અમે અગાઉ અહેવાલ આપ્યો હતો કે લીવર ફાઇબ્રોસિસવાળા દર્દીઓમાં આંતરડામાંથી મેળવેલા ટ્રિપ્ટોફન મેટાબોલાઇટ ઇન્ડોલ-3-પ્રોપિયોનિક એસિડ (IPA) નું સીરમ સ્તર ઓછું હોય છે. આ અભ્યાસમાં, અમે સીરમ IPA સ્તરોના સંબંધમાં મેદસ્વી યકૃતમાં ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ અને DNA મિથાઈલોમની તપાસ કરી, તેમજ ઇન વિટ્રોમાં હેપેટિક સ્ટેલેટ કોષો (HSCs) ના ફેનોટાઇપિક નિષ્ક્રિયકરણને પ્રેરિત કરવામાં IPA ની ભૂમિકાની તપાસ કરી.
આ અભ્યાસમાં 116 મેદસ્વી દર્દીઓનો સમાવેશ કરવામાં આવ્યો હતો જેમને ટાઇપ 2 ડાયાબિટીસ મેલીટસ (T2DM) (ઉંમર 46.8 ± 9.3 વર્ષ; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) વગરના હતા જેમણે કુઓપિયો બેરિયાટ્રિક સર્જરી સેન્ટર (KOBS) ખાતે બેરિયાટ્રિક સર્જરી કરાવી હતી. પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફી-માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (LC-MS) દ્વારા પરિભ્રમણ કરતા IPA સ્તરો માપવામાં આવ્યા હતા, કુલ RNA સિક્વન્સિંગ દ્વારા લિવર ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું, અને DNA મેથિલેશન વિશ્લેષણ ઇન્ફિનિયમ હ્યુમનમેથિલેશન450 બીડચીપનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. ઇન વિટ્રો પ્રયોગો માટે માનવ હિપેટિક સ્ટેલેટ કોષો (LX-2) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.
સીરમ IPA સ્તર યકૃતમાં એપોપ્ટોટિક, મિટોફેજિક અને દીર્ધાયુષ્ય માર્ગોમાં સામેલ જનીનોની અભિવ્યક્તિ સાથે સંકળાયેલા હતા. AKT સેરીન/થ્રેઓનાઇન કાઇનેઝ 1 (AKT1) જનીન લીવર ટ્રાન્સક્રિપ્ટ અને DNA મેથિલેશન પ્રોફાઇલ્સમાં સૌથી વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં અને પ્રબળ ઇન્ટરેક્ટિંગ જનીન હતું. IPA સારવારથી એપોપ્ટોસિસ, મિટોકોન્ડ્રીયલ શ્વસનમાં ઘટાડો થયો અને LX-2 કોષોના ફાઇબ્રોસિસ, એપોપ્ટોસિસ અને અસ્તિત્વને નિયંત્રિત કરવા માટે જાણીતા જનીનોની અભિવ્યક્તિને મોડ્યુલેટ કરીને કોષ આકારશાસ્ત્ર અને મિટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતામાં ફેરફાર થયો.
એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ ડેટા એ વાતને સમર્થન આપે છે કે IPA માં સંભવિત ઉપચારાત્મક અસરો છે અને તે એપોપ્ટોસિસને પ્રેરિત કરી શકે છે અને HSC ફેનોટાઇપને નિષ્ક્રિય સ્થિતિમાં ખસેડી શકે છે, જેનાથી HSC સક્રિયકરણ અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ ચયાપચયમાં દખલ કરીને લીવર ફાઇબ્રોસિસને અટકાવવાની શક્યતા વધી જાય છે.
મેદસ્વીતા અને મેટાબોલિક સિન્ડ્રોમનો વ્યાપ મેટાબોલિકલી સંકળાયેલ ફેટી લીવર ડિસીઝ (MASLD) ના વધતા જતા બનાવો સાથે સંકળાયેલો છે; આ રોગ સામાન્ય વસ્તીના 25% થી 30% ને અસર કરે છે [1]. MASLD ઇટીઓલોજીનું મુખ્ય પરિણામ લીવર ફાઇબ્રોસિસ છે, જે એક ગતિશીલ પ્રક્રિયા છે જે તંતુમય એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર મેટ્રિક્સ (ECM) ના સતત સંચય દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે [2]. લીવર ફાઇબ્રોસિસમાં સામેલ મુખ્ય કોષો હેપેટિક સ્ટેલેટ કોષો (HSCs) છે, જે ચાર જાણીતા ફેનોટાઇપ્સ દર્શાવે છે: શાંત, સક્રિય, નિષ્ક્રિય અને વૃદ્ધ [3, 4]. HSCs ને સક્રિય કરી શકાય છે અને શાંત સ્વરૂપમાંથી ઉચ્ચ ઉર્જા માંગવાળા પ્રોલિફેરેટિવ ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ જેવા કોષોમાં રૂપાંતરિત કરી શકાય છે, જેમાં α-સ્મૂથ સ્નાયુ એક્ટિન (α-SMA) અને પ્રકાર I કોલેજન (કોલ-I) [5, 6] ની અભિવ્યક્તિમાં વધારો થાય છે. લીવર ફાઇબ્રોસિસ રિવર્સલ દરમિયાન, સક્રિય HSCs એપોપ્ટોસિસ અથવા નિષ્ક્રિયતા દ્વારા દૂર કરવામાં આવે છે. આ પ્રક્રિયાઓમાં ફાઇબ્રોજેનિક જનીનોનું ડાઉનરેગ્યુલેશન અને પ્રોસર્વાઇવલ જનીનો (જેમ કે NF-κB અને PI3K/Akt સિગ્નલિંગ પાથવે) [7, 8] નું મોડ્યુલેશન, તેમજ મિટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતા અને કાર્યમાં ફેરફાર [9] શામેલ છે.
આંતરડામાં ઉત્પન્ન થતા ટ્રિપ્ટોફન મેટાબોલિટ ઇન્ડોલ-3-પ્રોપિયોનિક એસિડ (IPA) ના સીરમ સ્તર, MASLD [10–13] સહિત માનવ ચયાપચય રોગોમાં ઘટેલા જોવા મળ્યા છે. IPA ડાયેટરી ફાઇબરના સેવન સાથે સંકળાયેલું છે, તે તેના એન્ટીઑકિસડન્ટ અને બળતરા વિરોધી અસરો માટે જાણીતું છે, અને વિવો અને ઇન વિટ્રો [11–14] માં આહાર-પ્રેરિત નોન-આલ્કોહોલિક સ્ટીટોહેપેટાઇટિસ (NASH) ફેનોટાઇપને ઓછું કરે છે. કેટલાક પુરાવા અમારા અગાઉના અભ્યાસમાંથી આવે છે, જેણે કુઓપિયો બેરિયાટ્રિક સર્જરી સ્ટડી (KOBS) માં લીવર ફાઇબ્રોસિસ વિના મેદસ્વી દર્દીઓ કરતાં લીવર ફાઇબ્રોસિસવાળા દર્દીઓમાં સીરમ IPA સ્તર ઓછું હોવાનું દર્શાવ્યું હતું. વધુમાં, અમે દર્શાવ્યું હતું કે IPA સારવાર માનવ હેપેટિક સ્ટેલેટ સેલ (LX-2) મોડેલમાં કોષ સંલગ્નતા, કોષ સ્થળાંતર અને હેમેટોપોએટીક સ્ટેમ સેલ સક્રિયકરણના ક્લાસિકલ માર્કર જનીનોની અભિવ્યક્તિને ઘટાડી શકે છે અને સંભવિત હેપેટોપ્રોટેક્ટીવ મેટાબોલિટ છે [15]. જો કે, તે અસ્પષ્ટ રહે છે કે HSC એપોપ્ટોસિસ અને મિટોકોન્ડ્રીયલ બાયોએનર્જેટિક્સને સક્રિય કરીને IPA લીવર ફાઇબ્રોસિસ રીગ્રેશનને કેવી રીતે પ્રેરિત કરે છે.
અહીં, અમે દર્શાવીએ છીએ કે સીરમ IPA મેદસ્વી પરંતુ બિન-ટાઇપ 2 ડાયાબિટીસ (KOBS) વ્યક્તિઓના યકૃતમાં એપોપ્ટોસિસ, મિટોફેગી અને દીર્ધાયુષ્ય માર્ગોમાં સમૃદ્ધ જનીનોની અભિવ્યક્તિ સાથે સંકળાયેલ છે. વધુમાં, અમે જોયું કે IPA નિષ્ક્રિયકરણ માર્ગ દ્વારા સક્રિય હેમેટોપોએટીક સ્ટેમ સેલ્સ (HSCs) ના ક્લિયરન્સ અને ડિગ્રેડેશનને પ્રેરિત કરી શકે છે. આ પરિણામો IPA માટે એક નવી ભૂમિકા દર્શાવે છે, જે તેને લીવર ફાઇબ્રોસિસ રીગ્રેશનને પ્રોત્સાહન આપવા માટે સંભવિત ઉપચારાત્મક લક્ષ્ય બનાવે છે.
KOBS સમૂહમાં અગાઉના એક અભ્યાસમાં દર્શાવવામાં આવ્યું હતું કે લીવર ફાઇબ્રોસિસ ધરાવતા દર્દીઓમાં લીવર ફાઇબ્રોસિસ વિનાના દર્દીઓની તુલનામાં IPA સ્તર ઓછું હતું [15]. ટાઇપ 2 ડાયાબિટીસની સંભવિત ગૂંચવણભરી અસરને બાકાત રાખવા માટે, અમે ટાઇપ 2 ડાયાબિટીસ વિનાના 116 મેદસ્વી દર્દીઓ (સરેરાશ ઉંમર ± SD: 46.8 ± 9.3 વર્ષ; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (કોષ્ટક 1) ને અભ્યાસ વસ્તી [16] તરીકે ચાલુ KOBS અભ્યાસમાંથી ભરતી કરી. બધા સહભાગીઓએ લેખિત જાણકાર સંમતિ આપી હતી અને હેલસિંકીની ઘોષણા (54/2005, 104/2008 અને 27/2010) અનુસાર નોર્થ સેવો કાઉન્ટી હોસ્પિટલની એથિક્સ કમિટી દ્વારા અભ્યાસ પ્રોટોકોલને મંજૂરી આપવામાં આવી હતી.
લીવર બાયોપ્સી નમૂનાઓ બેરિયાટ્રિક સર્જરી દરમિયાન મેળવવામાં આવ્યા હતા અને અનુભવી પેથોલોજિસ્ટ દ્વારા અગાઉ વર્ણવેલ માપદંડો [17, 18] અનુસાર હિસ્ટોલોજીકલ મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું. મૂલ્યાંકન માપદંડોનો સારાંશ પૂરક કોષ્ટક S1 માં આપવામાં આવ્યો છે અને અગાઉ વર્ણવેલ છે [19].
મેટાબોલોમિક્સ વિશ્લેષણ (n = 116) માટે અનટાર્ગેટેડ લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી-માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (LC-MS) દ્વારા ઉપવાસ સીરમ નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ UHPLC-qTOF-MS સિસ્ટમ (1290 LC, 6540 qTOF-MS, એજિલેન્ટ ટેક્નોલોજીસ, વોલ્ડબ્રોન, કાર્લસ્રુહ, જર્મની) નો ઉપયોગ કરીને નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું19. આઇસોપ્રોપીલ આલ્કોહોલ (IPA) ની ઓળખ રીટેન્શન સમય અને શુદ્ધ ધોરણો સાથે MS/MS સ્પેક્ટ્રમની સરખામણી પર આધારિત હતી. આગળના તમામ વિશ્લેષણમાં IPA સિગ્નલ તીવ્રતા (પીક એરિયા) ધ્યાનમાં લેવામાં આવી હતી [20].
ઇલુમિના હાઇસેક 2500 નો ઉપયોગ કરીને આખા લીવર આરએનએ સિક્વન્સિંગ કરવામાં આવ્યું હતું અને અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ ડેટાને પ્રીપ્રોસેસ કરવામાં આવ્યો હતો [19, 21, 22]. અમે મિટોમાઇનર 4.0 ડેટાબેઝ [23] માંથી પસંદ કરેલા 1957 જનીનોનો ઉપયોગ કરીને મિટોકોન્ડ્રીયલ ફંક્શન/બાયોજેનેસિસને અસર કરતા ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સનું લક્ષિત વિભેદક અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ કર્યું. લિવર ડીએનએ મેથિલેશન વિશ્લેષણ ઇન્ફિનિયમ હ્યુમનમેથિલેશન450 બીડચીપ (ઇલુમિના, સાન ડિએગો, CA, USA) નો ઉપયોગ કરીને અગાઉ વર્ણવેલ સમાન પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું [24, 25].
પ્રોફેસર સ્ટેફાનો રોમિયો દ્વારા માનવ યકૃતના સ્ટેલેટ કોષો (LX-2) પૂરા પાડવામાં આવ્યા હતા અને તેમને DMEM/F12 માધ્યમ (બાયોવેસ્ટ, L0093-500, 1% પેન/સ્ટ્રેપ; લોન્ઝા, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) માં સંવર્ધન અને જાળવણી કરવામાં આવી હતી. IPA ની કાર્યકારી માત્રા પસંદ કરવા માટે, LX-2 કોષોને DMEM/F12 માધ્યમમાં 24 કલાક માટે IPA (10 μM, 100 μM અને 1 mM; સિગ્મા, 220027) ની વિવિધ સાંદ્રતા સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી. વધુમાં, HSCs ને નિષ્ક્રિય કરવાની IPA ની ક્ષમતાની તપાસ કરવા માટે, LX-2 કોષોને 5 ng/ml TGF-β1 (R&D સિસ્ટમ્સ, 240-B-002/CF) અને 1 mM IPA સાથે 24 કલાક માટે સીરમ-મુક્ત માધ્યમમાં સહ-સારવાર કરવામાં આવી હતી. સંબંધિત વાહન નિયંત્રણો માટે, TGF-β1 સારવાર માટે 0.1% BSA ધરાવતા 4 nM HCL નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો અને IPA સારવાર માટે 0.05% DMSO નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, અને બંનેનો ઉપયોગ સંયોજન સારવાર માટે એકસાથે કરવામાં આવ્યો હતો.
ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર 7-AAD (બાયોલેજેન્ડ, સાન ડિએગો, CA, USA, Cat# 640922) સાથે FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit નો ઉપયોગ કરીને એપોપ્ટોસિસનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું. ટૂંકમાં, LX-2 (1 × 105 કોષો/કુવા) ને 12-કુવા પ્લેટોમાં રાતોરાત સંવર્ધન કરવામાં આવ્યું અને પછી IPA અથવા IPA અને TGF-β1 ના બહુવિધ ડોઝ સાથે સારવાર આપવામાં આવી. બીજા દિવસે, તરતા અને સંલગ્ન કોષો એકત્રિત કરવામાં આવ્યા, ટ્રિપ્સિનાઇઝ કરવામાં આવ્યા, PBS થી ધોવામાં આવ્યા, Annexin V બંધનકર્તા બફરમાં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા, અને FITC-Annexin V અને 7-AAD સાથે 15 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યા.
જીવંત કોષોમાં મિટોકોન્ડ્રિયાને Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, કાર્લ્સબેડ, CA) નો ઉપયોગ કરીને ઓક્સિડેટીવ પ્રવૃત્તિ માટે સ્ટેન કરવામાં આવ્યા હતા. MTR પરીક્ષણો માટે, LX-2 કોષોને IPA અને TGF-β1 સાથે સમાન ઘનતા પર ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા હતા. 24 કલાક પછી, જીવંત કોષોને ટ્રિપ્સિનાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા, PBS થી ધોવામાં આવ્યા હતા, અને પછી અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ 20 મિનિટ માટે 37 °C પર સીરમ-મુક્ત માધ્યમમાં 100 μM MTR સાથે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા હતા [26]. જીવંત કોષ મોર્ફોલોજી વિશ્લેષણ માટે, કોષના કદ અને સાયટોપ્લાઝમિક જટિલતાનું વિશ્લેષણ અનુક્રમે ફોરવર્ડ સ્કેટર (FSC) અને સાઇડ સ્કેટર (SSC) પરિમાણોનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.
બધા ડેટા (30,000 ઇવેન્ટ્સ) નોવોસાયટ ક્વોન્ટિઓન (એજિલેન્ટ) નો ઉપયોગ કરીને મેળવવામાં આવ્યા હતા અને નોવોએક્સપ્રેસ® 1.4.1 અથવા ફ્લોજો V.10 સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર સીહોર્સ એક્સ્ટ્રાસેલ્યુલર ફ્લક્સ એનાલાઇઝર (એજિલેન્ટ ટેક્નોલોજીસ, સાન્ટા ક્લેરા, CA) નો ઉપયોગ કરીને વાસ્તવિક સમયમાં ઓક્સિજન વપરાશ દર (OCR) અને એક્સ્ટ્રાસેલ્યુલર એસિડિફિકેશન દર (ECAR) માપવામાં આવ્યો હતો. ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર, સીહોર્સ XF સેલ મિટો સ્ટ્રેસથી સજ્જ સીહોર્સ એક્સ્ટ્રાસેલ્યુલર ફ્લક્સ એનાલાઇઝર (એજિલેન્ટ ટેક્નોલોજીસ, સાન્ટા ક્લેરા, CA) નો ઉપયોગ કરીને, ટૂંકમાં, 2 × 104 LX-2 કોષો/કુવાને XF96 સેલ કલ્ચર પ્લેટ્સ પર સીડ કરવામાં આવ્યા હતા. રાતોરાત ઇન્ક્યુબેશન પછી, કોષોને આઇસોપ્રોપેનોલ (IPA) અને TGF-β1 (પૂરક પદ્ધતિઓ 1) સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી. સીહોર્સ XF વેવ સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને ડેટા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું, જેમાં સીહોર્સ XF સેલ એનર્જી ફેનોટાઇપ ટેસ્ટ રિપોર્ટ જનરેટરનો સમાવેશ થાય છે. આમાંથી, બાયોએનર્જેટિક હેલ્થ ઇન્ડેક્સ (BHI) ની ગણતરી કરવામાં આવી હતી [27].
કુલ RNA ને cDNA માં ટ્રાન્સક્રિપ્ટ કરવામાં આવ્યું હતું. ચોક્કસ પદ્ધતિઓ માટે, સંદર્ભ જુઓ [15]. માનવ 60S રિબોસોમલ એસિડિક પ્રોટીન P0 (RPLP0) અને સાયક્લોફિલિન A1 (PPIA) mRNA સ્તરોનો ઉપયોગ રચનાત્મક જનીન નિયંત્રણો તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. ક્વોન્ટસ્ટુડિયો 6 પ્રો રીઅલ-ટાઇમ PCR સિસ્ટમ (થર્મો ફિશર, લેન્ડસ્મીયર, ધ નેધરલેન્ડ્સ) નો ઉપયોગ TaqMan™ ફાસ્ટ એડવાન્સ્ડ માસ્ટર મિક્સ કિટ (એપ્લાઇડ બાયોસિસ્ટમ્સ) અથવા સેન્સિફાસ્ટ SYBR Lo-ROX કિટ (બાયોલિન, BIO 94050) સાથે કરવામાં આવ્યો હતો, અને તુલનાત્મક Ct મૂલ્ય સાયકલિંગ પરિમાણો (ΔΔCt) અને ∆∆Ct પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને સંબંધિત જનીન અભિવ્યક્તિ ફોલ્ડની ગણતરી કરવામાં આવી હતી. પ્રાઇમર્સની વિગતો પૂરક કોષ્ટકો S2 અને S3 માં આપવામાં આવી છે.
અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ DNeasy બ્લડ એન્ડ ટીશ્યુ કીટ (Qiagen) નો ઉપયોગ કરીને ન્યુક્લિયર DNA (ncDNA) અને મિટોકોન્ડ્રીયલ DNA (mtDNA) કાઢવામાં આવ્યા હતા [28]. પૂરક પદ્ધતિઓ 2 માં વિગતવાર જણાવ્યા મુજબ, દરેક લક્ષ્ય mtDNA પ્રદેશના ભૌમિતિક સરેરાશ સાથે ત્રણ પરમાણુ DNA પ્રદેશો (mtDNA/ncDNA) ના ગુણોત્તરની ગણતરી કરીને mtDNA ની સંબંધિત રકમની ગણતરી કરવામાં આવી હતી. mtDNA અને ncDNA માટેના પ્રાઇમર્સની વિગતો પૂરક કોષ્ટક S4 માં આપવામાં આવી છે.
ઇન્ટરસેલ્યુલર અને ઇન્ટ્રાસેલ્યુલર મિટોકોન્ડ્રિયાલ નેટવર્ક્સની કલ્પના કરવા માટે જીવંત કોષોને Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, કાર્લ્સબેડ, CA) થી રંગવામાં આવ્યા હતા. LX-2 કોષો (1 × 104 કોષો/કુવા) ને અનુરૂપ કાચ-તળિયાવાળી કલ્ચર પ્લેટો (Ibidi GmbH, માર્ટિન્સ્રીડ, જર્મની) માં કાચની સ્લાઇડ્સ પર સંવર્ધિત કરવામાં આવ્યા હતા. 24 કલાક પછી, જીવંત LX-2 કોષોને 37 °C પર 20 મિનિટ માટે 100 μM MTR સાથે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા હતા અને કોષ ન્યુક્લીને DAPI (1 μg/ml, સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) થી રંગવામાં આવ્યા હતા જેમ કે અગાઉ વર્ણવેલ છે [29]. મિટોકોન્ડ્રિયાલ નેટવર્ક્સને Zeiss Axio Observer inverted microscope (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) નો ઉપયોગ કરીને 5% CO2 સાથે ભેજવાળા વાતાવરણમાં 37 °C પર Zeiss LSM 800 confocal મોડ્યુલથી સજ્જ 63×NA 1.3 ઉદ્દેશ્યનો ઉપયોગ કરીને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવ્યા હતા. અમે દરેક નમૂના પ્રકાર માટે દસ Z-શ્રેણી છબીઓ મેળવી. દરેક Z-શ્રેણીમાં 30 વિભાગો છે, દરેકની જાડાઈ 9.86 μm છે. દરેક નમૂના માટે, ZEN 2009 સોફ્ટવેર (કાર્લ ઝીસ માઇક્રોઇમેજિંગ GmbH, જેના, જર્મની) નો ઉપયોગ કરીને દસ અલગ અલગ દૃશ્ય ક્ષેત્રોની છબીઓ મેળવવામાં આવી હતી, અને પૂરક પદ્ધતિઓ 3 માં વિગતવાર પરિમાણો અનુસાર ImageJ સોફ્ટવેર (v1.54d) [30, 31] નો ઉપયોગ કરીને મિટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજી વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
કોષોને 0.1 M ફોસ્ફેટ બફરમાં 2% ગ્લુટારાલ્ડીહાઇડ સાથે ફિક્સ કરવામાં આવ્યા હતા, ત્યારબાદ 1% ઓસ્મિયમ ટેટ્રોક્સાઇડ સોલ્યુશન (સિગ્મા એલ્ડ્રિચ, MO, USA) સાથે ફિક્સેશન કરવામાં આવ્યું હતું, ધીમે ધીમે એસીટોન (મર્ક, ડાર્મસ્ટેડ, જર્મની) સાથે ડિહાઇડ્રેટ કરવામાં આવ્યું હતું, અને અંતે ઇપોક્સી રેઝિન સાથે જડિત કરવામાં આવ્યું હતું. અલ્ટ્રાથિન વિભાગો તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા અને 1% યુરેનાઇલ એસિટેટ (મર્ક, ડાર્મસ્ટેડ, જર્મની) અને 1% લીડ સાઇટ્રેટ (મર્ક, ડાર્મસ્ટેડ, જર્મની) સાથે સ્ટેઇન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા. 80 kV ના પ્રવેગક વોલ્ટેજ પર JEM 2100F EXII ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપ (JEOL લિમિટેડ, ટોક્યો, જાપાન) નો ઉપયોગ કરીને અલ્ટ્રાસ્ટ્રક્ચરલ છબીઓ મેળવવામાં આવી હતી.
Zeiss ઇન્વર્ટેડ લાઇટ માઇક્રોસ્કોપ (Zeiss Axio Vert.A1 અને AxioCam MRm, જેના, જર્મની) નો ઉપયોગ કરીને 50x મેગ્નિફિકેશન પર ફેઝ-કોન્ટ્રાસ્ટ માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા 24 કલાક માટે IPA સાથે સારવાર કરાયેલ LX-2 કોષોના મોર્ફોલોજીનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું.
ક્લિનિકલ ડેટાને સરેરાશ ± પ્રમાણભૂત વિચલન અથવા મધ્યક (ઇન્ટરક્વાર્ટાઇલ રેન્જ: IQR) તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવ્યો હતો. ત્રણ અભ્યાસ જૂથો વચ્ચેના તફાવતોની તુલના કરવા માટે ભિન્નતા (સતત ચલો) અથવા χ² પરીક્ષણ (વર્ગીકલ ચલો) નું એક-માર્ગી વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. બહુવિધ પરીક્ષણ માટે સુધારવા માટે ખોટા હકારાત્મક દર (FDR) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, અને FDR < 0.05 વાળા જનીનોને આંકડાકીય રીતે મહત્વપૂર્ણ ગણવામાં આવ્યા હતા. CpG DNA મેથિલેશનને IPA સિગ્નલ તીવ્રતા સાથે સહસંબંધિત કરવા માટે સ્પીયરમેન સહસંબંધ વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, જેમાં નજીવા p મૂલ્યો (p < 0.05) નોંધાયા હતા.
પાથવે વિશ્લેષણ વેબ-આધારિત જનીન સેટ વિશ્લેષણ સાધન (વેબગેસ્ટાલ્ટ) નો ઉપયોગ કરીને 268 ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ (નોમિનલ પી < 0.01), 119 મિટોકોન્ડ્રિયા-સંકળાયેલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ (નોમિનલ પી < 0.05), અને 3093 લીવર ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સમાંથી 4350 CpGs માટે કરવામાં આવ્યું હતું જે ફરતા સીરમ IPA સ્તરો સાથે સંકળાયેલા હતા. મુક્તપણે ઉપલબ્ધ વેની ડીબી (સંસ્કરણ 2.1.0) ટૂલનો ઉપયોગ ઓવરલેપિંગ જનીનો શોધવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો, અને સ્ટ્રિંગડીબી (સંસ્કરણ 11.5) નો ઉપયોગ પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની કલ્પના કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.
LX-2 પ્રયોગ માટે, D'Agostino-Pearson પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને નમૂનાઓનું સામાન્યતા માટે પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ઓછામાં ઓછા ત્રણ જૈવિક પ્રતિકૃતિઓમાંથી ડેટા મેળવવામાં આવ્યો હતો અને બોનફેરોની પોસ્ટ હોક પરીક્ષણ સાથે એક-માર્ગી ANOVA ને આધિન કરવામાં આવ્યો હતો. 0.05 કરતા ઓછા p-મૂલ્યને આંકડાકીય રીતે મહત્વપૂર્ણ ગણવામાં આવ્યું હતું. ડેટા સરેરાશ ± SD તરીકે રજૂ કરવામાં આવ્યો છે, અને દરેક આકૃતિમાં પ્રયોગોની સંખ્યા દર્શાવવામાં આવી છે. બધા વિશ્લેષણ અને ગ્રાફ વિન્ડોઝ માટે ગ્રાફપેડ પ્રિઝમ 8 આંકડાકીય સોફ્ટવેર (ગ્રાફપેડ સોફ્ટવેર ઇન્ક., સંસ્કરણ 8.4.3, સાન ડિએગો, યુએસએ) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યા હતા.
સૌપ્રથમ, અમે સીરમ IPA સ્તરોના લીવર, આખા શરીર અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ સાથેના જોડાણની તપાસ કરી. કુલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ પ્રોફાઇલમાં, સીરમ IPA સ્તરો સાથે સંકળાયેલ સૌથી મજબૂત જનીન MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; મિટોજેન-સક્રિય પ્રોટીન કાઇનેઝ-સક્રિય પ્રોટીન કાઇનેઝ 3) હતું; મિટોકોન્ડ્રીયલ-સંબંધિત ટ્રાન્સક્રિપ્ટ પ્રોફાઇલમાં, સૌથી મજબૂત સંકળાયેલ જનીન AKT1 (FDR = 0.7621; AKT સેરીન/થ્રેઓનાઇન કાઇનેઝ 1) (વધારાની ફાઇલ 1 અને વધારાની ફાઇલ 2) હતું.
ત્યારબાદ અમે ગ્લોબલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ (n = 268; p < 0.01) અને મિટોકોન્ડ્રિયા-સંકળાયેલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ (n = 119; p < 0.05) નું વિશ્લેષણ કર્યું, આખરે એપોપ્ટોસિસને સૌથી મહત્વપૂર્ણ કેનોનિકલ માર્ગ (p = 0.0089) તરીકે ઓળખાવ્યો. સીરમ IPA સ્તરો સાથે સંકળાયેલ મિટોકોન્ડ્રિયા ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ માટે, અમે એપોપ્ટોસિસ (FDR = 0.00001), મિટોફેગી (FDR = 0.00029), અને TNF સિગ્નલિંગ માર્ગો (FDR = 0.000006) (આકૃતિ 1A, કોષ્ટક 2, અને પૂરક આકૃતિઓ 1A-B) પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું.
સીરમ IPA સ્તરો સાથે જોડાણમાં માનવ યકૃતમાં વૈશ્વિક, મિટોકોન્ડ્રિયા-સંકળાયેલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ અને DNA મેથિલેશનનું ઓવરલેપિંગ વિશ્લેષણ. A 268 વૈશ્વિક ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ, 119 મિટોકોન્ડ્રિયા-સંકળાયેલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ અને DNA મેથિલેટેડ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે જે સીરમ IPA સ્તરો સાથે સંકળાયેલ 3092 CpG સાઇટ્સ પર મેપ કરવામાં આવે છે (ગ્લોબલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ અને DNA મેથિલેટેડ માટે p મૂલ્યો < 0.01, અને મિટોકોન્ડ્રિયા ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ માટે p મૂલ્યો < 0.05). મુખ્ય ઓવરલેપિંગ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ મધ્યમાં બતાવવામાં આવ્યા છે (AKT1 અને YKT6). B અન્ય જનીનો સાથે સૌથી વધુ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સ્કોર (0.900) ધરાવતા 13 જનીનોનો ક્રિયાપ્રતિક્રિયા નકશો 56 ઓવરલેપિંગ જનીનો (બ્લેક લાઇન રિજન) માંથી બનાવવામાં આવ્યો હતો જે ઓનલાઈન ટૂલ StringDB નો ઉપયોગ કરીને સીરમ IPA સ્તરો સાથે નોંધપાત્ર રીતે સંકળાયેલા હતા. લીલો: જનીન ઓન્ટોલોજી (GO) સેલ્યુલર ઘટક સાથે મેપ કરવામાં આવ્યા: મિટોકોન્ડ્રિયા (GO:0005739). AKT1 એ પ્રોટીન છે જે ડેટા (ટેક્સ્ટ માઇનિંગ, પ્રયોગો, ડેટાબેઝ અને સહ-અભિવ્યક્તિ પર આધારિત) ના આધારે અન્ય પ્રોટીન સાથેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ માટે સૌથી વધુ સ્કોર (0.900) ધરાવે છે. નેટવર્ક નોડ્સ પ્રોટીનનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, અને ધાર પ્રોટીન વચ્ચેના જોડાણોનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.
ગટ માઇક્રોબાયોટા મેટાબોલાઇટ્સ DNA મેથિલેશન [32] દ્વારા એપિજેનેટિક રચનાને નિયંત્રિત કરી શકે છે, તેથી અમે તપાસ કરી કે શું સીરમ IPA સ્તરો લીવર DNA મેથિલેશન સાથે સંકળાયેલા હતા. અમને જાણવા મળ્યું કે સીરમ IPA સ્તરો સાથે સંકળાયેલા બે મુખ્ય મેથિલેશન સ્થળો પ્રોલાઇન-સેરીન-સમૃદ્ધ પ્રદેશ 3 (C19orf55) અને હીટ શોક પ્રોટીન ફેમિલી B (નાના) સભ્ય 6 (HSPB6) (વધારાની ફાઇલ 3) ની નજીક હતા. 4350 CpG (p < 0.01) નું DNA મેથિલેશન સીરમ IPA સ્તરો સાથે સહસંબંધિત હતું અને દીર્ધાયુષ્ય નિયમનકારી માર્ગો (p = 0.006) (આકૃતિ 1A, કોષ્ટક 2, અને પૂરક આકૃતિ 1C) માં સમૃદ્ધ હતું.
માનવ યકૃતમાં સીરમ IPA સ્તરો, ગ્લોબલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ, મિટોકોન્ડ્રિયા-સંકળાયેલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ અને DNA મેથિલેશન વચ્ચેના જોડાણોને સમજવા માટે, અમે અગાઉના પાથવે વિશ્લેષણ (આકૃતિ 1A) માં ઓળખાયેલા જનીનોનું ઓવરલેપ વિશ્લેષણ કર્યું. 56 ઓવરલેપિંગ જનીનો (આકૃતિ 1A માં કાળી રેખાની અંદર) ના પાથવે સંવર્ધન વિશ્લેષણના પરિણામો દર્શાવે છે કે એપોપ્ટોસિસ પાથવે (p = 0.00029) એ ત્રણ વિશ્લેષણમાં સામાન્ય બે જનીનો પ્રકાશિત કર્યા: AKT1 અને YKT6 (YKT6 v-SNARE હોમોલોગ), જેમ કે વેન ડાયાગ્રામ (પૂરક આકૃતિ 2 અને આકૃતિ 1A) માં બતાવ્યા પ્રમાણે. રસપ્રદ વાત એ છે કે, અમને જાણવા મળ્યું કે AKT1 (cg19831386) અને YKT6 (cg24161647) સીરમ IPA સ્તરો (વધારાની ફાઇલ 3) સાથે હકારાત્મક રીતે સંકળાયેલા હતા. જનીન ઉત્પાદનો વચ્ચે સંભવિત પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને ઓળખવા માટે, અમે ઇનપુટ તરીકે 56 ઓવરલેપિંગ જનીનોમાંથી સૌથી વધુ સામાન્ય પ્રદેશ સ્કોર (0.900) ધરાવતા 13 જનીનો પસંદ કર્યા અને એક ક્રિયાપ્રતિક્રિયા નકશો બનાવ્યો. આત્મવિશ્વાસ સ્તર (સીમાંત આત્મવિશ્વાસ) અનુસાર, સૌથી વધુ સ્કોર (0.900) ધરાવતો AKT1 જનીન ટોચ પર હતો (આકૃતિ 1B).
પાથવે વિશ્લેષણના આધારે, અમને જાણવા મળ્યું કે એપોપ્ટોસિસ મુખ્ય માર્ગ હતો, તેથી અમે તપાસ કરી કે શું IPA સારવાર HSCs ઇન વિટ્રોના એપોપ્ટોસિસને અસર કરશે. અમે અગાઉ દર્શાવ્યું હતું કે IPA ના વિવિધ ડોઝ (10 μM, 100 μM, અને 1 mM) LX-2 કોષો માટે બિન-ઝેરી હતા [15]. આ અભ્યાસ દર્શાવે છે કે 10 μM અને 100 μM પર IPA સારવારથી સધ્ધર અને નેક્રોટિક કોષોની સંખ્યામાં વધારો થયો છે. જો કે, નિયંત્રણ જૂથની તુલનામાં, કોષ સધ્ધરતા 1 mM IPA સાંદ્રતા પર ઘટી ગઈ, જ્યારે કોષ નેક્રોસિસ દર યથાવત રહ્યો (આકૃતિ 2A, B). આગળ, LX-2 કોષોમાં એપોપ્ટોસિસને પ્રેરિત કરવા માટે શ્રેષ્ઠ સાંદ્રતા શોધવા માટે, અમે 24 કલાક માટે 10 μM, 100 μM, અને 1 mM IPA નું પરીક્ષણ કર્યું (આકૃતિ 2A-E અને પૂરક આકૃતિ 3A-B). રસપ્રદ વાત એ છે કે, IPA 10 μM અને 100 μM એ એપોપ્ટોસિસ દર (%) ઘટાડ્યો, જોકે, IPA 1 mM એ નિયંત્રણની તુલનામાં અંતમાં એપોપ્ટોસિસ અને એપોપ્ટોસિસ દર (%) વધાર્યો અને તેથી વધુ પ્રયોગો માટે પસંદ કરવામાં આવ્યો (આકૃતિઓ 2A–D).
IPA LX-2 કોષોના એપોપ્ટોસિસને પ્રેરિત કરે છે. ફ્લો સાયટોમેટ્રી દ્વારા એપોપ્ટોસિસ દર અને કોષ મોર્ફોલોજીનું માપન કરવા માટે એનેક્સિન V અને 7-AAD ડબલ સ્ટેનિંગ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. BA કોષોને 24 કલાક માટે 10 μM, 100 μM અને 1 mM IPA સાથે અથવા 24 કલાક માટે સીરમ-મુક્ત માધ્યમમાં F–H TGF-β1 (5 ng/ml) અને 1 mM IPA સાથે ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા. A: જીવંત કોષો (Annexin V -/ 7AAD-); B: નેક્રોટિક કોષો (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: પ્રારંભિક (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: અંતમાં (Annexin V+/7AAD.+); E, H: એપોપ્ટોસિસ દરમાં કુલ પ્રારંભિક અને અંતમાં એપોપ્ટોસિસ કોષોની ટકાવારી (%). ડેટા સરેરાશ ± SD, n = 3 સ્વતંત્ર પ્રયોગો તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યો છે. બોનફેરોની પોસ્ટ હોક ટેસ્ટ સાથે વન-વે ANOVA નો ઉપયોગ કરીને આંકડાકીય સરખામણીઓ કરવામાં આવી હતી. *p < 0.05; ****p < 0.0001
જેમ આપણે પહેલા બતાવ્યું છે તેમ, 5 ng/ml TGF-β1 ક્લાસિકલ માર્કર જનીનોની અભિવ્યક્તિ વધારીને HSC સક્રિયકરણને પ્રેરિત કરી શકે છે [15]. LX-2 કોષોને 5 ng/ml TGF-β1 અને 1 mM IPA સાથે સંયોજનમાં સારવાર આપવામાં આવી હતી (આકૃતિ 2E–H). TGF-β1 સારવારથી એપોપ્ટોસિસ દરમાં કોઈ ફેરફાર થયો નથી, જોકે, IPA સહ-સારવારથી TGF-β1 સારવાર (આકૃતિ 2E–H) ની તુલનામાં અંતમાં એપોપ્ટોસિસ અને એપોપ્ટોસિસ દર (%) વધ્યો. આ પરિણામો સૂચવે છે કે 1 mM IPA TGF-β1 ઇન્ડક્શનથી સ્વતંત્ર રીતે LX-2 કોષોમાં એપોપ્ટોસિસને પ્રોત્સાહન આપી શકે છે.
અમે LX-2 કોષોમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ શ્વસન પર IPA ની અસરની વધુ તપાસ કરી. પરિણામો દર્શાવે છે કે 1 mM IPA એ ઓક્સિજન વપરાશ દર (OCR) પરિમાણોમાં ઘટાડો કર્યો: નિયંત્રણ જૂથ (આકૃતિ 3A, B) ની તુલનામાં નોન-માઇટોકોન્ડ્રીયલ શ્વસન, બેઝલ અને મહત્તમ શ્વસન, પ્રોટોન લીક અને ATP ઉત્પાદન, જ્યારે બાયોએનર્જેટિક હેલ્થ ઇન્ડેક્સ (BHI) બદલાયો નથી.
IPA LX-2 કોષોમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ શ્વસન ઘટાડે છે. માઇટોકોન્ડ્રીયલ શ્વસન વળાંક (OCR) ને માઇટોકોન્ડ્રીયલ શ્વસન પરિમાણો (નોન-માઇટોકોન્ડ્રીયલ શ્વસન, બેઝલ શ્વસન, મહત્તમ શ્વસન, પ્રોટોન લીક, ATP જનરેશન, SRC અને BHI) તરીકે રજૂ કરવામાં આવે છે. કોષો A અને B ને અનુક્રમે 10 μM, 100 μM અને 1 mM IPA સાથે 24 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા હતા. કોષો C અને D ને અનુક્રમે TGF-β1 (5 ng/ml) અને 1 mM IPA સાથે 24 કલાક માટે સીરમ-મુક્ત માધ્યમમાં ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા હતા. CyQuant કીટનો ઉપયોગ કરીને બધા માપને DNA સામગ્રીમાં સામાન્ય બનાવવામાં આવ્યા હતા. BHI: બાયોએનર્જેટિક આરોગ્ય સૂચકાંક; SRC: શ્વસન અનામત ક્ષમતા; OCR: ઓક્સિજન વપરાશ દર. ડેટા સરેરાશ ± માનક વિચલન (SD), n = 5 સ્વતંત્ર પ્રયોગો તરીકે રજૂ કરવામાં આવે છે. આંકડાકીય સરખામણીઓ એક-માર્ગી ANOVA અને બોનફેરોની પોસ્ટ હોક પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી. *p < 0.05; **p < 0.01; અને ***p < 0.001
TGF-β1-સક્રિય LX-2 કોષોના બાયોએનર્જેટિક પ્રોફાઇલ પર IPA ની અસરની વધુ વ્યાપક સમજ મેળવવા માટે, અમે OCR દ્વારા મિટોકોન્ડ્રીયલ ઓક્સિડેટીવ ફોસ્ફોરાયલેશનનું વિશ્લેષણ કર્યું (આકૃતિ 3C,D). પરિણામો દર્શાવે છે કે TGF-β1 સારવાર નિયંત્રણ જૂથ (આકૃતિ 3C,D) ની તુલનામાં મહત્તમ શ્વસન, શ્વસન અનામત ક્ષમતા (SRC) અને BHI ઘટાડી શકે છે. વધુમાં, સંયોજન સારવારથી બેઝલ શ્વસન, પ્રોટોન લીક અને ATP ઉત્પાદનમાં ઘટાડો થયો, પરંતુ SRC અને BHI TGF-β1 (આકૃતિ 3C,D) સાથે સારવાર કરાયેલા લોકો કરતા નોંધપાત્ર રીતે વધારે હતા.
અમે સીહોર્સ સોફ્ટવેર દ્વારા પ્રદાન કરાયેલ "સેલ્યુલર એનર્જી ફેનોટાઇપ ટેસ્ટ" પણ કર્યું (પૂરક આકૃતિ 4A–D). પૂરક આકૃતિ 3B માં બતાવ્યા પ્રમાણે, TGF-β1 સારવાર પછી OCR અને ECAR બંને મેટાબોલિક સંભવિતતામાં ઘટાડો થયો હતો, જોકે, નિયંત્રણ જૂથની તુલનામાં સંયોજન અને IPA સારવાર જૂથોમાં કોઈ તફાવત જોવા મળ્યો ન હતો. વધુમાં, નિયંત્રણ જૂથની તુલનામાં સંયોજન અને IPA સારવાર પછી OCR ના બેઝલ અને સ્ટ્રેસ સ્તર બંનેમાં ઘટાડો થયો હતો (પૂરક આકૃતિ 4C). રસપ્રદ વાત એ છે કે, સંયોજન ઉપચાર સાથે સમાન પેટર્ન જોવા મળી હતી, જ્યાં TGF-β1 સારવારની તુલનામાં ECAR ના બેઝલ અને સ્ટ્રેસ સ્તરમાં કોઈ ફેરફાર જોવા મળ્યો ન હતો (પૂરક આકૃતિ 4C). HSC માં, TGF-β1 સારવારના સંપર્ક પછી મિટોકોન્ડ્રીયલ ઓક્સિડેટીવ ફોસ્ફોરાયલેશનમાં ઘટાડો અને SCR અને BHI ને પુનઃસ્થાપિત કરવાની સંયોજન સારવારની ક્ષમતાએ મેટાબોલિક સંભવિતતા (OCR અને ECAR) માં કોઈ ફેરફાર કર્યો ન હતો. એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ પરિણામો સૂચવે છે કે IPA HSC માં બાયોએનર્જેટિક્સ ઘટાડી શકે છે, જે સૂચવે છે કે IPA ઓછી ઉર્જા પ્રોફાઇલને પ્રેરિત કરી શકે છે જે HSC ફેનોટાઇપને નિષ્ક્રિયતા તરફ ખસેડે છે (પૂરક આકૃતિ 4D).
મિટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજી અને નેટવર્ક કનેક્શન્સના ત્રિ-પરિમાણીય જથ્થાત્મકીકરણ તેમજ MTR સ્ટેનિંગ (આકૃતિ 4 અને પૂરક આકૃતિ 5) નો ઉપયોગ કરીને મિટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતા પર IPA ની અસરની તપાસ કરવામાં આવી હતી. આકૃતિ 4 દર્શાવે છે કે, નિયંત્રણ જૂથની તુલનામાં, TGF-β1 સારવારથી સરેરાશ સપાટી વિસ્તાર, શાખા સંખ્યા, કુલ શાખા લંબાઈ અને શાખા જંકશન નંબર (આકૃતિ 4A અને B) ઘટાડો થયો અને મિટોકોન્ડ્રિયાના પ્રમાણને ગોળાકારથી મધ્યવર્તી મોર્ફોલોજી (આકૃતિ 4C) માં બદલાયું. ફક્ત IPA સારવારથી સરેરાશ મિટોકોન્ડ્રીયલ વોલ્યુમમાં ઘટાડો થયો અને નિયંત્રણ જૂથ (આકૃતિ 4A) ની તુલનામાં મિટોકોન્ડ્રીયલનું પ્રમાણ ગોળાકારથી મધ્યવર્તી મોર્ફોલોજીમાં બદલાયું. તેનાથી વિપરીત, મિટોકોન્ડ્રીયલ મેમ્બ્રેન સંભવિત-આધારિત MTR (આકૃતિ 4A અને E) દ્વારા મૂલ્યાંકન કરાયેલ ગોળાકારતા, સરેરાશ શાખા લંબાઈ અને મિટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિ યથાવત રહી અને આ પરિમાણો જૂથો વચ્ચે અલગ નહોતા. એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ પરિણામો સૂચવે છે કે TGF-β1 અને IPA સારવાર જીવંત LX-2 કોષોમાં મિટોકોન્ડ્રીયલ આકાર અને કદ તેમજ નેટવર્ક જટિલતાને સુધારે છે.
IPA LX-2 કોષોમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતા અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ DNA વિપુલતાને બદલે છે. A. સીરમ-મુક્ત માધ્યમમાં 24 કલાક માટે TGF-β1 (5 ng/ml) અને 1 mM IPA સાથે ઉકાળેલા જીવંત LX-2 કોષોની પ્રતિનિધિ કોન્ફોકલ છબીઓ જે Mitotracker™ Red CMXRos અને ન્યુક્લી DAPI સાથે વાદળી રંગના મિટોકોન્ડ્રીયલ નેટવર્ક્સ દર્શાવે છે. બધા ડેટામાં પ્રતિ જૂથ ઓછામાં ઓછી 15 છબીઓ હતી. અમે દરેક નમૂના પ્રકાર માટે 10 Z-સ્ટેક છબીઓ મેળવી. દરેક Z-અક્ષ ક્રમમાં 30 સ્લાઇસેસ હતા, દરેકની જાડાઈ 9.86 μm હતી. સ્કેલ બાર: 10 μm. B. છબીમાં અનુકૂલનશીલ થ્રેશોલ્ડિંગ લાગુ કરીને ઓળખાયેલ પ્રતિનિધિ પદાર્થો (માત્ર માઇટોકોન્ડ્રીયા). દરેક જૂથના તમામ કોષો માટે માઇટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજિકલ નેટવર્ક કનેક્શન્સનું માત્રાત્મક વિશ્લેષણ અને સરખામણી કરવામાં આવી હતી. C. માઇટોકોન્ડ્રીયલ આકાર ગુણોત્તરની આવર્તન. 0 ની નજીકના મૂલ્યો ગોળાકાર આકાર સૂચવે છે, અને 1 ની નજીકના મૂલ્યો ફિલામેન્ટસ આકાર સૂચવે છે. D મટિરિયલ્સ અને મેથડ્સમાં વર્ણવ્યા મુજબ મિટોકોન્ડ્રીયલ ડીએનએ (mtDNA) ની સામગ્રી નક્કી કરવામાં આવી હતી. મટિરિયલ્સ અને મેથડ્સમાં વર્ણવ્યા મુજબ ફ્લો સાયટોમેટ્રી (30,000 ઇવેન્ટ્સ) દ્વારા E મિટોટ્રેકર™ રેડ CMXRos વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ડેટા સરેરાશ ± SD, n = 3 સ્વતંત્ર પ્રયોગો તરીકે રજૂ કરવામાં આવ્યો છે. આંકડાકીય સરખામણીઓ એક-માર્ગી ANOVA અને બોનફેરોની પોસ્ટ હોક ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
ત્યારબાદ અમે LX-2 કોષોમાં mtDNA સામગ્રીનું વિશ્લેષણ મિટોકોન્ડ્રીયલ સંખ્યાના સૂચક તરીકે કર્યું. નિયંત્રણ જૂથની તુલનામાં, TGF-β1-સારવાર કરાયેલ જૂથમાં mtDNA સામગ્રીમાં વધારો થયો હતો (આકૃતિ 4D). TGF-β1-સારવાર કરાયેલ જૂથની તુલનામાં, સંયોજન સારવાર જૂથ (આકૃતિ 4D) માં mtDNA સામગ્રીમાં ઘટાડો થયો હતો, જે સૂચવે છે કે IPA mtDNA સામગ્રી અને સંભવતઃ મિટોકોન્ડ્રીયલ સંખ્યા તેમજ મિટોકોન્ડ્રીયલ શ્વસન (આકૃતિ 3C) ઘટાડી શકે છે. વધુમાં, IPA સંયોજન સારવારમાં mtDNA સામગ્રી ઘટાડે તેવું લાગતું હતું પરંતુ MTR-મધ્યસ્થી મિટોકોન્ડ્રીયલ પ્રવૃત્તિને અસર કરતું નહોતું (આકૃતિ 4A-C).
અમે LX-2 કોષોમાં ફાઇબ્રોસિસ, એપોપ્ટોસિસ, સર્વાઇવલ અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડાયનેમિક્સ સાથે સંકળાયેલા જનીનોના mRNA સ્તરો સાથે IPA ના જોડાણની તપાસ કરી (આકૃતિ 5A–D). નિયંત્રણ જૂથની તુલનામાં, TGF-β1-સારવાર કરાયેલા જૂથે કોલેજન પ્રકાર I α2 ચેઇન (COL1A2), α-સ્મૂથ સ્નાયુ એક્ટિન (αSMA), મેટ્રિક્સ મેટાલોપ્રોટીનેઝ 2 (MMP2), મેટાલોપ્રોટીનેઝ 1 (TIMP1) ના ટીશ્યુ ઇન્હિબિટર અને ડાયનામિન 1-જેવા જનીન (DRP1) જેવા જનીનોની અભિવ્યક્તિમાં વધારો દર્શાવ્યો, જે ફાઇબ્રોસિસ અને સક્રિયકરણમાં વધારો દર્શાવે છે. વધુમાં, નિયંત્રણ જૂથની તુલનામાં, TGF-β1 સારવારથી ન્યુક્લિયર પ્રેગ્નેન X રીસેપ્ટર (PXR), કેસ્પેઝ 8 (CASP8), MAPKAPK3, B-સેલ α ના અવરોધક, ન્યુક્લિયર ફેક્ટર κ જનીન લાઇટ પેપ્ટાઇડ (NFκB1A) ના અવરોધક અને ન્યુક્લિયર ફેક્ટર κB કિનેઝ સબ્યુનિટ β (IKBKB) ના અવરોધક (આકૃતિ 5A–D) ના mRNA સ્તરમાં ઘટાડો થયો. TGF-β1 સારવારની તુલનામાં, TGF-β1 અને IPA સાથે સંયોજન સારવારથી COL1A2 અને MMP2 ની અભિવ્યક્તિ ઓછી થઈ, પરંતુ PXR, TIMP1, B-સેલ લિમ્ફોમા-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, અને IKBKB ના mRNA સ્તરમાં વધારો થયો. IPA સારવારથી MMP2, Bcl-2-સંકળાયેલ પ્રોટીન X (BAX), AKT1, ઓપ્ટિક એટ્રોફી પ્રોટીન 1 (OPA1), અને મિટોકોન્ડ્રીયલ ફ્યુઝન પ્રોટીન 2 (MFN2) ની અભિવ્યક્તિમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો, જ્યારે CASP8, NFκB1A, NFκB1B, અને IKBKB ની અભિવ્યક્તિ નિયંત્રણ જૂથની તુલનામાં વધી. જોકે, કેસ્પેસ-3 (CASP3), એપોપ્ટોટિક પેપ્ટીડેઝ સક્રિયકરણ પરિબળ 1 (APAF1), મિટોકોન્ડ્રીયલ ફ્યુઝન પ્રોટીન 1 (MFN1), અને ફિશન પ્રોટીન 1 (FIS1) ની અભિવ્યક્તિમાં કોઈ તફાવત જોવા મળ્યો નહીં. સામૂહિક રીતે, આ પરિણામો સૂચવે છે કે IPA સારવાર ફાઇબ્રોસિસ, એપોપ્ટોસિસ, સર્વાઇવલ અને મિટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતા સાથે સંકળાયેલ જનીનોની અભિવ્યક્તિને નિયંત્રિત કરે છે. અમારા ડેટા સૂચવે છે કે IPA સારવાર LX-2 કોષોમાં ફાઇબ્રોસિસ ઘટાડે છે; તે જ સમયે, તે ફેનોટાઇપને નિષ્ક્રિયતા તરફ ખસેડીને અસ્તિત્વને ઉત્તેજિત કરે છે.
IPA LX-2 કોષોમાં ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ, એપોપ્ટોટિક, વાયબિલિટી અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડાયનેમિક્સ જનીનોની અભિવ્યક્તિને મોડ્યુલેટ કરે છે. LX-2 કોષોને 24 કલાક માટે સીરમ-મુક્ત માધ્યમમાં TGF-β1 અને IPA સાથે પ્રેરિત કર્યા પછી હિસ્ટોગ્રામ એન્ડોજેનસ કંટ્રોલ (RPLP0 અથવા PPIA) ની સાપેક્ષમાં mRNA અભિવ્યક્તિ દર્શાવે છે. A ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ્સ સૂચવે છે, B એપોપ્ટોટિક કોષો સૂચવે છે, C બચેલા કોષો સૂચવે છે, અને D માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડાયનેમિક્સ જનીન અભિવ્યક્તિ સૂચવે છે. ડેટા સરેરાશ ± માનક વિચલન (SD), n = 3 સ્વતંત્ર પ્રયોગો તરીકે રજૂ કરવામાં આવે છે. આંકડાકીય સરખામણીઓ એક-માર્ગી ANOVA અને બોનફેરોની પોસ્ટ હોક ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
પછી, કોષના કદ (FSC-H) અને સાયટોપ્લાઝમિક જટિલતા (SSC-H) માં ફેરફારોનું મૂલ્યાંકન ફ્લો સાયટોમેટ્રી (આકૃતિ 6A,B) દ્વારા કરવામાં આવ્યું, અને IPA સારવાર પછી કોષ મોર્ફોલોજીમાં ફેરફારોનું મૂલ્યાંકન ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી (TEM) અને ફેઝ કોન્ટ્રાસ્ટ માઇક્રોસ્કોપી (પૂરક આકૃતિ 6A-B) દ્વારા કરવામાં આવ્યું. અપેક્ષા મુજબ, TGF-β1-સારવાર કરાયેલા જૂથમાં કોષો નિયંત્રણ જૂથ (આકૃતિ 6A,B) ની તુલનામાં કદમાં વધારો થયો, જે રફ એન્ડોપ્લાઝમિક રેટિક્યુલમ (ER*) અને ફેગોલિસોસોમ્સ (P) ના ક્લાસિક વિસ્તરણ દર્શાવે છે, જે હિમેટોપોએટીક સ્ટેમ સેલ (HSC) સક્રિયકરણ સૂચવે છે (પૂરક આકૃતિ 6A). જો કે, TGF-β1-સારવાર કરાયેલા જૂથની તુલનામાં, TGF-β1 અને IPA સંયોજન સારવાર જૂથ (પૂરક આકૃતિ 6A) માં કોષનું કદ, સાયટોપ્લાઝમિક જટિલતા (આકૃતિ 6A,B), અને ER* સામગ્રીમાં ઘટાડો થયો. વધુમાં, IPA સારવારથી નિયંત્રણ જૂથની તુલનામાં કોષનું કદ, સાયટોપ્લાઝમિક જટિલતા (આકૃતિઓ 6A,B), P અને ER* સામગ્રી (પૂરક આકૃતિ 6A) ઓછી થઈ. વધુમાં, નિયંત્રણ જૂથની તુલનામાં IPA સારવારના 24 કલાક પછી એપોપ્ટોટિક કોષોનું પ્રમાણ વધ્યું (સફેદ તીર, પૂરક આકૃતિ 6B). સામૂહિક રીતે, આ પરિણામો સૂચવે છે કે 1 mM IPA HSC એપોપ્ટોસિસને ઉત્તેજીત કરી શકે છે અને TGF-β1 દ્વારા પ્રેરિત કોષ મોર્ફોલોજિકલ પરિમાણોમાં ફેરફારોને ઉલટાવી શકે છે, જેનાથી કોષનું કદ અને જટિલતા નિયંત્રિત થાય છે, જે HSC નિષ્ક્રિયતા સાથે સંકળાયેલ હોઈ શકે છે.
IPA LX-2 કોષોમાં કોષના કદ અને સાયટોપ્લાઝમિક જટિલતાને બદલે છે. ફ્લો સાયટોમેટ્રી વિશ્લેષણની પ્રતિનિધિ છબીઓ. વિશ્લેષણમાં LX-2 કોષો માટે વિશિષ્ટ ગેટિંગ વ્યૂહરચનાનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો: કોષની વસ્તીને વ્યાખ્યાયિત કરવા માટે SSC-A/FSC-A, ડબલ્સ ઓળખવા માટે FSC-H/FSC-A, અને કોષના કદ અને જટિલતા વિશ્લેષણ માટે SSC-H/FSC-H. કોષોને 24 કલાક માટે સીરમ-મુક્ત માધ્યમમાં TGF-β1 (5 ng/ml) અને 1 mM IPA સાથે ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા. LX-2 કોષોને નીચલા ડાબા ચતુર્થાંશ (SSC-H-/FSC-H-), ઉપલા ડાબા ચતુર્થાંશ (SSC-H+/FSC-H-), નીચલા જમણા ચતુર્થાંશ (SSC-H-/FSC-H+), અને ઉપલા જમણા ચતુર્થાંશ (SSC-H+/FSC-H+) માં કોષના કદ અને સાયટોપ્લાઝમિક જટિલતા વિશ્લેષણ માટે વિતરિત કરવામાં આવ્યા હતા. B. FSC-H (ફોરવર્ડ સ્કેટર, કોષનું કદ) અને SSC-H (સાઇડ સ્કેટર, સાયટોપ્લાઝમિક જટિલતા) (30,000 ઇવેન્ટ્સ) નો ઉપયોગ કરીને ફ્લો સાયટોમેટ્રી દ્વારા કોષ મોર્ફોલોજીનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ડેટા સરેરાશ ± SD, n = 3 સ્વતંત્ર પ્રયોગો તરીકે રજૂ કરવામાં આવ્યો છે. આંકડાકીય સરખામણીઓ એક-માર્ગી ANOVA અને બોનફેરોની પોસ્ટ હોક ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 અને ****p < 0.0001
IPA જેવા ગટ મેટાબોલાઇટ્સ સંશોધનનો ગરમ વિષય બની ગયા છે, જે સૂચવે છે કે ગટ માઇક્રોબાયોટામાં નવા લક્ષ્યો શોધી શકાય છે. તેથી તે રસપ્રદ છે કે IPA, એક મેટાબોલાઇટ જેને આપણે માનવોમાં લીવર ફાઇબ્રોસિસ સાથે જોડ્યું છે [15], પ્રાણી મોડેલોમાં સંભવિત એન્ટિ-ફાઇબ્રોટિક સંયોજન તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યું છે [13, 14]. અહીં, અમે પ્રથમ વખત ટાઇપ 2 ડાયાબિટીસ (T2D) વગરના મેદસ્વી વ્યક્તિઓમાં સીરમ IPA અને ગ્લોબલ લિવર ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ અને DNA મેથિલેશન વચ્ચે જોડાણ દર્શાવીએ છીએ, જે એપોપ્ટોસિસ, મિટોફેગી અને દીર્ધાયુષ્યને પ્રકાશિત કરે છે, તેમજ લીવર હોમિયોસ્ટેસિસને નિયંત્રિત કરતા સંભવિત ઉમેદવાર જનીન AKT1 ને પ્રકાશિત કરે છે. અમારા અભ્યાસની બીજી નવીનતા એ છે કે અમે LX-2 કોષોમાં એપોપ્ટોસિસ, સેલ મોર્ફોલોજી, મિટોકોન્ડ્રીયલ બાયોએનર્જેટિક્સ અને ગતિશીલતા સાથે IPA સારવારની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દર્શાવી છે, જે ઓછી ઉર્જા સ્પેક્ટ્રમ સૂચવે છે જે HSC ફેનોટાઇપને નિષ્ક્રિયતા તરફ ખસેડે છે, IPA ને લીવર ફાઇબ્રોસિસ સુધારવા માટે સંભવિત ઉમેદવાર બનાવે છે.
અમને જાણવા મળ્યું કે એપોપ્ટોસિસ, મિટોફેગી અને દીર્ધાયુષ્ય એ પરિભ્રમણ સીરમ IPA સાથે સંકળાયેલા લીવર જનીનોમાં સમૃદ્ધ થયેલા સૌથી મહત્વપૂર્ણ કેનોનિકલ માર્ગો હતા. મિટોકોન્ડ્રીયલ ગુણવત્તા નિયંત્રણ (MQC) સિસ્ટમમાં વિક્ષેપ મિટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શન, મિટોફેગી અને એપોપ્ટોસિસ તરફ દોરી શકે છે, જેનાથી MASLD ની ઘટનાને પ્રોત્સાહન મળે છે[33, 34]. તેથી, આપણે અનુમાન કરી શકીએ છીએ કે IPA લીવરમાં એપોપ્ટોસિસ, મિટોફેગી અને દીર્ધાયુષ્ય દ્વારા કોષ ગતિશીલતા અને મિટોકોન્ડ્રીયલ અખંડિતતા જાળવવામાં સામેલ હોઈ શકે છે. અમારા ડેટા દર્શાવે છે કે ત્રણ પરીક્ષણોમાં બે જનીનો સામાન્ય હતા: YKT6 અને AKT1. એ નોંધવું યોગ્ય છે કે YKT6 એ કોષ પટલ ફ્યુઝનની પ્રક્રિયામાં સામેલ SNARE પ્રોટીન છે. તે ઓટોફેગોસોમ પર STX17 અને SNAP29 સાથે એક ઇનિશિયેશન કોમ્પ્લેક્સ બનાવીને ઓટોફેગી અને મિટોફેગીમાં ભૂમિકા ભજવે છે, જેનાથી ઓટોફેગોસોમ અને લાઇસોસોમના ફ્યુઝનને પ્રોત્સાહન મળે છે[35]. વધુમાં, YKT6 કાર્ય ગુમાવવાથી મિટોફેજીમાં ઘટાડો થાય છે[36], જ્યારે YKT6 નું અપરેગ્યુલેશન હેપેટોસેલ્યુલર કાર્સિનોમા (HCC) ની પ્રગતિ સાથે સંકળાયેલું છે, જે કોષના અસ્તિત્વમાં વધારો દર્શાવે છે[37]. બીજી બાજુ, AKT1 એ સૌથી મહત્વપૂર્ણ ઇન્ટરેક્ટિંગ જનીન છે અને યકૃતના રોગોમાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે, જેમાં PI3K/AKT સિગ્નલિંગ માર્ગ, કોષ ચક્ર, કોષ સ્થળાંતર, પ્રસાર, ફોકલ સંલગ્નતા, મિટોકોન્ડ્રીયલ કાર્ય અને કોલેજન સ્ત્રાવનો સમાવેશ થાય છે[38–40]. સક્રિય PI3K/AKT સિગ્નલિંગ માર્ગ હેમેટોપોએટીક સ્ટેમ સેલ્સ (HSCs) ને સક્રિય કરી શકે છે, જે એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર મેટ્રિક્સ (ECM) ના ઉત્પાદન માટે જવાબદાર કોષો છે, અને તેનું ડિસરેગ્યુલેશન લીવર ફાઇબ્રોસિસની ઘટના અને પ્રગતિમાં ફાળો આપી શકે છે[40]. વધુમાં, AKT એ મુખ્ય કોષ અસ્તિત્વ પરિબળોમાંનું એક છે જે p53-આધારિત કોષ એપોપ્ટોસિસને અટકાવે છે, અને AKT સક્રિયકરણ લીવર કોષ એપોપ્ટોસિસ [41, 42] ના અવરોધ સાથે સંકળાયેલું હોઈ શકે છે. પ્રાપ્ત પરિણામો સૂચવે છે કે IPA એપોપ્ટોસિસમાં પ્રવેશવા અથવા અસ્તિત્વ ટકાવી રાખવા વચ્ચેના હિપેટોસાઇટ્સના નિર્ણયને અસર કરીને લીવર મિટોકોન્ડ્રિયા-સંકળાયેલ એપોપ્ટોસિસમાં સામેલ હોઈ શકે છે. આ અસરો AKT અને/અથવા YKT6 ઉમેદવાર જનીનો દ્વારા નિયંત્રિત થઈ શકે છે, જે લીવર હોમિયોસ્ટેસિસ માટે મહત્વપૂર્ણ છે.
અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે 1 mM IPA એપોપ્ટોસિસને પ્રેરિત કરે છે અને TGF-β1 સારવારથી સ્વતંત્ર LX-2 કોષોમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ શ્વસનમાં ઘટાડો કરે છે. એ નોંધનીય છે કે એપોપ્ટોસિસ ફાઇબ્રોસિસ રિઝોલ્યુશન અને હેમેટોપોએટીક સ્ટેમ સેલ (HSC) સક્રિયકરણ માટેનો મુખ્ય માર્ગ છે, અને તે લીવર ફાઇબ્રોસિસના ઉલટાવી શકાય તેવા શારીરિક પ્રતિભાવમાં પણ એક મુખ્ય ઘટના છે [4, 43]. વધુમાં, સંયોજન સારવાર પછી LX-2 કોષોમાં BHI ની પુનઃસ્થાપનાએ માઇટોકોન્ડ્રીયલ બાયોએનર્જેટિક્સના નિયમનમાં IPA ની સંભવિત ભૂમિકામાં નવી આંતરદૃષ્ટિ પ્રદાન કરી. આરામ અને નિષ્ક્રિય પરિસ્થિતિઓમાં, હેમેટોપોએટીક કોષો સામાન્ય રીતે ATP ઉત્પન્ન કરવા માટે માઇટોકોન્ડ્રીયલ ઓક્સિડેટીવ ફોસ્ફોરાયલેશનનો ઉપયોગ કરે છે અને ઓછી મેટાબોલિક પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે. બીજી બાજુ, HSC સક્રિયકરણ ગ્લાયકોલિટીક સ્થિતિમાં પ્રવેશવાની ઊર્જા માંગને પૂર્ણ કરવા માટે માઇટોકોન્ડ્રીયલ શ્વસન અને બાયોસિન્થેસિસને વધારે છે [44]. હકીકત એ છે કે IPA મેટાબોલિક સંભવિત અને ECAR ને અસર કરતું નથી તે સૂચવે છે કે ગ્લાયકોલિટીક માર્ગને ઓછી પ્રાથમિકતા આપવામાં આવે છે. તેવી જ રીતે, અન્ય એક અભ્યાસ દર્શાવે છે કે 1 mM IPA કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સ, માનવ હિપેટોસાઇટ સેલ લાઇન (Huh7) અને માનવ નાભિની નસ એન્ડોથેલિયલ કોષો (HUVEC) માં માઇટોકોન્ડ્રીયલ શ્વસન સાંકળ પ્રવૃત્તિને મોડ્યુલેટ કરવામાં સક્ષમ હતું; જોકે, કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સમાં ગ્લાયકોલિસિસ પર IPA ની કોઈ અસર જોવા મળી નથી, જે સૂચવે છે કે IPA અન્ય કોષ પ્રકારોના બાયોએનર્જેટિક્સને અસર કરી શકે છે [45]. તેથી, અમે અનુમાન કરીએ છીએ કે 1 mM IPA હળવા રાસાયણિક અનકપ્લર તરીકે કાર્ય કરી શકે છે, કારણ કે તે mtDNA ની માત્રામાં ફેરફાર કર્યા વિના ફાઇબ્રોજેનિક જનીન અભિવ્યક્તિ, કોષ મોર્ફોલોજી અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ બાયોએનર્જેટિક્સને નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડી શકે છે [46]. મિટોકોન્ડ્રીયલ અનકપ્લર સંસ્કૃતિ-પ્રેરિત ફાઇબ્રોસિસ અને HSC સક્રિયકરણને અટકાવી શકે છે [47] અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ ATP ઉત્પાદન ઘટાડી શકે છે જે અનકપ્લિંગ પ્રોટીન (UCP) અથવા એડેનાઇન ન્યુક્લિયોટાઇડ ટ્રાન્સલોકેસ (ANT) જેવા ચોક્કસ પ્રોટીન દ્વારા નિયંત્રિત અથવા પ્રેરિત થાય છે. કોષના પ્રકાર પર આધાર રાખીને, આ ઘટના કોષોને એપોપ્ટોસિસથી સુરક્ષિત કરી શકે છે અને/અથવા એપોપ્ટોસિસને પ્રોત્સાહન આપી શકે છે [46]. જોકે, હેમેટોપોએટીક સ્ટેમ સેલ નિષ્ક્રિયકરણમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ અનકપ્લર તરીકે IPA ની ભૂમિકા સ્પષ્ટ કરવા માટે વધુ અભ્યાસની જરૂર છે.
ત્યારબાદ અમે તપાસ કરી કે શું જીવંત LX-2 કોષોમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ શ્વસનમાં થતા ફેરફારો માઇટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજીમાં પ્રતિબિંબિત થાય છે. રસપ્રદ વાત એ છે કે, TGF-β1 સારવાર માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રમાણને ગોળાકારથી મધ્યવર્તી સુધી બદલી નાખે છે, જેમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ શાખાઓમાં ઘટાડો અને DRP1 ની અભિવ્યક્તિમાં વધારો થાય છે, જે માઇટોકોન્ડ્રીયલ વિભાજનમાં મુખ્ય પરિબળ છે [48]. વધુમાં, માઇટોકોન્ડ્રીયલ ફ્રેગમેન્ટેશન એકંદર નેટવર્ક જટિલતા સાથે સંકળાયેલું છે, અને ફ્યુઝનથી ફિશનમાં સંક્રમણ હેમેટોપોએટીક સ્ટેમ સેલ (HSC) સક્રિયકરણ માટે મહત્વપૂર્ણ છે, જ્યારે માઇટોકોન્ડ્રીયલ વિભાજનનું નિષેધ HSC એપોપ્ટોસિસ તરફ દોરી જાય છે [49]. આમ, અમારા પરિણામો સૂચવે છે કે TGF-β1 સારવાર માઇટોકોન્ડ્રીયલ નેટવર્ક જટિલતામાં ઘટાડો લાવી શકે છે જેમાં બ્રાન્ચિંગમાં ઘટાડો થાય છે, જે સક્રિય હેમેટોપોએટીક સ્ટેમ સેલ (HSCs) સાથે સંકળાયેલ માઇટોકોન્ડ્રીયલ વિભાજનમાં વધુ સામાન્ય છે. વધુમાં, અમારા ડેટા દર્શાવે છે કે IPA માઇટોકોન્ડ્રીયલના પ્રમાણને ગોળાકારથી મધ્યવર્તી આકારમાં બદલી શકે છે, જેનાથી OPA1 અને MFN2 ની અભિવ્યક્તિ ઓછી થાય છે. અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે OPA1 નું ડાઉનરેગ્યુલેશન માઇટોકોન્ડ્રીયલ મેમ્બ્રેન સંભવિતતામાં ઘટાડો લાવી શકે છે અને સેલ એપોપ્ટોસિસને ટ્રિગર કરી શકે છે [50]. MFN2 મિટોકોન્ડ્રીયલ ફ્યુઝન અને એપોપ્ટોસિસ [51] માં મધ્યસ્થી કરવા માટે જાણીતું છે. પ્રાપ્ત પરિણામો સૂચવે છે કે TGF-β1 અને/અથવા IPA દ્વારા LX-2 કોષોનું ઇન્ડક્શન મિટોકોન્ડ્રીયલ આકાર અને કદ, તેમજ સક્રિયકરણ સ્થિતિ અને નેટવર્ક જટિલતાને સુધારે છે.
અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે TGFβ-1 અને IPA ની સંયુક્ત સારવાર એપોપ્ટોસિસ-ઇવેડિંગ કોષોમાં ફાઇબ્રોસિસ, એપોપ્ટોસિસ અને સર્વાઇવલ-સંબંધિત જનીનોના mRNA અભિવ્યક્તિને નિયંત્રિત કરીને mtDNA અને સેલ મોર્ફોલોજિકલ પરિમાણોને ઘટાડી શકે છે. ખરેખર, IPA એ AKT1 ના mRNA અભિવ્યક્તિ સ્તર અને COL1A2 અને MMP2 જેવા મહત્વપૂર્ણ ફાઇબ્રોસિસ જનીનોમાં ઘટાડો કર્યો, પરંતુ CASP8 ના અભિવ્યક્તિ સ્તરમાં વધારો કર્યો, જે એપોપ્ટોસિસ સાથે સંકળાયેલ છે. અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે IPA સારવાર પછી, BAX અભિવ્યક્તિમાં ઘટાડો થયો અને TIMP1 ફેમિલી સબ્યુનિટ્સ, BCL-2 અને NF-κB ની mRNA અભિવ્યક્તિમાં વધારો થયો, જે સૂચવે છે કે IPA એપોપ્ટોસિસથી બચી જતા હેમેટોપોએટીક સ્ટેમ સેલ્સ (HSCs) માં સર્વાઇવલ સિગ્નલોને ઉત્તેજીત કરી શકે છે. આ પરમાણુઓ સક્રિય હેમેટોપોએટીક સ્ટેમ સેલ્સમાં પ્રો-સર્વાઇવલ સિગ્નલો તરીકે કાર્ય કરી શકે છે, જે એન્ટિ-એપોપ્ટોટિક પ્રોટીન (જેમ કે Bcl-2) ની વધેલી અભિવ્યક્તિ, પ્રો-એપોપ્ટોટિક BAX ની ઘટેલી અભિવ્યક્તિ અને TIMP અને NF-κB વચ્ચે જટિલ આંતરક્રિયા સાથે સંકળાયેલ હોઈ શકે છે [5, 7]. IPA PXR દ્વારા તેની અસરોનો ઉપયોગ કરે છે, અને અમને જાણવા મળ્યું કે TGF-β1 અને IPA સાથે સંયોજન સારવારથી PXR mRNA અભિવ્યક્તિ સ્તરમાં વધારો થાય છે, જે HSC સક્રિયકરણનું દમન સૂચવે છે. સક્રિય PXR સિગ્નલિંગ વિવો અને ઇન વિટ્રો બંનેમાં HSC સક્રિયકરણને અટકાવવા માટે જાણીતું છે [52, 53]. અમારા પરિણામો સૂચવે છે કે IPA એપોપ્ટોસિસને પ્રોત્સાહન આપીને, ફાઇબ્રોસિસ અને મિટોકોન્ડ્રીયલ ચયાપચય ઘટાડીને અને સર્વાઇવલ સિગ્નલોને વધારીને સક્રિય HSC ના ક્લિયરન્સમાં ભાગ લઈ શકે છે, જે લાક્ષણિક પ્રક્રિયાઓ છે જે સક્રિય HSC ફેનોટાઇપને નિષ્ક્રિયમાં રૂપાંતરિત કરે છે. એપોપ્ટોસિસમાં IPA ની સંભવિત પદ્ધતિ અને ભૂમિકા માટે બીજી સંભવિત સમજૂતી એ છે કે તે મુખ્યત્વે મિટોફેગી (આંતરિક માર્ગ) અને બાહ્ય TNF સિગ્નલિંગ માર્ગ (કોષ્ટક 1) દ્વારા નિષ્ક્રિય મિટોકોન્ડ્રિયાને સાફ કરે છે, જે NF-κB સર્વાઇવલ સિગ્નલિંગ માર્ગ (પૂરક આકૃતિ 7) સાથે સીધી રીતે જોડાયેલ છે. રસપ્રદ વાત એ છે કે, IPA-સંબંધિત સમૃદ્ધ જનીનો એપોપ્ટોટિક પાથવે [54] માં પ્રો-એપોપ્ટોટિક અને પ્રો-સર્વાઇવલ સિગ્નલો પ્રેરિત કરવામાં સક્ષમ છે, જે સૂચવે છે કે IPA આ જનીનો સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરીને એપોપ્ટોટિક પાથવે અથવા અસ્તિત્વને પ્રેરિત કરી શકે છે. જો કે, HSC સક્રિયકરણ દરમિયાન IPA એપોપ્ટોસિસ અથવા અસ્તિત્વને કેવી રીતે પ્રેરિત કરે છે અને તેના યાંત્રિક માર્ગો અસ્પષ્ટ રહે છે.
IPA એ આંતરડાના માઇક્રોબાયોટા દ્વારા આહાર ટ્રિપ્ટોફનમાંથી બનેલ માઇક્રોબાયોટિક છે. અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે તેમાં આંતરડાના વાતાવરણમાં બળતરા વિરોધી, એન્ટીઑકિસડન્ટ અને એપિજેનેટિક નિયમનકારી ગુણધર્મો છે.[55] અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે IPA આંતરડાના અવરોધ કાર્યને મોડ્યુલેટ કરી શકે છે અને ઓક્સિડેટીવ તણાવ ઘટાડી શકે છે, જે તેની સ્થાનિક શારીરિક અસરોમાં ફાળો આપી શકે છે.[56] હકીકતમાં, IPA પરિભ્રમણ દ્વારા લક્ષ્ય અંગોમાં પરિવહન થાય છે, અને IPA ટ્રિપ્ટોફન, સેરોટોનિન અને ઇન્ડોલ ડેરિવેટિવ્ઝ સાથે સમાન મુખ્ય મેટાબોલિટ માળખું શેર કરે છે, તેથી IPA મેટાબોલિક ક્રિયાઓ કરે છે જેના પરિણામે સ્પર્ધાત્મક મેટાબોલિક ભાગ્ય થાય છે.[52] IPA ઉત્સેચકો અથવા રીસેપ્ટર્સ પર બંધનકર્તા સ્થળો માટે ટ્રિપ્ટોફન-ઉત્પન્ન મેટાબોલિટ સાથે સ્પર્ધા કરી શકે છે, જે સંભવિત રીતે સામાન્ય મેટાબોલિક માર્ગોને વિક્ષેપિત કરે છે. આ તેની ઉપચારાત્મક વિંડોને વધુ સારી રીતે સમજવા માટે તેના ફાર્માકોકાઇનેટિક્સ અને ફાર્માકોડાયનેમિક્સ પર વધુ અભ્યાસની જરૂરિયાતને પ્રકાશિત કરે છે.[57] તે જોવાનું બાકી છે કે શું આ હેમેટોપોએટીક સ્ટેમ સેલ્સ (HSCs) માં પણ થઈ શકે છે.
અમે સ્વીકારીએ છીએ કે અમારા અભ્યાસમાં કેટલીક મર્યાદાઓ છે. ખાસ કરીને IPA સંબંધિત સંગઠનોની તપાસ કરવા માટે, અમે ટાઇપ 2 ડાયાબિટીસ મેલીટસ (T2DM) ધરાવતા દર્દીઓને બાકાત રાખ્યા હતા. અમે સ્વીકારીએ છીએ કે આ ટાઇપ 2 ડાયાબિટીસ મેલીટસ અને અદ્યતન યકૃત રોગ ધરાવતા દર્દીઓ માટે અમારા તારણોની વ્યાપક ઉપયોગિતાને મર્યાદિત કરે છે. માનવ સીરમમાં IPA ની શારીરિક સાંદ્રતા 1-10 μM [11, 20] હોવા છતાં, 1 mM IPA ની સાંદ્રતા સૌથી વધુ બિન-ઝેરી સાંદ્રતા [15] અને એપોપ્ટોસિસના ઉચ્ચતમ દરના આધારે પસંદ કરવામાં આવી હતી, જેમાં નેક્રોટિક સેલ વસ્તીના ટકાવારીમાં કોઈ તફાવત નથી. જોકે આ અભ્યાસમાં IPA ના સુપ્રાફિઝીયોલોજીકલ સ્તરોનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, હાલમાં IPA ના અસરકારક ડોઝ અંગે કોઈ સર્વસંમતિ નથી [52]. અમારા પરિણામો નોંધપાત્ર હોવા છતાં, IPA નું વ્યાપક મેટાબોલિક ભાગ્ય સંશોધનનો સક્રિય ક્ષેત્ર રહે છે. વધુમાં, સીરમ IPA સ્તરો અને લીવર ટ્રાન્સક્રિપ્ટના DNA મેથિલેશન વચ્ચેના જોડાણ પરના અમારા તારણો ફક્ત હેમેટોપોએટીક સ્ટેમ સેલ્સ (HSCs) માંથી જ નહીં પરંતુ યકૃતના પેશીઓમાંથી પણ મેળવવામાં આવ્યા હતા. ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ વિશ્લેષણમાંથી અમારા અગાઉના તારણોના આધારે અમે માનવ LX-2 કોષોનો ઉપયોગ કરવાનું પસંદ કર્યું કે IPA હેમેટોપોએટીક સ્ટેમ સેલ (HSC) સક્રિયકરણ સાથે સંકળાયેલ છે [15], અને HSCs લીવર ફાઇબ્રોસિસની પ્રગતિમાં સામેલ મુખ્ય કોષો છે. લીવર બહુવિધ કોષ પ્રકારોથી બનેલું છે, તેથી અન્ય કોષ મોડેલો જેમ કે હેપેટોસાઇટ-HSC-રોગપ્રતિકારક કોષ સહ-સંસ્કૃતિ સિસ્ટમ કેસ્પેસ સક્રિયકરણ અને DNA ફ્રેગમેન્ટેશન તેમજ પ્રોટીન સ્તર સહિત ક્રિયાની પદ્ધતિ સાથે જોડાયેલી છે, IPA ની ભૂમિકા અને અન્ય લીવર કોષ પ્રકારો સાથે તેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાનો અભ્યાસ કરવા માટે ધ્યાનમાં લેવા જોઈએ.