ્સમાં એસિલ સાંકળો દ્વારા ઇન્ટરડિજિટેડ થાય છે.
સસ્તન પ્રાણીઓના ધ્રુવીકૃત ઉપકલા કોષોમાં, એન્ટિ-ગોલ્ગી નેટવર્ક (TGN) ની સાંદ્રતા એપિકલ પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેનના સ્તર સુધી GPI-AP ના વિભાજન અને વર્ગીકરણને નિયંત્રિત કરે છે (10, 45). આ એકત્રીકરણ GPI-AP ઓલિગોમરાઇઝેશન (36) દ્વારા ચલાવવામાં આવે છે, પરંતુ તે યીસ્ટમાં આપણે જે સિરામાઇડ સાંકળ લંબાઈ શોધીએ છીએ તેના પર પણ આધાર રાખી શકે છે. જોકે સસ્તન પ્રાણીઓના GPI-AP માં ઇથર લિપિડ-આધારિત એન્કર હોય છે, અને તેનું રાસાયણિક માળખું ખૂબ જ લાંબા એસીલ સાંકળ સિરામાઇડથી ખૂબ જ અલગ છે, તાજેતરના એક અભ્યાસમાં જાણવા મળ્યું છે કે બંને લિપિડમાં ઉત્ક્રાંતિપૂર્વક સમાન ભૌતિક અને રાસાયણિક ગુણધર્મો અને કાર્ય છે (40). તેથી, સસ્તન પ્રાણીઓના કોષોમાં ઇથર લિપિડ ભાગ યીસ્ટમાં C26 સિરામાઇડ જેવો હોઈ શકે છે, અને તેની ભૂમિકા GPI-AP એકત્રીકરણ અને વર્ગીકરણને પ્રોત્સાહન આપવા માટે પટલમાં લાંબા-સાંકળ સિરામાઇડ સાથે સાંકળવાની છે. જોકે આ શક્યતાનું હજુ પણ સીધું પરીક્ષણ કરવાની જરૂર છે, અગાઉના તારણો એ વાતને સમર્થન આપે છે કે ગોલ્ગી બોડીમાં લાંબા એસીલ ચેઇન સિરામાઇડનું પરિવહન સાયટોપ્લાઝમિક ટ્રાન્સફર પ્રોટીન દ્વારા કરવામાં આવતું નથી, પરંતુ તે યીસ્ટ જેવા GPI એન્કરના સંશ્લેષણ પર આધાર રાખે છે. તેથી, ઉત્ક્રાંતિવાદી રૂઢિચુસ્ત પદ્ધતિ ખૂબ જ લાંબા એસીલ ચેઇન સિરામાઇડ અને GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ને સમાન પરિવહન વેસિકલમાં પસંદગીયુક્ત રીતે સહ-પરિવહન કરવામાં સક્ષમ હોય તેવું લાગે છે.
યીસ્ટ અને સસ્તન પ્રાણીઓના ધ્રુવીકૃત ઉપકલા કોષ પ્રણાલીઓમાં, GPI-AP એકત્રીકરણ અને અન્ય પ્લાઝ્મા પટલ પ્રોટીનથી અલગ થવું બધું કોષ સપાટી પર પહોંચતા પહેલા થાય છે. પેલાડિનો એટ અલ. (48) એ શોધી કાઢ્યું કે સસ્તન પ્રાણીઓના ધ્રુવીકૃત ઉપકલા કોષોના TGN પર, GPI-AP ક્લસ્ટરિંગ ફક્ત GPI-APs ના પસંદગીયુક્ત વર્ગીકરણ માટે જ જરૂરી નથી, પરંતુ GPI-APs ના ક્લસ્ટરિંગ સંગઠન અને તેની જૈવિક પ્રવૃત્તિને પણ નિયંત્રિત કરે છે. કોષ સપાટી. યીસ્ટમાં, આ અભ્યાસ દર્શાવે છે કે ER પર C26 સિરામાઇડ-આધારિત GPI-AP ક્લસ્ટર પ્લાઝ્મા પટલ પર GPI-AP ની ક્લસ્ટર સંસ્થા અને કાર્યાત્મક પ્રવૃત્તિને નિયંત્રિત કરી શકે છે (24, 49). આ મોડેલ સાથે સુસંગત, GhLag1 કોષો GPI અવરોધકો અથવા દવાઓથી એલર્જીક છે જે કોષ દિવાલની અખંડિતતાને અસર કરે છે (28), અને યીસ્ટ કોષોના સમાગમમાં પ્રક્ષેપિત ટીપ સિરામાઇડના કાર્યાત્મક Gas1-GFP ક્લસ્ટર (49) ની જરૂરિયાત G​​​ સૂચવે છે​​hLag1 કોષોના શક્ય શારીરિક પરિણામો. GPI-AP ભૂલ. જોકે, કોષ સપાટીના કાર્યાત્મક સંગઠનને લિપિડ લંબાઈના આધારે વર્ગીકરણ પદ્ધતિ દ્વારા ER માંથી પ્રોગ્રામ કરવામાં આવ્યું છે કે કેમ તે વધુ પરીક્ષણ એ અમારા ભવિષ્યના સંશોધનનો વિષય હશે.
આ કાર્યમાં ઉપયોગમાં લેવાતા Saccharomyces cerevisiae સ્ટ્રેન્સ કોષ્ટક S1 માં સૂચિબદ્ધ છે. લાઇવ સેલ ઇમેજિંગ માટે SCLIM ના MMY1583 અને MMY1635 સ્ટ્રેન્સ W303 ની પૃષ્ઠભૂમિમાં બનાવવામાં આવ્યા હતા. ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન ટેગ સાથે Sec13-mCherry ને વ્યક્ત કરતા આ સ્ટ્રેન્સ પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન (PCR) આધારિત પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને pFA6a પ્લાઝમિડને ટેમ્પલેટ તરીકે (23) તરીકે બનાવવામાં આવ્યા હતા. GAL1 પ્રમોટરના નિયંત્રણ હેઠળ ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન સાથે લેબલ થયેલ Mid2-iRFP ને વ્યક્ત કરતો સ્ટ્રેન નીચે મુજબ બનાવવામાં આવ્યો હતો. pKTiRFP-KAN વેક્ટર (E. O'Shea ની ભેટ, Addgene plasmid નંબર 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; સંશોધન સંસાધન ઓળખકર્તા (RRID): Addgene_64687) માંથી iRFP-KanMx સિક્વન્સનું PCR એમ્પ્લીફિકેશન અને એન્ડોજેનસ Mid2 ના C-ટર્મિનસમાં દાખલ કરવામાં આવ્યું. Mid2-iRFP જીનોમ સિક્વન્સને GAL1 પ્રમોટરમાં એમ્પ્લીફાઇડ અને ક્લોન કર્યા પછી, તેને ઇન્ટિગ્રેશન પ્લાઝમિડ pRS306 ના Not I-Sac I સાઇટમાં એકીકૃત કરવામાં આવ્યું. પરિણામી પ્લાઝમિડ pRGS7 ને URA3 લોકસમાં એકીકૃત કરવા માટે Pst I સાથે રેખીય કરવામાં આવ્યું.
Gas1-GFP ફ્યુઝન જનીન સેન્ટ્રોમેર (CEN) પ્લાઝમિડમાં GAL1 પ્રમોટરના નિયંત્રણ હેઠળ વ્યક્ત થાય છે, જે નીચે મુજબ બનેલ છે. Gas1-GFP ક્રમને pRS416-GAS1-GFP પ્લાઝમિડ (24) (L. Popolo ની ભેટ) માંથી PCR દ્વારા વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યો હતો અને CEN પ્લાઝમિડ pBEVY-GL LEU2 (C ની ભેટ) ના Xma I–Xho I સાઇટમાં ક્લોન કરવામાં આવ્યો હતો. મિલર; એડજીન પ્લાઝમિડ નંબર 51225; http://n2t.net/adddene: 51225; RRID: Adddene_51225). પરિણામી પ્લાઝમિડને pRGS6 નામ આપવામાં આવ્યું હતું. Axl2-GFP ફ્યુઝન જનીન પણ pBEVY-GL LEU2 વેક્ટરના GAL1 પ્રમોટરના નિયંત્રણ હેઠળ વ્યક્ત થાય છે, અને તેનું બાંધકામ નીચે મુજબ છે. Axl2-GFP ક્રમને PCR દ્વારા pRS304-p2HSE-Axl2-GFP પ્લાઝમિડ (23) માંથી વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યો હતો, અને pBEVY-GL LEU2 વેક્ટરના Bam HI-Pst I સાઇટમાં ક્લોન કરવામાં આવ્યો હતો. પરિણામી પ્લાઝમિડને pRGS12 નામ આપવામાં આવ્યું હતું. આ અભ્યાસમાં ઉપયોગમાં લેવાતા ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સનો ક્રમ કોષ્ટક S2 માં સૂચિબદ્ધ છે.
આ સ્ટ્રેનને 0.2% એડેનિન અને 2% ગ્લુકોઝ [YP-ડેક્સ્ટ્રોઝ (YPD)], 2% રેફિનોઝ [YP-રેફિનોઝ] સમૃદ્ધ યીસ્ટ અર્ક પ્રોટીન p (YP) માધ્યમ (1% યીસ્ટ અર્ક અને 2% પ્રોટીન ept). (YPR)] અથવા 2% ગેલેક્ટોઝ [YP-ગેલેક્ટોઝ (YPG)] કાર્બન સ્ત્રોત તરીકે, અથવા કૃત્રિમ ન્યૂનતમ માધ્યમ (0.15% યીસ્ટ નાઇટ્રોજન બેઝ અને 0.5% એમોનિયમ સલ્ફેટ) માં પોષણ માટે જરૂરી યોગ્ય એમિનો એસિડ અને બેઝને પૂરક બનાવવા માટે પૂરક બનાવવામાં આવ્યું હતું, અને તેમાં કાર્બન સ્ત્રોત તરીકે 2% ગ્લુકોઝ (કૃત્રિમ ગ્લુકોઝ ન્યૂનતમ માધ્યમ) અથવા 2% ગેલેક્ટોઝ (કૃત્રિમ ગેલેક્ટોઝ ન્યૂનતમ માધ્યમ) હતું.
રીઅલ-ટાઇમ ઇમેજિંગ માટે, GAL1 પ્રમોટર હેઠળ રચના વ્યક્ત કરતા તાપમાન-સંવેદનશીલ sec31-1 મ્યુટન્ટ કોષોને YPR માધ્યમમાં 24°C પર રાતોરાતથી મધ્ય-લોગ તબક્કામાં ઉગાડવામાં આવ્યા હતા. YPG માં 1 કલાક માટે 24°C પર ઇન્ડક્શન પછી, કોષોને SG માં 30 મિનિટ માટે 37°C પર ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા હતા, અને પછી સ્ત્રાવ બ્લોકમાંથી મુક્ત થવા માટે 24°C પર સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા. કોનકેનાવાલિન A નો ઉપયોગ કાચની સ્લાઇડ પર કોષોને ઠીક કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો અને SCLIM દ્વારા છબી બનાવવામાં આવી હતી. SCLIM એ Olympus IX-71 ઇન્વર્ટેડ ફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોસ્કોપ અને UPlanSApo 100×1.4 ન્યુમેરિકલ એપરચર ઓઇલ લેન્સ (ઓલિમ્પસ), હાઇ-સ્પીડ અને હાઇ-સિગ્નલ-ટુ-નોઇઝ રેશિયો રોટેટિંગ ડિસ્ક કોન્ફોકલ સ્કેનર (યોકોગાવા ઇલેક્ટ્રિક), કસ્ટમ સ્પેક્ટ્રોમીટર અને કસ્ટમ કૂલિંગનું સંયોજન છે. સિસ્ટમનું ઇમેજ ઇન્ટેન્સિફાયર (હમામાત્સુ ફોટોનિક્સ) ×266.7 ના અંતિમ મેગ્નિફિકેશન સાથે મેગ્નિફાઇંગ લેન્સ સિસ્ટમ અને ઇલેક્ટ્રોનને ગુણાકાર કરતો ચાર્જ-કપ્લ્ડ ડિવાઇસ કેમેરા (21) પ્રદાન કરી શકે છે. ઇમેજ એક્વિઝિશન કસ્ટમ સોફ્ટવેર (યોકોગાવા ઇલેક્ટ્રિક) દ્વારા કરવામાં આવે છે. 3D છબીઓ માટે, અમે ઑબ્જેક્ટિવ લેન્સને ઊભી રીતે વાઇબ્રેટ કરવા માટે કસ્ટમ-મેઇડ પીઝોઇલેક્ટ્રિક એક્ટ્યુએટરનો ઉપયોગ કર્યો, અને સ્ટેકમાં 100 nm ના અંતરે ઓપ્ટિકલ ભાગો એકત્રિત કર્યા. Z-સ્ટેક છબીને 3D વોક્સેલ ડેટામાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવે છે, અને ફરતી ડિસ્ક કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપ માટે ઉપયોગમાં લેવાતા સૈદ્ધાંતિક બિંદુ સ્પ્રેડ ફંક્શનનો ઉપયોગ વોલોસિટી સોફ્ટવેર (પર્કિનએલ્મર) દ્વારા ડીકોનવોલ્યુશન પ્રોસેસિંગ માટે થાય છે. સહ-સ્થાન વિશ્લેષણ માટે આપમેળે થ્રેશોલ્ડ માટે વોલોસિટી સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને, કાર્ગો સહિત ERES માપવામાં આવ્યું. મેટામોર્ફ સોફ્ટવેર (મોલેક્યુલર ડિવાઇસીસ) નો ઉપયોગ કરીને લાઇન સ્કેન વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું.
આંકડાકીય મહત્વ નક્કી કરવા માટે ગ્રાફપેડ પ્રિઝમ સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરો. બે-પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીના ટી-ટેસ્ટ અને સામાન્ય એક-માર્ગી વિશ્લેષણ ઓફ વેરિઅન્સ (ANOVA) ટેસ્ટ માટે, જૂથો વચ્ચેના તફાવતોને P <0.05 (*) પર નોંધપાત્ર અસર કરતા માનવામાં આવે છે.
ગેસ1-જીએફપીના ફ્લોરોસેન્સ માઈક્રોસ્કોપી માટે, લોગ ફેઝ કોષોને રાતોરાત YPD માં ઉગાડવામાં આવ્યા હતા અને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા, ફોસ્ફેટ બફરવાળા ખારાથી બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા, અને ઓછામાં ઓછા 15 મિનિટ માટે બરફ પર ઉકાળવામાં આવ્યા હતા, અને પછી અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ માઇક્રોસ્કોપ હેઠળ આગળ વધ્યા હતા. ચેક (24). લેઇકા DMi8 માઇક્રોસ્કોપ (HCX PL APO 1003/1.40 ઓઇલ PH3 CS) એક ઓબ્જેક્ટિવ લેન્સ, L5 (GFP) ફિલ્ટર, હમામાત્સુ કેમેરા અને એપ્લિકેશન સ્યુટ X (LAS X) સોફ્ટવેરથી સજ્જ છે જેનો ઉપયોગ સંપાદન માટે કરવામાં આવ્યો હતો. .
નમૂનાઓને 65°C તાપમાને SDS નમૂના બફર સાથે 10 મિનિટ માટે વિકૃત કરવામાં આવ્યા હતા, અને પછી SDS-પોલિયાક્રિલામાઇડ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ (PAGE) દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યા હતા. ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ વિશ્લેષણ માટે, પ્રતિ લેન 10 μl નમૂના લોડ કરવામાં આવ્યા હતા. પ્રાથમિક એન્ટિબોડી: 1:3000 ના મંદન પર રેબિટ પોલીક્લોનલ એન્ટિ-ગેસ1, 1:500 ના મંદન પર રેબિટ પોલીક્લોનલ એન્ટિ-એમ્પ24 અને 1:3000 ના મંદન પર રેબિટ પોલીક્લોનલ એન્ટિ-GFP (H. Riezman તરફથી ભેટ) નો ઉપયોગ કરો. માઉસ મોનોક્લોનલ એન્ટિ-Pgk1 એન્ટિબોડીનો ઉપયોગ 1:5000 ના મંદન પર કરવામાં આવ્યો હતો (જે. ડે લા ક્રુઝ તરફથી ભેટ). ગૌણ એન્ટિબોડી: હોર્સરાડિશ પેરોક્સિડેઝ (HRP) કન્જુગેટેડ બકરી એન્ટી-રેબિટ ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન G (IgG) નો ઉપયોગ 1:3000 (પિયર્સ તરફથી ભેટ) ના મંદન પર થાય છે. HRP-સંયુક્ત બકરી વિરોધી ઉંદર IgG નો ઉપયોગ 1:3000 (પિયર્સ) ના મંદન પર કરવામાં આવ્યો હતો. સુપરસિગ્નલ વેસ્ટ પીકો રીએજન્ટ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) ની કેમિલ્યુમિનેસેન્સ પદ્ધતિ દ્વારા રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવ ઝોનનું અવલોકન કરવામાં આવ્યું હતું.
(31) માં વર્ણવ્યા મુજબ, સમૃદ્ધ ER અપૂર્ણાંક પર કુદરતી રોગપ્રતિકારક શક્તિનો પ્રયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. ટૂંકમાં, યીસ્ટ કોષોને TNE બફર [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride અને protease inhibitor mixture) સાથે 600 nm (OD600) પર 100 ઓપ્ટિકલ ઘનતા પર બે વાર ધોવા. તેને કાચના મણકાથી તોડી નાખવામાં આવ્યું હતું, અને પછી કોષના ભંગાર અને કાચના મણકા સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા દૂર કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ સુપરનેટન્ટને 17,000 ગ્રામ પર 4°C પર 15 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું. પેલેટને TNE માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યું હતું અને ડિજિટલિસ સેપોનિનને 1% ની અંતિમ સાંદ્રતામાં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. સસ્પેન્શનને 4°C પર પરિભ્રમણ સાથે 1 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું હતું, અને પછી અદ્રાવ્ય ઘટકોને 13,000 ગ્રામ પર 4°C પર 60 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુજેશન દ્વારા દૂર કરવામાં આવ્યા હતા. Gas1-GFP ઇમ્યુનોપ્રીસિપિટેશન માટે, પહેલા નમૂનાને ખાલી એગારોઝ બીડ્સ (ChromoTek) સાથે 4°C પર 1 કલાક માટે પ્રી-ઇન્ક્યુબેટ કરો, અને પછી GFP-Trap_A (ChromoTek) સાથે 4°C પર 3 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો. ઇમ્યુનોપ્રીસિપિટેટેડ બીડ્સને 0.2% ડિગોક્સિજેનિન ધરાવતા TNE સાથે પાંચ વખત ધોવામાં આવ્યા હતા, SDS નમૂના બફર સાથે એલ્યુટ કરવામાં આવ્યા હતા, SDS-PAGE પર અલગ કરવામાં આવ્યા હતા, અને ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
(31) માં વર્ણવ્યા મુજબ, સમૃદ્ધ ER અપૂર્ણાંક પર ક્રોસ-લિંકિંગ નિર્ધારણ કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, સમૃદ્ધ ER અપૂર્ણાંકને 0.5 mM ડાયથિઓબિસ (સક્સિનિમિડાઇલ પ્રોપિયોનેટ) (પિયર્સ, થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, રોકફોર્ડ, IL, USA; 20°C, 20 મિનિટ) સાથે ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યો હતો. ક્રોસલિંકિંગ પ્રતિક્રિયા ગ્લાયસીન (50 mM અંતિમ સાંદ્રતા, 5 મિનિટ, 20°C) ઉમેરીને શાંત કરવામાં આવી હતી.
અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ (50), વાઇલ્ડ-ટાઇપ અને GhLag1 સ્ટ્રેનમાં સિરામાઇડનું MS વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, કોષોને YPD માં 30°C પર ઘાતાંકીય તબક્કા (3 થી 4 OD600 યુનિટ/મિલી) સુધી ઉગાડવામાં આવ્યા હતા, અને 25×107 કોષો કાપવામાં આવ્યા હતા. તેમના ચયાપચયને ટ્રાઇક્લોરોએસેટીક એસિડથી શાંત કરવામાં આવે છે. નિષ્કર્ષણ દ્રાવક [ઇથેનોલ, પાણી, ઇથર, પાયરિડિન અને 4.2 N એમોનિયમ હાઇડ્રોક્સાઇડ (15:15:5:1:0.018 v/v)] અને આંતરિક માનક C17 સિરામાઇડ (860517, અવંતી ધ્રુવીય લિપિડ) ગુણવત્તાના 1.2 nmol નો ઉપયોગ કરો. અર્કનું હળવું આલ્કલાઇન હાઇડ્રોલિસિસ કરવા માટે મોનોમેથિલામાઇન રીએજન્ટ [મિથેનોલ, પાણી, n-બ્યુટેનોલ અને મેથિલામાઇન દ્રાવણ (4:3:1:5 v/v)] નો ઉપયોગ કરો, અને પછી ડિસોલ્ટ કરવા માટે પાણી-સંતૃપ્ત n-બ્યુટેનોલનો ઉપયોગ કરો. અંતે, અર્કને પોઝિટિવ મોડ સોલવન્ટ [ક્લોરોફોર્મ/મિથેનોલ/પાણી (2:7:1) + 5 mM એમોનિયમ એસિટેટ] માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યો અને માસ સ્પેક્ટ્રોમીટરમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યો. સ્ફિન્ગોલિપિડ પરમાણુઓની ઓળખ અને માત્રા નક્કી કરવા માટે મલ્ટી-રિએક્શન મોનિટરિંગ (MRM) કરવામાં આવ્યું. TSQ વેન્ટેજ ટર્શરી ક્વાડ્રુપોલ માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) લિપિડ વિશ્લેષણ માટે રોબોટિક નેનોફ્લો આયન સ્ત્રોત નેનોમેટ HD (એડ્વિયન બાયોસાયન્સ, ઇથાકા, NY) થી સજ્જ છે. દરેક સિરામાઇડ શ્રેણી માટે અથડામણ ઊર્જા ઑપ્ટિમાઇઝ કરવામાં આવી છે. MS ડેટા પોઝિટિવ મોડમાં મેળવવામાં આવ્યો હતો. દરેક જૈવિક પ્રતિકૃતિ માટે, લિપિડ સિગ્નલ ત્રણ સ્વતંત્ર માપનો મધ્યક છે.
(31) માં વર્ણવ્યા મુજબ, Gas1-GFP દર્શાવતા કોષો (800×107) કુદરતી રોગપ્રતિકારક શક્તિને આધિન હતા. શુદ્ધ કરેલ Gas1-GFP ને SDS-PAGE દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યું હતું અને પોલીવિનાઇલિડીન ફ્લોરાઇડ (PVDF) પટલમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યું હતું. પ્રોટીનને PVDF ને એમાઇડ બ્લેકથી રંગીને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવ્યું હતું. Gas1-GFP બેન્ડને PVDF માંથી કાપીને 5 વખત મિથેનોલથી અને એક વખત લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી-MS (LC-MS) ગ્રેડ પાણીથી ધોવામાં આવ્યું હતું. પટલ સ્ટ્રીપને 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), બફર અને 500μl તાજા ઓગળેલા 1 M સોડિયમ નાઇટ્રાઇટ મિશ્રણ સાથે 3 કલાક માટે 37°C પર ઉકાળીને, લિપિડ અપૂર્ણાંક Gas1-GFP માંથી મુક્ત થાય છે અને ગ્લુકોસામાઇન અને ઇનોસિટોલ (51) વચ્ચે ઇનોસિન ફોસ્ફેટ સિરામાઇડનું પ્રકાશન થાય છે. તે પછી, પટલ સ્ટ્રીપને LC-MS ગ્રેડ પાણીથી ચાર વખત ધોવામાં આવી, ઓરડાના તાપમાને સૂકવવામાં આવી, અને વિશ્લેષણ સુધી -80°C પર નાઇટ્રોજન વાતાવરણમાં સંગ્રહિત કરવામાં આવી. નિયંત્રણ તરીકે, દરેક પ્રયોગ માટે PVDF પટલના ખાલી નમૂનાનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો. Gas1-GFP માંથી કાઢવામાં આવેલા લિપિડનું વર્ણન MS દ્વારા વર્ણવ્યા મુજબ કરવામાં આવ્યું (50). ટૂંકમાં, GPI-લિપિડ ધરાવતી PVDF સ્ટ્રીપ્સને 75μl નેગેટિવ મોલ્ડ સોલવન્ટ [ક્લોરોફોર્મ/મિથેનોલ (1:2) + 5 mM એમોનિયમ એસિટેટ] માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવી અને સ્ફિંગોલિપિડ પ્રજાતિઓ (TSQ Vantage) નું ઇલેક્ટ્રોસ્પ્રે આયનાઇઝેશન (ESI)-MRM/MS વિશ્લેષણ પસાર કરવામાં આવ્યું. આ કિસ્સામાં, MS ડેટા નેગેટિવ આયન મોડમાં મેળવવામાં આવ્યો હતો.
અગાઉ ઉલ્લેખ કર્યો છે તેમ, GPI એન્કરનો લિપિડ ભાગ [3H]-inositol-લેબલવાળા GPI-AP (16) થી અલગ કરવામાં આવ્યો હતો. લિપિડ્સને દ્રાવક પ્રણાલી (55:45:10 ક્લોરોફોર્મ-મેથેનોલ-0.25% KCl) નો ઉપયોગ કરીને પાતળા-સ્તર ક્રોમેટોગ્રાફી દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યા હતા અને FLA-7000 (Fujifilm) નો ઉપયોગ કરીને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવ્યા હતા.
Gas1-GFP (600×107) દર્શાવતા કોષોને TNE બફર સાથે TNE બફરથી બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા, અને કાચના મણકાથી તોડવામાં આવ્યા હતા, અને પછી કોષના કાટમાળ અને કાચના મણકા દૂર કરવા માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ સુપરનેટન્ટને 17,000 ગ્રામ પર 4°C પર 1 કલાક માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું. પેલેટને TNE માં ધોવામાં આવ્યું હતું અને TNE માં 1 U PI-PLC (Invitrogen) સાથે 0.2% ડિજિટલિસ સેપોનિન ધરાવતા 37°C પર 1 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું હતું. એન્ઝાઇમ ટ્રીટમેન્ટ પછી, 17,000 ગ્રામ પર 4°C પર 1 કલાક માટે સેન્ટ્રીફ્યુજેશન દ્વારા પટલને દૂર કરવામાં આવ્યું હતું. Gas1-GFP ને રોગપ્રતિકારક શક્તિ આપવા માટે, સુપરનેટન્ટને GFP-Trap_A (ChromoTek) સાથે 4°C પર રાતોરાત ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું હતું. SDS-PAGE દ્વારા અલગ કરાયેલ શુદ્ધ Gas1-GFP ને કૂમાસી બ્રિલિયન્ટ બ્લુથી રંગવામાં આવ્યું હતું. ગેસ1-જીએફપી સ્ટેનિંગ બેન્ડને એક્વેડક્ટની આસપાસના ગ્રે રંગમાંથી કાપી નાખવામાં આવ્યો હતો, અને પછી આયોડોએસેટામાઇડ સાથે આલ્કિલેશન અને ડાયથિઓથ્રેઇટોલ સાથે ઘટાડા પછી, ટ્રિપ્સિન સાથે ઇન-જેલ પાચન કરવામાં આવ્યું હતું. ટ્રિપ્ટિક પેપ્ટાઇડ્સ અને પેપ્ટાઇડ્સને GPI-ગ્લાયકેન્સ સાથે કાઢો અને સૂકવો. સૂકા પેપ્ટાઇડને 20 μl પાણીમાં ઓગાળી દેવામાં આવ્યું હતું. LC માં એક ભાગ (8μl) ઇન્જેક્ટ કરો. ચોક્કસ ગ્રેડિયન્ટ પરિસ્થિતિઓ હેઠળ પેપ્ટાઇડ્સને અલગ કરવા માટે ઓક્ટાડેસિલસિલેન (ODS) સ્તંભ (ડેવેલોસિલ 300ODS-HG-5; આંતરિક વ્યાસ 150 mm×1.0 mm; નોમુરા કેમિકલ, આઈચી પ્રીફેક્ચર, જાપાન) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. મોબાઇલ તબક્કો દ્રાવક A (0.08% ફોર્મિક એસિડ) અને દ્રાવક B (80% એસેટોનિટ્રાઇલમાં 0.15% ફોર્મિક એસિડ) છે. એક્સેલા HPLC સિસ્ટમ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, બોસ્ટન, મેસેચ્યુસેટ્સ) નો ઉપયોગ 55 મિનિટની અંદર દ્રાવક A સાથે સ્તંભને 50 μl min-1 ના પ્રવાહ દરે 5 મિનિટ માટે એલ્યુટ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો, અને પછી દ્રાવક B ની સાંદ્રતા 40% સુધી વધારી દેવામાં આવી હતી. , યુનાઇટેડ સ્ટેટ્સ). એલ્યુએટને ESI આયન સ્ત્રોતમાં સતત દાખલ કરવામાં આવ્યું હતું, અને GPI-ગ્લાયકેન્સ સાથે ટ્રિપ્ટિક પેપ્ટાઇડ્સ અને પેપ્ટાઇડ્સનું વિશ્લેષણ LTQ ઓર્બિટ્રેપ XL (હાઇબ્રિડ રેખીય આયન ટ્રેપ-ઓર્બિટ્રેપ માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર; થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) દ્વારા કરવામાં આવ્યું હતું. MS સેટઅપમાં, કેશિકા સ્ત્રોતનો વોલ્ટેજ 4.5 kV પર સેટ કરવામાં આવ્યો હતો, અને ટ્રાન્સફર કેશિકાનું તાપમાન 300°C પર રાખવામાં આવ્યું હતું. કેશિકા વોલ્ટેજ અને ટ્યુબ લેન્સ વોલ્ટેજ અનુક્રમે 15 V અને 50 V પર સેટ કરવામાં આવ્યા હતા. MS ડેટા 300/m/z માસ/ચાર્જ રેશિયો (m/z) 3000 ની માસ રેન્જમાં પોઝિટિવ આયન મોડ (60,000 નું રિઝોલ્યુશન; 10 પાર્ટ્સ પ્રતિ મિલિયનની માસ ચોકસાઈ) માં મેળવવામાં આવ્યો હતો. MS/MS ડેટા LTQ ઓર્બિટ્રેપ XL [પ્રથમ 3 અંકો જેના પર ડેટા આધાર રાખે છે, અથડામણ પ્રેરિત વિયોજન (CID)] માં આયન ટ્રેપ દ્વારા મેળવવામાં આવે છે.
MD સિમ્યુલેશન GROMACS (52) સોફ્ટવેર અને MARTINI 2 ફોર્સ ફીલ્ડ (53-55) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ CHARMM GUI મેમ્બ્રેન બિલ્ડર (56, 57) નો ઉપયોગ ડાયોલીઓલ્ફોસ્ફેટિડિલકોલાઇન (DOPC) અને Cer C18 અથવા DOPC અને Cer C26 ધરાવતું બાયલેયર બનાવવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. Cer C26 ના ટોપોલોજી અને કોઓર્ડિનેટ્સ DXCE માંથી સ્ફિન્ગોસિન પૂંછડીમાંથી વધારાના મણકા દૂર કરીને મેળવવામાં આવે છે. ડબલ લેયરને સંતુલિત કરવા અને તેને ચલાવવા માટે નીચે વર્ણવેલ પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરો, પછી Emp24 ધરાવતી સિસ્ટમ બનાવવા માટે સિસ્ટમના છેલ્લા કોઓર્ડિનેટ્સનો ઉપયોગ કરો. યીસ્ટ Emp24 (અવશેષો 173 થી 193) ના ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન ડોમેનને વિઝ્યુઅલ MD (VMD) ટૂલ મોલેક્યુલર સ્ટ્રક્ચર (58) નો ઉપયોગ કરીને α-હેલિક્સ તરીકે બનાવવામાં આવ્યું હતું. પછી, ઓવરલેપિંગ લિપિડ્સ દૂર કર્યા પછી, પ્રોટીનને બરછટ દાણાદાર બનાવવામાં આવ્યું હતું અને CHARMM GUI નો ઉપયોગ કરીને બાયલેયરમાં દાખલ કરવામાં આવ્યું હતું. અંતિમ સિસ્ટમમાં 1202 DOPC અને 302 Cer C26 અથવા 1197 DOPC અને 295 Cer C18 અને Emp24 છે. સિસ્ટમને 0.150M ની સાંદ્રતા સુધી આયોનાઇઝ કરો. બે બાયલેયર કમ્પોઝિશન માટે ચાર સ્વતંત્ર પ્રતિકૃતિઓ બનાવવામાં આવી હતી.
લિપિડ બાયલેયર CHARMM GUI પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરીને સંતુલિત થાય છે, જેમાં 405,000 પગલાંને ન્યૂનતમ અને પછી સંતુલિત કરવાનો સમાવેશ થાય છે, જ્યાં સ્થિતિ મર્યાદાઓ ધીમે ધીમે ઓછી અને દૂર કરવામાં આવે છે, અને સમય પગલું 0.005 ps થી 0.02 ps સુધી વધારવામાં આવે છે. સંતુલન પછી, તે 0.02 ps ના સમય પગલા સાથે 6 µs ઉત્પન્ન કરે છે. Emp24 દાખલ કર્યા પછી, સિસ્ટમને ન્યૂનતમ અને સંતુલિત કરવા માટે સમાન CHARMM GUI પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરો, અને પછી ઉત્પાદનમાં 8 સેકન્ડ માટે ચલાવો.
બધી સિસ્ટમો માટે, સંતુલન પ્રક્રિયા દરમિયાન, દબાણ બેરેન્ડસેન બેરોસ્ટેટ (59) દ્વારા નિયંત્રિત થાય છે, અને ઉત્પાદન પ્રક્રિયા દરમિયાન, દબાણ પેરિનેલો-રહેમાન બેરોસ્ટેટ (60) દ્વારા નિયંત્રિત થાય છે. બધા કિસ્સાઓમાં, સરેરાશ દબાણ 1 બાર છે અને અર્ધ-આઇસોટ્રોપિક દબાણ જોડાણ યોજનાનો ઉપયોગ થાય છે. સંતુલન અને ઉત્પાદન પ્રક્રિયામાં, સ્પીડ રિકેલિબ્રેશન સાથે થર્મોસ્ટેટ (61) નો ઉપયોગ અનુક્રમે પ્રોટીન, લિપિડ અને દ્રાવક કણોના તાપમાનને જોડવા માટે થાય છે. સમગ્ર કામગીરી દરમિયાન, લક્ષ્ય તાપમાન 310K છે. નોન-બોન્ડિંગ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની ગણતરી 0.005 બફર સહિષ્ણુતા સાથે વર્લેટ યોજનાનો ઉપયોગ કરીને જોડી યાદી બનાવીને કરવામાં આવે છે. કુલોમ્બ શબ્દની ગણતરી પ્રતિક્રિયા ક્ષેત્ર અને 1.1 nm ના કટ-ઓફ અંતરનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવે છે. વેન્ડર વાલ્સ શબ્દ 1.1 nm ના કટ-ઓફ અંતર સાથે કટ-ઓફ યોજનાનો ઉપયોગ કરે છે, અને વર્લેટ કટ-ઓફ યોજનાનો ઉપયોગ સંભવિત ડ્રિફ્ટ (62) માટે થાય છે.
VMD નો ઉપયોગ કરીને, DOPC ફોસ્ફેટ માળખા અથવા સિરામાઇડ AM1 માળખા અને પ્રોટીન વચ્ચેની કટઓફ તરંગલંબાઇ 0.7 nm છે, અને પ્રોટીન સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતા લિપિડ્સની સંખ્યાની ગણતરી કરવામાં આવે છે. નીચેના સૂત્ર અનુસાર, (63) માં જણાવ્યા મુજબ ડિપ્લેશન-એનરિચમેન્ટ (DE) પરિબળની ગણતરી કરો: DE પરિબળ = (પ્રોટીન 0.7 માં કુલ લિપિડ્સનું પ્રમાણ) પ્રોટીન 0.7 માં (કુલ લિપિડ્સમાં Cer નું પ્રમાણ)
અહેવાલ કરેલ મૂલ્ય સરેરાશ તરીકે મેળવવામાં આવે છે, અને ભૂલ પટ્ટીઓ SE ની ચાર સ્વતંત્ર નકલો છે. DE પરિબળનું આંકડાકીય મહત્વ t પરીક્ષણ [(averageDE-factor-1)/SE] દ્વારા ગણવામાં આવે છે. એક-પૂંછડીવાળા વિતરણમાંથી P મૂલ્યની ગણતરી કરો.
GROMACS ટૂલનો ઉપયોગ ટ્રેસના છેલ્લા 250 ns ની અંદર Emp24 ધરાવતી સિસ્ટમના 2D લેટરલ ડેન્સિટી મેપની ગણતરી કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. સિરામાઇડનો સંવર્ધન/અવક્ષય નકશો મેળવવા માટે, Cer ના ઘનતા નકશાને Cer અને DOPC ના નકશાના સરવાળાથી વિભાજીત કરવામાં આવે છે, અને પછી શરીરમાં Cer ની સાંદ્રતાથી વિભાજીત કરવામાં આવે છે. સમાન રંગ નકશા સ્કેલનો ઉપયોગ થાય છે.
આ લેખ માટે પૂરક સામગ્રી માટે, કૃપા કરીને http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 જુઓ.
આ એક ઓપન એક્સેસ લેખ છે જે ક્રિએટિવ કોમન્સ એટ્રિબ્યુશન-નોન-કોમર્શિયલ લાઇસન્સની શરતો હેઠળ વિતરિત કરવામાં આવે છે, જે કોઈપણ માધ્યમમાં ઉપયોગ, વિતરણ અને પુનઃઉત્પાદનની મંજૂરી આપે છે, જ્યાં સુધી અંતિમ ઉપયોગ વ્યાપારી લાભ માટે ન હોય અને આધાર એ હોય કે મૂળ કાર્ય સાચું છે. સંદર્ભ.
નોંધ: અમે તમને ફક્ત તમારું ઇમેઇલ સરનામું આપવાનું કહીએ છીએ જેથી તમે જે વ્યક્તિને પેજ પર ભલામણ કરો છો તે જાણે કે તમે ઇચ્છો છો કે તે ઇમેઇલ જુએ અને તે સ્પામ ન હોય. અમે કોઈપણ ઇમેઇલ સરનામાં કેપ્ચર કરીશું નહીં.
આ પ્રશ્નનો ઉપયોગ તમે મુલાકાતી છો કે નહીં તે ચકાસવા અને આપમેળે સ્પામ સબમિશન અટકાવવા માટે થાય છે.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Loeze Serogi (Larogie) , Auxiliadora Aguilera-Romero, Anarogie (Larogi) લોપેઝ), મિહો વાગા (મિહો વાગા), મિસાકો અરમાન (મિસાકો અરમાન), મિયાકો રિમાન (મિયાકો રિમાન), પ્રો અકિરા, સ્ટેફાનો ફેની, અકીહિકો નાકાનો, મેન્યુઅલ મુનિઝ
3D હાઇ-રિઝોલ્યુશન રીઅલ-ટાઇમ ઇમેજિંગ પસંદગીના આઉટપુટ સાઇટ્સમાં પ્રોટીન સૉર્ટિંગ માટે સિરામાઇડ ચેઇન લંબાઈનું મહત્વ દર્શાવે છે.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Loeze Serogi (Larogie) , Auxiliadora Aguilera-Romero, Anarogie (Larogi) લોપેઝ), મિહો વાગા (મિહો વાગા), મિસાકો અરમાન (મિસાકો અરમાન), મિયાકો રિમાન (મિયાકો રિમાન), પ્રો અકિરા, સ્ટેફાનો ફેની, અકીહિકો નાકાનો, મેન્યુઅલ મુનિઝ
3D હાઇ-રિઝોલ્યુશન રીઅલ-ટાઇમ ઇમેજિંગ પસંદગીના આઉટપુટ સાઇટ્સમાં પ્રોટીન સૉર્ટિંગ માટે સિરામાઇડ ચેઇન લંબાઈનું મહત્વ દર્શાવે છે.
©2020 અમેરિકન એસોસિયેશન ફોર ધ એડવાન્સમેન્ટ ઓફ સાયન્સ. તમામ અધિકારો સુરક્ષિત છે. AAAS એ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef અને COUNTER ના ભાગીદાર છે. સાયન્સ એડવાન્સ ISSN 2375-2548.