આ લેખ "રોગકારક જીવાણુઓ અને જીવાતોથી કઠોળના પ્રતિકારમાં સુધારો" સંશોધન વિષયનો એક ભાગ છે, બધા 5 લેખો જુઓ.
ફંગલ પ્લાન્ટ રોગ નેક્રોસિસ સ્ક્લેરોટીનિયા સ્ક્લેરોટીઓરમ (લિબ.) ડી બેરીનું કારણભૂત એજન્ટ વિવિધ યજમાન છોડને ચેપ લગાડવા માટે બહુ-સ્તરીય વ્યૂહરચનાનો ઉપયોગ કરે છે. આ અભ્યાસ ડાયમાઇન એલ-ઓર્નિથિન, એક બિન-પ્રોટીન એમિનો એસિડ જે અન્ય આવશ્યક એમિનો એસિડના સંશ્લેષણને ઉત્તેજિત કરે છે, તેનો ઉપયોગ વૈકલ્પિક વ્યવસ્થાપન વ્યૂહરચના તરીકે પ્રસ્તાવિત કરે છે જેથી સ્યુડોમોનાસ સ્ક્લેરોટીઓરમ દ્વારા થતા સફેદ ફૂગ પ્રત્યે ફેસોલસ વલ્ગારિસ એલ. ના પરમાણુ, શારીરિક અને બાયોકેમિકલ પ્રતિભાવોને વધારી શકાય. ઇન વિટ્રો પ્રયોગો દર્શાવે છે કે એલ-ઓર્નિથિન ડોઝ-આધારિત રીતે એસ. પાયરેનોઇડોસાના માયસેલિયલ વિકાસને નોંધપાત્ર રીતે અટકાવે છે. વધુમાં, તે ગ્રીનહાઉસ પરિસ્થિતિઓમાં સફેદ ફૂગની તીવ્રતાને નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડી શકે છે. વધુમાં, એલ-ઓર્નિથિન સારવાર કરાયેલા છોડના વિકાસને ઉત્તેજિત કરે છે, જે દર્શાવે છે કે એલ-ઓર્નિથિનનું પરીક્ષણ કરાયેલ સાંદ્રતા સારવાર કરાયેલા છોડ માટે ફાયટોટોક્સિક નહોતું. વધુમાં, L-ઓર્નિથિન એ બિન-ઉત્સેચક એન્ટીઑકિસડન્ટો (કુલ દ્રાવ્ય ફિનોલિક્સ અને ફ્લેવોનોઇડ્સ) અને ઉત્સેચક એન્ટીઑકિસડન્ટો (કેટલેઝ (CAT), પેરોક્સિડેઝ (POX), અને પોલીફેનોલ ઓક્સિડેઝ (PPO)) ની અભિવ્યક્તિમાં વધારો કર્યો, અને ત્રણ એન્ટીઑકિસડન્ટ-સંબંધિત જનીનો (PvCAT1, PvSOD, અને PvGR) ની અભિવ્યક્તિમાં વધારો કર્યો. વધુમાં, સિલિકો વિશ્લેષણમાં S. સ્ક્લેરોટીઓરમ જીનોમમાં પુટેટિવ ​​ઓક્સાલોએસેટેટ એસીટીલહાઇડ્રોલેઝ (SsOAH) પ્રોટીનની હાજરી જાહેર થઈ, જે કાર્યાત્મક વિશ્લેષણ, સંરક્ષિત ડોમેન્સ અને ટોપોલોજીના સંદર્ભમાં એસ્પરગિલસ ફિજેન્સિસ (AfOAH) અને પેનિસિલિયમ sp. (PlOAH) ના ઓક્સાલોએસેટેટ એસીટીલહાઇડ્રોલેઝ (SsOAH) પ્રોટીન જેવું જ હતું. રસપ્રદ વાત એ છે કે, બટાકાના ડેક્સ્ટ્રોઝ બ્રોથ (PDB) માધ્યમમાં L-ઓર્નિથિન ઉમેરવાથી S. સ્ક્લેરોટીઓરમ માયસેલિયામાં SsOAH જનીનની અભિવ્યક્તિમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો. તેવી જ રીતે, સારવાર કરાયેલા છોડમાંથી એકત્રિત કરાયેલા ફંગલ માયસેલિયામાં L-ઓર્નિથિનનો બાહ્ય ઉપયોગ SsOAH જનીનની અભિવ્યક્તિમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો કરે છે. અંતે, L-ઓર્નિથિનનો ઉપયોગ PDB માધ્યમ અને ચેપગ્રસ્ત બંને પાંદડાઓમાં ઓક્સાલિક એસિડ સ્ત્રાવમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો કરે છે. નિષ્કર્ષમાં, L-ઓર્નિથિન રેડોક્સ સ્થિતિ જાળવવામાં તેમજ ચેપગ્રસ્ત છોડના સંરક્ષણ પ્રતિભાવને વધારવામાં મુખ્ય ભૂમિકા ભજવે છે. આ અભ્યાસના પરિણામો સફેદ ફૂગને નિયંત્રિત કરવા અને બીન ઉત્પાદન અને અન્ય પાક પર તેની અસર ઘટાડવા માટે નવીન, પર્યાવરણને અનુકૂળ પદ્ધતિઓ વિકસાવવામાં મદદ કરી શકે છે.
સફેદ ફૂગ, જે નેક્રોટ્રોફિક ફૂગ સ્ક્લેરોટીનિયા સ્ક્લેરોટીઓરમ (લિબ.) ડી બેરી દ્વારા થાય છે, તે એક વિનાશક, ઉપજ ઘટાડતો રોગ છે જે વૈશ્વિક કઠોળ (ફેસોલસ વલ્ગારિસ એલ.) ઉત્પાદન માટે ગંભીર ખતરો છે (બોલ્ટન એટ અલ., 2006). સ્ક્લેરોટીનિયા સ્ક્લેરોટીઓરમ એ માટીજન્ય ફૂગના છોડના રોગકારક જીવાણુઓમાંનો એક છે જેને નિયંત્રિત કરવું સૌથી મુશ્કેલ છે, જેમાં 600 થી વધુ છોડની પ્રજાતિઓની વિશાળ યજમાન શ્રેણી છે અને બિન-વિશિષ્ટ રીતે યજમાન પેશીઓને ઝડપથી મેસેરેટ કરવાની ક્ષમતા છે (લિયાંગ અને રોલિન્સ, 2018). પ્રતિકૂળ પરિસ્થિતિઓમાં, તે તેના જીવન ચક્રના એક મહત્વપૂર્ણ તબક્કામાંથી પસાર થાય છે, લાંબા સમય સુધી કાળા, સખત, બીજ જેવા માળખા તરીકે જમીનમાં 'સ્ક્લેરોટીયા' તરીકે અથવા ચેપગ્રસ્ત છોડના માયસેલિયમ અથવા સ્ટેમ પિથમાં સફેદ, રુંવાટીવાળું વૃદ્ધિ તરીકે નિષ્ક્રિય રહે છે (શ્વાર્ટ્ઝ એટ અલ., 2005). એસ. સ્ક્લેરોટીઓરમ સ્ક્લેરોટીયા બનાવવા માટે સક્ષમ છે, જે તેને ચેપગ્રસ્ત ખેતરોમાં લાંબા સમય સુધી ટકી રહેવા અને રોગ દરમિયાન ટકી રહેવાની મંજૂરી આપે છે (શ્વાર્ટ્ઝ એટ અલ., 2005). સ્ક્લેરોટીયા પોષક તત્વોથી ભરપૂર હોય છે, લાંબા સમય સુધી જમીનમાં ટકી શકે છે, અને અનુગામી ચેપ માટે પ્રાથમિક ઇનોક્યુલમ તરીકે સેવા આપે છે (શ્વાર્ટ્ઝ એટ અલ., 2005). અનુકૂળ પરિસ્થિતિઓમાં, સ્ક્લેરોટીયા અંકુરિત થાય છે અને હવામાં ફેલાયેલા બીજકણ ઉત્પન્ન કરે છે જે છોડના જમીન ઉપરના તમામ ભાગોને ચેપ લગાવી શકે છે, જેમાં ફૂલો, દાંડી અથવા શીંગોનો સમાવેશ થાય છે પરંતુ તે મર્યાદિત નથી (શ્વાર્ટ્ઝ એટ અલ., 2005).
સ્ક્લેરોટીનિયા સ્ક્લેરોટીઓરમ તેના યજમાન છોડને ચેપ લગાડવા માટે બહુ-સ્તરીય વ્યૂહરચનાનો ઉપયોગ કરે છે, જેમાં સ્ક્લેરોટીયલ અંકુરણથી લઈને લક્ષણોના વિકાસ સુધીની શ્રેણીબદ્ધ સંકલિત ઘટનાઓનો સમાવેશ થાય છે. શરૂઆતમાં, એસ. સ્ક્લેરોટીઓરમ એપોથેસીયા નામના મશરૂમ જેવી રચનાઓમાંથી સસ્પેન્ડેડ બીજકણ (જેને એસ્કોસ્પોર્સ કહેવાય છે) ઉત્પન્ન કરે છે, જે હવામાં પ્રવેશ કરે છે અને ચેપગ્રસ્ત છોડના કાટમાળ પર બિન-ગતિશીલ સ્ક્લેરોટીયામાં વિકાસ પામે છે (બોલ્ટન એટ અલ., 2006). ત્યારબાદ ફૂગ છોડની કોષ દિવાલ pH ને નિયંત્રિત કરવા, એન્ઝાઇમેટિક ડિગ્રેડેશન અને પેશીઓના આક્રમણને પ્રોત્સાહન આપવા (હેગેડસ અને રિમર, 2005) અને યજમાન છોડના ઓક્સિડેટીવ વિસ્ફોટને દબાવવા માટે ઓક્સાલિક એસિડ, એક વાઇરુલન્સ પરિબળ સ્ત્રાવ કરે છે. આ એસિડિફિકેશન પ્રક્રિયા છોડની કોષ દિવાલને નબળી પાડે છે, ફૂગના કોષ દિવાલ ડિગ્રેડિંગ એન્ઝાઇમ્સ (CWDEs) ના સામાન્ય અને કાર્યક્ષમ સંચાલન માટે અનુકૂળ વાતાવરણ પૂરું પાડે છે, જે રોગકારકને ભૌતિક અવરોધને દૂર કરવા અને યજમાન પેશીઓમાં પ્રવેશ કરવાની મંજૂરી આપે છે (માર્સિયાનો એટ અલ., 1983). એકવાર પ્રવેશ્યા પછી, S. sclerotiorum પોલીગેલેક્ટ્યુરોનેઝ અને સેલ્યુલેઝ જેવા અનેક CWDEs સ્ત્રાવ કરે છે, જે ચેપગ્રસ્ત પેશીઓમાં તેના પ્રસારને સરળ બનાવે છે અને પેશીઓના નેક્રોસિસનું કારણ બને છે. જખમ અને હાઇફલ મેટ્સની પ્રગતિ સફેદ ફૂગના લાક્ષણિક લક્ષણો તરફ દોરી જાય છે (હેગેડસ અને રિમર, 2005). દરમિયાન, યજમાન છોડ પેટર્ન ઓળખ રીસેપ્ટર્સ (PRRs) દ્વારા રોગકારક-સંકળાયેલ પરમાણુ પેટર્ન (PAMPs) ને ઓળખે છે, જે સિગ્નલિંગ ઘટનાઓની શ્રેણીને ટ્રિગર કરે છે જે આખરે સંરક્ષણ પ્રતિભાવોને સક્રિય કરે છે.
દાયકાઓથી રોગ નિયંત્રણના પ્રયાસો છતાં, રોગકારક જીવાણુના પ્રતિકાર, અસ્તિત્વ અને અનુકૂલનક્ષમતાને કારણે, અન્ય વ્યાપારી પાકોની જેમ કઠોળમાં પણ પર્યાપ્ત પ્રતિરોધક જર્મપ્લાઝ્મની અછત રહે છે. તેથી, રોગ વ્યવસ્થાપન અત્યંત પડકારજનક છે અને તેને એક સંકલિત, બહુપક્ષીય વ્યૂહરચનાની જરૂર છે જેમાં સાંસ્કૃતિક પદ્ધતિઓ, જૈવિક નિયંત્રણ અને રાસાયણિક ફૂગનાશકોનું સંયોજન શામેલ છે (ઓ'સુલિવાન એટ અલ., 2021). સફેદ ફૂગનું રાસાયણિક નિયંત્રણ સૌથી અસરકારક છે કારણ કે ફૂગનાશકો, જ્યારે યોગ્ય રીતે અને યોગ્ય સમયે લાગુ કરવામાં આવે છે, ત્યારે તે રોગના ફેલાવાને અસરકારક રીતે નિયંત્રિત કરી શકે છે, ચેપની તીવ્રતા ઘટાડી શકે છે અને ઉપજના નુકસાનને ઘટાડી શકે છે. જો કે, ફૂગનાશકો પર વધુ પડતો ઉપયોગ અને વધુ પડતી નિર્ભરતા એસ. સ્ક્લેરોટીઓરમના પ્રતિરોધક જાતોના ઉદભવ તરફ દોરી શકે છે અને બિન-લક્ષ્ય જીવો, માટીના સ્વાસ્થ્ય અને પાણીની ગુણવત્તા પર નકારાત્મક અસર કરી શકે છે (લે કોઇન્ટે એટ અલ., 2016; સેરેસિની એટ અલ., 2024). તેથી, પર્યાવરણને અનુકૂળ વિકલ્પો શોધવા એ ટોચની પ્રાથમિકતા બની ગઈ છે.
પોલીએમાઇન્સ (PAs), જેમ કે પુટ્રેસીન, સ્પર્મિડાઇન, સ્પર્માઇન અને કેડાવેરીન, માટીજન્ય છોડના રોગકારક જીવાણુઓ સામે આશાસ્પદ વિકલ્પો તરીકે સેવા આપી શકે છે, જેનાથી જોખમી રાસાયણિક ફૂગનાશકોનો ઉપયોગ સંપૂર્ણપણે અથવા આંશિક રીતે ઓછો થાય છે (નેહલા એટ અલ., 2024; યી એટ અલ., 2024). ઉચ્ચ છોડમાં, PAs ઘણી શારીરિક પ્રક્રિયાઓમાં સામેલ છે, જેમાં કોષ વિભાજન, ભિન્નતા અને અજૈવિક અને જૈવિક તાણનો પ્રતિભાવ શામેલ છે, પરંતુ તેના સુધી મર્યાદિત નથી (કિલિની અને નેહલા, 2020). તેઓ એન્ટીઑકિસડન્ટ તરીકે કાર્ય કરી શકે છે, પ્રતિક્રિયાશીલ ઓક્સિજન પ્રજાતિઓ (ROS) ને સાફ કરવામાં મદદ કરી શકે છે, રેડોક્સ હોમિયોસ્ટેસિસ જાળવી શકે છે (નેહલા અને કિલિની, 2023), સંરક્ષણ-સંબંધિત જનીનોને પ્રેરિત કરી શકે છે (રોમેરો એટ અલ., 2018), વિવિધ મેટાબોલિક માર્ગોનું નિયમન કરી શકે છે (નેહલા અને કિલિની, 2023), એન્ડોજેનસ ફાયટોહોર્મોન્સ (નેહલા અને કિલિની, 2019), પ્રણાલીગત હસ્તગત પ્રતિકાર (SAR) સ્થાપિત કરી શકે છે, અને છોડ-રોગકારક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓનું નિયમન કરી શકે છે (નેહલા અને કિલિની, 2020; એસિજા એટ અલ., 2022; સેરવોનીક, 2022). એ નોંધવું યોગ્ય છે કે છોડ સંરક્ષણમાં PAs ની ચોક્કસ પદ્ધતિઓ અને ભૂમિકાઓ છોડની પ્રજાતિઓ, રોગકારક જીવાણુઓ અને પર્યાવરણીય પરિસ્થિતિઓના આધારે બદલાય છે. છોડમાં સૌથી વધુ વિપુલ પ્રમાણમાં PA આવશ્યક પોલિમાઇન L-ઓર્નિથિન (કિલિની અને નેહલા, 2020) માંથી બાયોસિન્થેસાઇઝ્ડ છે.
છોડના વિકાસ અને વિકાસમાં એલ-ઓર્નિથિન બહુવિધ ભૂમિકાઓ ભજવે છે. ઉદાહરણ તરીકે, અગાઉના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે ચોખામાં (ઓરીઝા સેટીવા), ઓર્નિથિન નાઇટ્રોજન રિસાયક્લિંગ (લિયુ એટ અલ., 2018), ચોખાની ઉપજ, ગુણવત્તા અને સુગંધ (લુ એટ અલ., 2020), અને પાણીના તાણ પ્રતિભાવ (યાંગ એટ અલ., 2000) સાથે સંકળાયેલ હોઈ શકે છે. વધુમાં, એલ-ઓર્નિથિનનો બાહ્ય ઉપયોગ ખાંડ બીટ (બીટા વલ્ગારિસ) (હુસેન એટ અલ., 2019) માં દુષ્કાળ સહનશીલતામાં નોંધપાત્ર વધારો કરે છે અને ડુંગળી (એલિયમ સેપા) (કેવુસોઓલુ અને કેવુસોઓલુ, 2021) અને કાજુ (એનાકાર્ડિયમ ઓક્સિડેન્ટેલ) છોડ (દા રોચા એટ અલ., 2012) માં મીઠાના તાણને દૂર કરે છે. અજૈવિક તાણ સંરક્ષણમાં એલ-ઓર્નિથિનની સંભવિત ભૂમિકા સારવાર કરાયેલા છોડમાં પ્રોલાઇન સંચયમાં તેની સંડોવણીને કારણે હોઈ શકે છે. ઉદાહરણ તરીકે, પ્રોલાઇન ચયાપચય સાથે સંબંધિત જનીનો, જેમ કે ઓર્નિથિન ડેલ્ટા એમિનોટ્રાન્સફેરેઝ (ડેલ્ટા-OAT) અને પ્રોલાઇન ડિહાઇડ્રોજેનેઝ (ProDH1 અને ProDH2) જનીનો, અગાઉ બિન-યજમાન સ્યુડોમોનાસ સિરીન્જી સ્ટ્રેન્સ (સેન્થિલ-કુમાર અને મૈસુર, 2012) સામે નિકોટિઆના બેન્થામિયાના અને એરેબિડોપ્સિસ થાલિયાનાના સંરક્ષણમાં સામેલ હોવાનું નોંધાયું છે. બીજી બાજુ, રોગકારક વૃદ્ધિ માટે ફંગલ ઓર્નિથિન ડેકાર્બોક્સિલેઝ (ODC) જરૂરી છે (સિંહ એટ અલ., 2020). યજમાન-પ્રેરિત જનીન સાયલન્સિંગ (HIGS) દ્વારા ફ્યુઝેરિયમ ઓક્સિસ્પોરમ એફ. એસપી. લાઇકોપર્સિસીના ODC ને લક્ષ્ય બનાવવાથી ફ્યુઝેરિયમ વિલ્ટ (સિંહ એટ અલ., 2020) સામે ટમેટાના છોડના પ્રતિકારમાં નોંધપાત્ર વધારો થયો છે. જો કે, ફાયટોપેથોજેન્સ જેવા જૈવિક તાણ સામે બાહ્ય ઓર્નિથિન એપ્લિકેશનની સંભવિત ભૂમિકાનો સારી રીતે અભ્યાસ કરવામાં આવ્યો નથી. વધુ મહત્ત્વની વાત એ છે કે, રોગ પ્રતિકારક શક્તિ અને સંકળાયેલ બાયોકેમિકલ અને શારીરિક ઘટનાઓ પર ઓર્નિથિનની અસરો મોટાભાગે અન્વેષિત રહે છે.
અસરકારક નિયંત્રણ વ્યૂહરચનાઓ વિકસાવવા માટે કઠોળના S. સ્ક્લેરોટીઓરમ ચેપની જટિલતાને સમજવી મહત્વપૂર્ણ છે. આ અભ્યાસમાં, અમે સ્ક્લેરોટીનિયા સ્ક્લેરોટીઓરમ ચેપ સામે કઠોળના છોડના સંરક્ષણ પદ્ધતિઓ અને પ્રતિકારને વધારવામાં ડાયમાઇન L-ઓર્નિથિનની સંભવિત ભૂમિકાને ઓળખવાનો ઉદ્દેશ્ય રાખ્યો હતો. અમે અનુમાન કરીએ છીએ કે, ચેપગ્રસ્ત છોડના સંરક્ષણ પ્રતિભાવોને વધારવા ઉપરાંત, L-ઓર્નિથિન રેડોક્સ સ્થિતિ જાળવવામાં પણ મુખ્ય ભૂમિકા ભજવે છે. અમે પ્રસ્તાવ મૂકીએ છીએ કે L-ઓર્નિથિનની સંભવિત અસરો એન્ઝાઇમેટિક અને નોન-એન્ઝાઇમેટિક એન્ટીઑકિસડન્ટ સંરક્ષણ પદ્ધતિઓના નિયમન અને ફંગલ રોગકારકતા/વાયરુલન્સ પરિબળો અને સંકળાયેલ પ્રોટીન સાથે દખલ સાથે સંબંધિત છે. L-ઓર્નિથિનની આ બેવડી કાર્યક્ષમતા તેને સફેદ ફૂગની અસરને ઘટાડવા અને આ શક્તિશાળી ફૂગના રોગકારક રોગ સામે સામાન્ય કઠોળના પાકના પ્રતિકારને વધારવા માટે ટકાઉ વ્યૂહરચના માટે આશાસ્પદ ઉમેદવાર બનાવે છે. વર્તમાન અભ્યાસના પરિણામો સફેદ ફૂગને નિયંત્રિત કરવા અને કઠોળના ઉત્પાદન પર તેની અસરને ઘટાડવા માટે નવીન, પર્યાવરણને અનુકૂળ પદ્ધતિઓના વિકાસમાં મદદ કરી શકે છે.
આ અભ્યાસમાં, સામાન્ય બીનની સંવેદનશીલ વ્યાપારી જાત, ગીઝા 3 (ફેઝોલસ વલ્ગારિસ એલ. સીવી. ગીઝા 3), પ્રાયોગિક સામગ્રી તરીકે ઉપયોગમાં લેવામાં આવી હતી. ઇજિપ્તના ફિલ્ડ ક્રોપ રિસર્ચ ઇન્સ્ટિટ્યૂટ (એફસીઆરઆઈ), કૃષિ સંશોધન કેન્દ્ર (એઆરસી), લેગ્યુમ સંશોધન વિભાગ દ્વારા સ્વસ્થ બીજ કૃપા કરીને પૂરા પાડવામાં આવ્યા હતા. ગ્રીનહાઉસ પરિસ્થિતિઓ (25 ± 2 °C, સાપેક્ષ ભેજ 75 ± 1%, 8 કલાક પ્રકાશ/16 કલાક ઘેરો) હેઠળ S. સ્ક્લેરોટીઓરમ-સંક્રમિત માટીથી ભરેલા પ્લાસ્ટિકના કુંડામાં (આંતરિક વ્યાસ 35 સે.મી., ઊંડાઈ 50 સે.મી.) પાંચ બીજ વાવવામાં આવ્યા હતા. વાવણી પછી 7-10 દિવસ (DPS) પર, રોપાઓને પાતળા કરવામાં આવ્યા હતા જેથી દરેક કુંડામાં સમાન વૃદ્ધિવાળા અને ત્રણ સંપૂર્ણ રીતે વિસ્તરેલા પાંદડાવાળા માત્ર બે રોપા બાકી રહે. બધા કુંડાવાળા છોડને દર બે અઠવાડિયામાં એકવાર પાણી આપવામાં આવતું હતું અને આપેલ વિવિધતા માટે ભલામણ કરેલ દરે માસિક ખાતર આપવામાં આવતું હતું.
L-ornithinediamine (જેને (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, જર્મની તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે) ની 500 mg/L સાંદ્રતા તૈયાર કરવા માટે, 50 mg સૌપ્રથમ 100 ml જંતુરહિત નિસ્યંદિત પાણીમાં ઓગાળવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ સ્ટોક સોલ્યુશનને પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું અને પછીના પ્રયોગોમાં તેનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. ટૂંકમાં, L-ornithine સાંદ્રતાની છ શ્રેણી (12.5, 25, 50, 75, 100, અને 125 mg/L) નું ઇન વિટ્રો પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું. વધુમાં, જંતુરહિત નિસ્યંદિત પાણીનો ઉપયોગ નકારાત્મક નિયંત્રણ (મોક) તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો અને વ્યાપારી ફૂગનાશક "Rizolex-T" 50% વેટેબલ પાવડર (ટોક્લોફોસ-મિથાઈલ 20% + થિરામ 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypt) નો ઉપયોગ હકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. વાણિજ્યિક ફૂગનાશક "રિઝોલેક્સ-ટી" નું ઇન વિટ્રો પરીક્ષણ પાંચ સાંદ્રતા (2, 4, 6, 8 અને 10 મિલિગ્રામ/લિટર) પર કરવામાં આવ્યું હતું.
સફેદ ફૂગના લાક્ષણિક લક્ષણો દર્શાવતા સામાન્ય કઠોળના દાંડી અને શીંગોના નમૂનાઓ (ઉપદ્રવ દર: 10-30%) વાણિજ્યિક ખેતરોમાંથી એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. જોકે મોટાભાગના ચેપગ્રસ્ત છોડના પદાર્થો પ્રજાતિઓ/જાતિઓ (સંવેદનશીલ વ્યાપારી વિવિધતા ગીઝા 3) દ્વારા ઓળખવામાં આવ્યા હતા, અન્ય, ખાસ કરીને સ્થાનિક બજારોમાંથી મેળવેલા, અજાણ્યા પ્રજાતિઓના હતા. એકત્રિત ચેપગ્રસ્ત પદાર્થોને પહેલા 0.5% સોડિયમ હાઇપોક્લોરાઇટ દ્રાવણથી 3 મિનિટ માટે સપાટી પર જંતુમુક્ત કરવામાં આવ્યા હતા, પછી જંતુરહિત નિસ્યંદિત પાણીથી ઘણી વખત ધોઈ નાખવામાં આવ્યા હતા અને વધારાનું પાણી દૂર કરવા માટે જંતુરહિત ફિલ્ટર પેપરથી સૂકવી નાખવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ ચેપગ્રસ્ત અંગોને મધ્યમ પેશીઓ (સ્વસ્થ અને ચેપગ્રસ્ત પેશીઓ વચ્ચે) ના નાના ટુકડાઓમાં કાપીને બટાકાના ડેક્સ્ટ્રોઝ અગર (PDA) માધ્યમ પર ઉછેરવામાં આવ્યા હતા અને સ્ક્લેરોટીયા રચનાને ઉત્તેજીત કરવા માટે 12 કલાક પ્રકાશ/12 કલાક શ્યામ ચક્ર સાથે 25 ± 2 °C પર 5 દિવસ માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા. માયસેલિયલ ટિપ પદ્ધતિનો ઉપયોગ મિશ્ર અથવા દૂષિત સંસ્કૃતિઓમાંથી ફૂગના આઇસોલેટ્સને શુદ્ધ કરવા માટે પણ કરવામાં આવ્યો હતો. શુદ્ધ ફંગલ આઇસોલેટને પહેલા તેની સાંસ્કૃતિક મોર્ફોલોજિકલ લાક્ષણિકતાઓના આધારે ઓળખવામાં આવ્યું હતું અને પછી માઇક્રોસ્કોપિક લાક્ષણિકતાઓના આધારે એસ. સ્ક્લેરોટીઓરમ હોવાની પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી. અંતે, કોચના સિદ્ધાંતોને પૂર્ણ કરવા માટે સંવેદનશીલ સામાન્ય બીન કલ્ટીવાર ગીઝા 3 પર રોગકારકતા માટે બધા શુદ્ધ આઇસોલેટનું પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
વધુમાં, સૌથી આક્રમક S. sclerotiorum isolate (isolate #3) ને White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017 દ્વારા વર્ણવેલ આંતરિક ટ્રાન્સક્રિપ્ટેડ સ્પેસર (ITS) સિક્વન્સિંગના આધારે વધુ પુષ્ટિ મળી હતી. ટૂંકમાં, આઇસોલેટ્સને બટાકાના ડેક્સ્ટ્રોઝ બ્રોથ (PDB) માં કલ્ચર કરવામાં આવ્યા હતા અને 25 ± 2 °C પર 5-7 દિવસ માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ ફંગલ માયસેલિયમ એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું, ચીઝક્લોથ દ્વારા ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યું હતું, જંતુરહિત પાણીથી બે વાર ધોવામાં આવ્યું હતું અને જંતુરહિત ફિલ્ટર પેપરથી સૂકવવામાં આવ્યું હતું. Quick-DNA™ ફંગલ/બેક્ટેરિયલ મિનિપ્રેપ કીટ (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024) નો ઉપયોગ કરીને જીનોમિક DNA ને અલગ કરવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ ITS rDNA પ્રદેશને ચોક્કસ પ્રાઈમર જોડી ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; અપેક્ષિત કદ: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017) નો ઉપયોગ કરીને વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યો. શુદ્ધ PCR ઉત્પાદનોને સિક્વન્સિંગ માટે સબમિટ કરવામાં આવ્યા હતા (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNA સિક્વન્સને સેન્જર સિક્વન્સિંગ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને દ્વિ-દિશાત્મક રીતે સિક્વન્સ કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ BLASTn સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને GenBank અને નેશનલ સેન્ટર ફોર બાયોટેકનોલોજી ઇન્ફર્મેશન (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) માં નવીનતમ ડેટા સાથે એસેમ્બલ કરાયેલા ક્વેરી સિક્વન્સની સરખામણી કરવામાં આવી હતી. મોલેક્યુલર ઇવોલ્યુશનરી જિનેટિક્સ એનાલિસિસ પેકેજ (MEGA-11; વર્ઝન 11) (કુમાર એટ અલ., 2024) માં ClustalW નો ઉપયોગ કરીને NCBI GenBank (સપ્લીમેન્ટરી ટેબલ S1) માં નવીનતમ ડેટામાંથી મેળવેલા 20 અન્ય S. sclerotiorum સ્ટ્રેન્સ/આઇસોલેટ્સ સાથે ક્વેરી સિક્વન્સની સરખામણી કરવામાં આવી હતી. ઉત્ક્રાંતિ વિશ્લેષણ મહત્તમ સંભાવના પદ્ધતિ અને સામાન્ય સમય-ઉલટાવી શકાય તેવા ન્યુક્લિયોટાઇડ અવેજી મોડેલ (ની અને કુમાર, 2000) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. સૌથી વધુ લોગ-સંભવના ધરાવતું વૃક્ષ બતાવવામાં આવ્યું છે. હ્યુરિસ્ટિક શોધ માટે પ્રારંભિક વૃક્ષ નેબર-જોડાઈ રહેલા (NJ) વૃક્ષ (કુમાર એટ અલ., 2024) અને મહત્તમ પારસીમોની (MP) વૃક્ષ વચ્ચે વધુ લોગ-સંભવના ધરાવતું વૃક્ષ પસંદ કરીને પસંદ કરવામાં આવે છે. NJ વૃક્ષનું નિર્માણ સામાન્ય સમય-ઉલટાવી શકાય તેવા મોડેલ (ની અને કુમાર, 2000) નો ઉપયોગ કરીને ગણતરી કરાયેલ જોડીવાર અંતર મેટ્રિક્સનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.
L-ornithine અને જીવાણુનાશક “Rizolex-T” ની જીવાણુનાશક પ્રવૃત્તિ અગર પ્રસરણ પદ્ધતિ દ્વારા ઇન વિટ્રોમાં નક્કી કરવામાં આવી હતી. પદ્ધતિ: L-ornithine ના સ્ટોક સોલ્યુશન (500 mg/L) ની યોગ્ય માત્રા લો અને તેને 10 મિલી PDA પોષક માધ્યમ સાથે સારી રીતે ભેળવીને અનુક્રમે 12.5, 25, 50, 75, 100 અને 125 mg/L ની અંતિમ સાંદ્રતા સાથે દ્રાવણ તૈયાર કરો. નિયંત્રણ તરીકે ફૂગનાશક “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 અને 10 mg/L) ની પાંચ સાંદ્રતા અને જંતુરહિત નિસ્યંદિત પાણીનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. માધ્યમ ઘન થયા પછી, 4 મીમી વ્યાસવાળા સ્ક્લેરોટીનિયા સ્ક્લેરોટીઓરમ કલ્ચરનો તાજો તૈયાર કરેલ માયસેલિયલ પ્લગ, પેટ્રી ડીશના કેન્દ્રમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યો અને 25±2°C પર કલ્ચર કરવામાં આવ્યું જ્યાં સુધી માયસેલિયમ સમગ્ર નિયંત્રણ પેટ્રી ડીશને આવરી ન લે, જેના પછી ફૂગનો વિકાસ નોંધવામાં આવ્યો. સમીકરણ 1 નો ઉપયોગ કરીને S. sclerotiorum ના રેડિયલ વૃદ્ધિના ટકાવારી અવરોધની ગણતરી કરો:
પ્રયોગ બે વાર પુનરાવર્તિત કરવામાં આવ્યો, જેમાં દરેક નિયંત્રણ/પ્રાયોગિક જૂથ માટે છ જૈવિક પ્રતિકૃતિઓ અને દરેક જૈવિક પ્રતિકૃતિ માટે પાંચ કુંડા (દરેક કુંડામાં બે છોડ) હતા. પ્રાયોગિક પરિણામોની ચોકસાઈ, વિશ્વસનીયતા અને પ્રજનનક્ષમતા સુનિશ્ચિત કરવા માટે દરેક જૈવિક પ્રતિકૃતિનું બે વાર વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું (બે તકનીકી પ્રતિકૃતિઓ). વધુમાં, પ્રોબિટ રીગ્રેશન વિશ્લેષણનો ઉપયોગ અર્ધ-મહત્તમ અવરોધક સાંદ્રતા (IC50) અને IC99 (પ્રેન્ટિસ, 1976) ની ગણતરી કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.
ગ્રીનહાઉસ પરિસ્થિતિઓમાં L-ઓર્નિથિનની સંભાવનાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, બે સતત કુંડા પ્રયોગો હાથ ધરવામાં આવ્યા. ટૂંકમાં, કુંડાઓને વંધ્યીકૃત માટી-રેતીની માટી (3:1) થી ભરવામાં આવ્યા હતા અને S. sclerotiorum ના તાજા તૈયાર કરેલા કલ્ચરથી ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવ્યા હતા. પ્રથમ, S. sclerotiorum (આઇસોલેટ #3) ના સૌથી આક્રમક આઇસોલેટને એક સ્ક્લેરોટિયમને અડધા ભાગમાં કાપીને, તેને PDA પર મોઢું રાખીને અને 25°C પર સતત અંધારામાં (24 કલાક) 4 દિવસ માટે ઇન્ક્યુબેશન કરીને માયસેલિયલ વૃદ્ધિને ઉત્તેજીત કરીને ઉછેરવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ ચાર 5 મીમી વ્યાસના અગર પ્લગને આગળની ધારમાંથી લેવામાં આવ્યા હતા અને ઘઉં અને ચોખાના ભૂસાના 100 ગ્રામ જંતુરહિત મિશ્રણ (1:1, v/v) સાથે ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવ્યા હતા અને સ્ક્લેરોટીયા રચનાને ઉત્તેજીત કરવા માટે બધા ફ્લાસ્કને 25 ± 2 °C પર 5 દિવસ માટે 12 કલાક પ્રકાશ/12 કલાક શ્યામ ચક્ર હેઠળ ઇન્ક્યુબેશન કરવામાં આવ્યા હતા. માટી ઉમેરતા પહેલા એકરૂપતા સુનિશ્ચિત કરવા માટે બધા ફ્લાસ્કની સામગ્રીને સંપૂર્ણપણે મિશ્રિત કરવામાં આવી હતી. પછી, રોગકારક જીવાણુઓની સતત સાંદ્રતા સુનિશ્ચિત કરવા માટે દરેક વાસણમાં 100 ગ્રામ કોલોનાઇઝિંગ બ્રાન મિશ્રણ ઉમેરવામાં આવ્યું. ફૂગના વિકાસને સક્રિય કરવા માટે ઇનોક્યુલેટેડ વાસણોને પાણી આપવામાં આવ્યું અને 7 દિવસ માટે ગ્રીનહાઉસ સ્થિતિમાં મૂકવામાં આવ્યું.
ત્યારબાદ દરેક કુંડામાં ગીઝા 3 જાતના પાંચ બીજ વાવવામાં આવ્યા. L-ઓર્નિથિન અને ફૂગનાશક રિઝોલેક્સ-ટીથી સારવાર કરાયેલા કુંડા માટે, વંધ્યીકૃત બીજને પહેલા બે સંયોજનોના જલીય દ્રાવણમાં બે કલાક માટે પલાળી રાખવામાં આવ્યા હતા જેમાં અનુક્રમે લગભગ 250 મિલિગ્રામ/લિટર અને 50 મિલિગ્રામ/લિટરની અંતિમ IC99 સાંદ્રતા હતી, અને પછી વાવણી પહેલાં એક કલાક માટે હવામાં સૂકવવામાં આવ્યા હતા. બીજી બાજુ, નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે બીજને જંતુરહિત નિસ્યંદિત પાણીમાં પલાળી રાખવામાં આવ્યા હતા. 10 દિવસ પછી, પ્રથમ પાણી આપતા પહેલા, રોપાઓને પાતળા કરવામાં આવ્યા હતા, દરેક કુંડામાં ફક્ત બે સુઘડ રોપા બાકી રહ્યા હતા. વધુમાં, S. sclerotiorum સાથે ચેપ સુનિશ્ચિત કરવા માટે, સમાન વિકાસના તબક્કા (10 દિવસ) પર બીન છોડના દાંડીઓને બે અલગ અલગ સ્થળોએ વંધ્યીકૃત સ્કેલ્પેલનો ઉપયોગ કરીને કાપવામાં આવ્યા હતા અને લગભગ 0.5 ગ્રામ કોલોનાઇઝિંગ બ્રાન મિશ્રણ દરેક ઘામાં મૂકવામાં આવ્યું હતું, ત્યારબાદ બધા ઇનોક્યુલેટેડ છોડમાં ચેપ અને રોગના વિકાસને ઉત્તેજીત કરવા માટે ઉચ્ચ ભેજ આપવામાં આવ્યો હતો. નિયંત્રણ છોડને પણ એ જ રીતે ઘાયલ કરવામાં આવ્યા હતા અને સમાન માત્રામાં (0.5 ગ્રામ) જંતુરહિત, વસાહત વગરનું બ્રાન મિશ્રણ ઘામાં નાખવામાં આવ્યું હતું અને રોગના વિકાસ માટે વાતાવરણનું અનુકરણ કરવા અને સારવાર જૂથો વચ્ચે સુસંગતતા સુનિશ્ચિત કરવા માટે ઉચ્ચ ભેજ હેઠળ જાળવવામાં આવ્યું હતું.
સારવાર પદ્ધતિ: કઠોળના રોપાઓને 500 મિલી એલ-ઓર્નિથિન (250 મિલિગ્રામ/લિ) ના જલીય દ્રાવણ અથવા ફૂગનાશક રિઝોલેક્સ-ટી (50 મિલિગ્રામ/લિ) થી જમીનમાં સિંચાઈ કરીને પાણી આપવામાં આવ્યું હતું, પછી 10 દિવસના અંતરાલ સાથે ત્રણ વખત સારવાર પુનરાવર્તિત કરવામાં આવી હતી. પ્લેસબો-ટ્રીટેડ નિયંત્રણોને 500 મિલી જંતુરહિત નિસ્યંદિત પાણીથી સિંચાઈ કરવામાં આવી હતી. બધી સારવાર ગ્રીનહાઉસ પરિસ્થિતિઓમાં (25 ± 2°C, 75 ± 1% સાપેક્ષ ભેજ, અને 8 કલાક પ્રકાશ/16 કલાક અંધારાનો ફોટોપીરિયડ) કરવામાં આવી હતી. બધા કુંડાઓને દર પખવાડિયે પાણી આપવામાં આવતું હતું અને દર મહિને સંતુલિત NPK ખાતર (20-20-20, 3.6% સલ્ફર અને TE સૂક્ષ્મ તત્વો સાથે; ઝૈન સીડ્સ, ઇજિપ્ત) સાથે 3-4 ગ્રામ/લિ ની સાંદ્રતામાં ચોક્કસ જાત માટે ભલામણો અને ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર પાંદડા પર છંટકાવ કરીને સારવાર આપવામાં આવતી હતી. જ્યાં સુધી અન્યથા જણાવ્યું ન હોય ત્યાં સુધી, સંપૂર્ણ રીતે વિસ્તૃત પરિપક્વ પાંદડા (ઉપરથી બીજા અને ત્રીજા પાંદડા) દરેક જૈવિક પ્રતિકૃતિમાંથી 72 કલાક પછી સારવાર (hpt) પર એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા, એકરૂપ, એકત્ર અને -80 °C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા, જેમાં ઓક્સિડેટીવ તણાવ સૂચકાંકોના ઇન સિટુ હિસ્ટોકેમિકલ સ્થાનિકીકરણ, લિપિડ પેરોક્સિડેશન, એન્ઝાઇમેટિક અને નોન-એન્ઝાઇમેટિક એન્ટીઑકિસડન્ટ્સ અને જનીન અભિવ્યક્તિનો સમાવેશ થાય છે, પરંતુ તેના સુધી મર્યાદિત નથી.
ટેરન એટ અલ. (2006) દ્વારા સંશોધિત પેટઝોલ્ડ્ટ અને ડિકસન સ્કેલ (1996) ના આધારે ઇનોક્યુલેશન પછીના 21 દિવસ (dpi) ની તીવ્રતાનું સાપ્તાહિક મૂલ્યાંકન 1-9 (પૂરક કોષ્ટક S2) ના સ્કેલનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, ઇન્ટરનોડ્સ અને ગાંઠો સાથે જખમની પ્રગતિને અનુસરવા માટે ઇનોક્યુલેશન બિંદુથી શરૂ કરીને બીન છોડના દાંડી અને શાખાઓની તપાસ કરવામાં આવી હતી. ત્યારબાદ ઇનોક્યુલેશન બિંદુથી સ્ટેમ અથવા શાખા સાથે સૌથી દૂરના બિંદુ સુધી જખમનું અંતર માપવામાં આવ્યું હતું અને જખમના સ્થાનના આધારે 1-9 નો સ્કોર સોંપવામાં આવ્યો હતો, જ્યાં (1) ઇનોક્યુલેશન બિંદુ નજીક કોઈ દૃશ્યમાન ચેપ સૂચવતો ન હતો અને (2-9) જખમના કદમાં ધીમે ધીમે વધારો અને ગાંઠો/ઇન્ટરનોડ્સ સાથે પ્રગતિ સૂચવતો હતો (પૂરક કોષ્ટક S2). પછી સૂત્ર 2 નો ઉપયોગ કરીને સફેદ ફૂગના ચેપની તીવ્રતાને ટકાવારીમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવી હતી:
વધુમાં, રોગ પ્રગતિ વળાંક (AUDPC) હેઠળના ક્ષેત્રની ગણતરી સૂત્ર (શેનર અને ફિની, 1977) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી, જેને તાજેતરમાં સમીકરણ 3 નો ઉપયોગ કરીને સામાન્ય કઠોળના સફેદ સડો (ચૌહાણ એટ અલ., 2020) માટે સ્વીકારવામાં આવ્યું હતું:
જ્યાં Yi = રોગની તીવ્રતા ti સમયે, Yi+1 = આગામી સમયે રોગની તીવ્રતા ti+1, ti = પ્રથમ માપનનો સમય (દિવસોમાં), ti+1 = આગામી માપનનો સમય (દિવસોમાં), n = સમય બિંદુઓ અથવા અવલોકન બિંદુઓની કુલ સંખ્યા. છોડની ઊંચાઈ (સેમી), છોડ દીઠ શાખાઓની સંખ્યા અને છોડ દીઠ પાંદડાઓની સંખ્યા સહિત બીન છોડના વિકાસ પરિમાણો 21 દિવસ માટે તમામ જૈવિક પ્રતિકૃતિઓમાં સાપ્તાહિક રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યા હતા.
દરેક જૈવિક પ્રતિકૃતિમાં, પાંદડાના નમૂનાઓ (ઉપરથી બીજા અને ત્રીજા સંપૂર્ણ વિકસિત પાંદડા) સારવાર પછી 45મા દિવસે (છેલ્લી સારવાર પછી 15 દિવસ) એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. દરેક જૈવિક પ્રતિકૃતિમાં પાંચ કુંડા (દરેક કુંડામાં બે છોડ) હતા. લગભગ 500 મિલિગ્રામ કચડી પેશીઓનો ઉપયોગ પ્રકાશસંશ્લેષણ રંગદ્રવ્યો (ક્લોરોફિલ a, ક્લોરોફિલ b અને કેરોટીનોઇડ્સ) ના નિષ્કર્ષણ માટે અંધારામાં 4 °C તાપમાને 80% એસીટોનનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યો હતો. 24 કલાક પછી, નમૂનાઓને સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા અને ત્રણ અલગ અલગ તરંગલંબાઇ (A470, A646 અને A663 nm) પર શોષણ માપીને (લિક્ટેન્થેલર, 1987) પદ્ધતિ અનુસાર UV-160A સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર (શિમાડઝુ કોર્પોરેશન, જાપાન) નો ઉપયોગ કરીને રંગીન રીતે હરિતદ્રવ્ય a, હરિતદ્રવ્ય b અને કેરોટીનોઇડ સામગ્રીના નિર્ધારણ માટે સુપરનેટન્ટ એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. અંતે, પ્રકાશસંશ્લેષણ રંગદ્રવ્યોની સામગ્રીની ગણતરી લિક્ટેન્થેલર (1987) દ્વારા વર્ણવેલ નીચેના સૂત્રો 4-6 નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી.
72 કલાક પછી સારવાર (hpt) પર, હાઇડ્રોજન પેરોક્સાઇડ (H2O2) અને સુપરઓક્સાઇડ આયન (O2•−) ના ઇન સિટુ હિસ્ટોકેમિકલ સ્થાનિકીકરણ માટે દરેક જૈવિક પ્રતિકૃતિમાંથી પાંદડા (ઉપરથી બીજા અને ત્રીજા સંપૂર્ણ વિકસિત પાંદડા) એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. દરેક જૈવિક પ્રતિકૃતિમાં પાંચ કુંડા (દરેક કુંડામાં બે છોડ) હતા. પદ્ધતિની ચોકસાઈ, વિશ્વસનીયતા અને પ્રજનનક્ષમતા સુનિશ્ચિત કરવા માટે દરેક જૈવિક પ્રતિકૃતિનું ડુપ્લિકેટ (બે તકનીકી પ્રતિકૃતિઓ) માં વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. H2O2 અને O2•− અનુક્રમે 0.1% 3,3′-ડાયામિનોબેન્ઝિડિન (DAB; સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ, ડાર્મસ્ટેડ, જર્મની) અથવા નાઇટ્રોબ્લુ ટેટ્રાઝોલિયમ (NBT; સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ, ડાર્મસ્ટેડ, જર્મની) નો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા, જે રોમેરો-પ્યુર્ટાસ એટ અલ. (2004) અને એડમ એટ અલ. (1989) દ્વારા વર્ણવેલ પદ્ધતિઓને અનુસરીને નાના ફેરફારો સાથે કરવામાં આવ્યા હતા. H2O2 ના હિસ્ટોકેમિકલ સ્થાનિકીકરણ માટે, પત્રિકાઓને 10 mM ટ્રિસ બફર (pH 7.8) માં 0.1% DAB સાથે વેક્યુમ ઘુસાડવામાં આવ્યા હતા અને પછી પ્રકાશમાં ઓરડાના તાપમાને 60 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા. પત્રિકાઓને 0.15% (v/v) TCA માં 4:1 (v/v) ઇથેનોલ:ક્લોરોફોર્મ (અલ-ગોમહોરિયા ફાર્માસ્યુટિકલ્સ અને મેડિકલ સપ્લાય, કૈરો, ઇજિપ્ત) માં બ્લીચ કરવામાં આવ્યા હતા અને પછી તે અંધારા સુધી પ્રકાશમાં ખુલ્લા પાડવામાં આવ્યા હતા. તેવી જ રીતે, વાલ્વને 10 mM પોટેશિયમ ફોસ્ફેટ બફર (pH 7.8) સાથે વેક્યુમ ઘુસાડવામાં આવ્યા હતા જેમાં 0.1 w/v % HBT હોય છે જેથી O2•− સ્થાનમાં હિસ્ટોકેમિકલ સ્થાનિકીકરણ થાય. પત્રિકાઓને ઓરડાના તાપમાને 20 મિનિટ માટે પ્રકાશમાં ઉકાળવામાં આવ્યા હતા, પછી ઉપર મુજબ બ્લીચ કરવામાં આવ્યા હતા, અને પછી ઘેરા વાદળી/વાયોલેટ ફોલ્લીઓ દેખાય ત્યાં સુધી પ્રકાશિત કરવામાં આવ્યા હતા. પરિણામી ભૂરા (H2O2 સૂચક તરીકે) અથવા વાદળી-વાયોલેટ (O2•− સૂચક તરીકે) રંગની તીવ્રતાનું મૂલ્યાંકન ઇમેજ પ્રોસેસિંગ પેકેજ ImageJ (http://fiji.sc; 7 માર્ચ 2024 ના રોજ ઍક્સેસ કરેલ) ના ફિજી સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.
મેલોન્ડિઆલ્ડીહાઇડ (MDA; લિપિડ પેરોક્સિડેશનના માર્કર તરીકે) થોડા ફેરફારો સાથે Du અને Bramlage (1992) ની પદ્ધતિ અનુસાર નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું. દરેક જૈવિક પ્રતિકૃતિ (ઉપરથી બીજા અને ત્રીજા સંપૂર્ણ વિકસિત પાંદડા) માંથી પાંદડા સારવાર પછી 72 કલાક (hpt) એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. દરેક જૈવિક પ્રતિકૃતિમાં પાંચ કુંડા (એક કુંડા દીઠ બે છોડ) શામેલ હતા. પદ્ધતિની ચોકસાઈ, વિશ્વસનીયતા અને પ્રજનનક્ષમતા સુનિશ્ચિત કરવા માટે દરેક જૈવિક પ્રતિકૃતિનું ડુપ્લિકેટ (બે તકનીકી પ્રતિકૃતિઓ) માં વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, 0.01% બ્યુટીલેટેડ હાઇડ્રોક્સિટોલ્યુએન (BHT; સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ, સેન્ટ લૂઇસ, MO, USA) ધરાવતા 20% ટ્રાઇક્લોરોએસેટિક એસિડ (TCA; મિલિપોરસિગ્મા, બર્લિંગ્ટન, MA, USA) સાથે MDA નિષ્કર્ષણ માટે 0.5 ગ્રામ ગ્રાઉન્ડ લીફ ટીશ્યુનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. ત્યારબાદ સુપરનેટન્ટમાં MDA સામગ્રીને UV-160A સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર (શિમાડઝુ કોર્પોરેશન, જાપાન) નો ઉપયોગ કરીને 532 અને 600 nm પર શોષકતા માપીને રંગમેટ્રિક રીતે નક્કી કરવામાં આવી હતી અને પછી nmol g−1 FW તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવી હતી.
બિન-ઉત્સેચક અને ઉત્સેચક એન્ટીઑકિસડન્ટોના મૂલ્યાંકન માટે, દરેક જૈવિક પ્રતિકૃતિમાંથી પાંદડા (ઉપરથી બીજા અને ત્રીજા સંપૂર્ણ વિકસિત પાંદડા) 72 કલાક પછી સારવાર (hpt) પર એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. દરેક જૈવિક પ્રતિકૃતિમાં પાંચ કુંડા (એક કુંડા દીઠ બે છોડ) હતા. દરેક જૈવિક નમૂનાનું ડુપ્લિકેટમાં વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું (બે તકનીકી નમૂનાઓ). બે પાંદડા પ્રવાહી નાઇટ્રોજન સાથે પીસવામાં આવ્યા હતા અને એન્ઝાઇમેટિક અને બિન-ઉત્સેચક એન્ટીઑકિસડન્ટો, કુલ એમિનો એસિડ, પ્રોલાઇન સામગ્રી, જનીન અભિવ્યક્તિ અને ઓક્સાલેટ જથ્થાના નિર્ધારણ માટે સીધા ઉપયોગમાં લેવાય છે.
કાહકોનેન એટ અલ. (૧૯૯૯) દ્વારા વર્ણવેલ પદ્ધતિમાં થોડા ફેરફાર કરીને ફોલિન-સિયોકાલ્ટેયુ રીએજન્ટ (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ, સેન્ટ લૂઇસ, MO, USA) નો ઉપયોગ કરીને કુલ દ્રાવ્ય ફિનોલિક્સ નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા. ટૂંકમાં, આશરે ૦.૧ ગ્રામ એકરૂપ પાંદડાના પેશીઓને ૨૦ મિલી ૮૦% મિથેનોલ સાથે ૨૪ કલાક માટે અંધારામાં કાઢવામાં આવ્યા હતા અને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પછી સુપરનેટન્ટ એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. નમૂનાના અર્કના ૦.૧ મિલીને ૦.૫ મિલી ફોલિન-સિયોકાલ્ટેયુ રીએજન્ટ (૧૦%) સાથે ભેળવવામાં આવ્યા હતા, ૩૦ સેકન્ડ માટે હલાવવામાં આવ્યા હતા અને ૫ મિનિટ માટે અંધારામાં છોડી દેવામાં આવ્યા હતા. પછી દરેક ટ્યુબમાં ૦.૫ મિલી ૨૦% સોડિયમ કાર્બોનેટ દ્રાવણ (Na2CO3; અલ-ગોમોરિયા ફાર્માસ્યુટિકલ્સ એન્ડ મેડિકલ સપ્લાય કંપની, કૈરો, ઇજિપ્ત) ઉમેરવામાં આવ્યું હતું, તેને સારી રીતે મિશ્રિત કરવામાં આવ્યું હતું અને ઓરડાના તાપમાને ૧ કલાક માટે અંધારામાં ઉકાળવામાં આવ્યું હતું. ઇન્ક્યુબેશન પછી, પ્રતિક્રિયા મિશ્રણનું શોષણ UV-160A સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર (શિમાડઝુ કોર્પોરેશન, જાપાન) નો ઉપયોગ કરીને 765 nm પર માપવામાં આવ્યું. નમૂનાના અર્કમાં કુલ દ્રાવ્ય ફિનોલ્સની સાંદ્રતા ગેલિક એસિડ કેલિબ્રેશન કર્વ (ફિશર સાયન્ટિફિક, હેમ્પટન, NH, યુએસએ) નો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવી હતી અને પ્રતિ ગ્રામ તાજા વજન (mg GAE g-1 તાજા વજન) ગેલિક એસિડ સમકક્ષ મિલિગ્રામ તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવી હતી.
કુલ દ્રાવ્ય ફ્લેવોનોઇડનું પ્રમાણ થોડા ફેરફારો સાથે ડીજેરીડેન એટ અલ. (2006) ની પદ્ધતિ અનુસાર નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, ઉપરોક્ત મિથેનોલ અર્કના 0.3 મિલી 5% એલ્યુમિનિયમ ક્લોરાઇડ દ્રાવણ (AlCl3; ફિશર સાયન્ટિફિક, હેમ્પટન, NH, USA) ના 0.3 મિલી સાથે ભેળવવામાં આવ્યું હતું, જોરશોરથી હલાવવામાં આવ્યું હતું અને પછી ઓરડાના તાપમાને 5 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું, ત્યારબાદ 0.3 મિલી 10% પોટેશિયમ એસિટેટ દ્રાવણ (અલ-ગોમહોરિયા ફાર્માસ્યુટિકલ્સ અને મેડિકલ સપ્લાય, કૈરો, ઇજિપ્ત) ઉમેરવામાં આવ્યું હતું, તેને સંપૂર્ણપણે મિશ્રિત કરવામાં આવ્યું હતું અને ઓરડાના તાપમાને 30 મિનિટ માટે અંધારામાં ઉકાળવામાં આવ્યું હતું. ઉષ્માવરણ પછી, પ્રતિક્રિયા મિશ્રણનું શોષણ UV-160A સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર (શિમાડઝુ કોર્પોરેશન, જાપાન) નો ઉપયોગ કરીને 430 nm પર માપવામાં આવ્યું હતું. નમૂનાના અર્કમાં કુલ દ્રાવ્ય ફ્લેવોનોઇડ્સની સાંદ્રતા રુટિન કેલિબ્રેશન કર્વ (TCI અમેરિકા, પોર્ટલેન્ડ, OR, USA) નો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવી હતી અને પછી પ્રતિ ગ્રામ તાજા વજન (mg RE g-1 તાજા વજન) ના મિલિગ્રામ રુટિન સમકક્ષ તરીકે દર્શાવવામાં આવી હતી.
યોકોયામા અને હિરામાત્સુ (2003) દ્વારા પ્રસ્તાવિત અને સન એટ અલ. (2006) દ્વારા સંશોધિત પદ્ધતિના આધારે બીન પાંદડાઓમાં કુલ મુક્ત એમિનો એસિડનું પ્રમાણ સંશોધિત નિનહાઇડ્રિન રીએજન્ટ (થર્મો સાયન્ટિફિક કેમિકલ્સ, વોલ્થમ, એમએ, યુએસએ) નો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, 0.1 ગ્રામ ગ્રાઉન્ડ ટીશ્યુ pH 5.4 બફર સાથે કાઢવામાં આવ્યું હતું, અને સુપરનેટન્ટના 200 μL ને 200 μL નિનહાઇડ્રિન (2%) અને 200 μL પાયરિડિન (10%; સ્પેક્ટ્રમ કેમિકલ, ન્યૂ બ્રુન્સવિક, એનજે, યુએસએ) સાથે પ્રતિક્રિયા આપવામાં આવી હતી, 30 મિનિટ માટે ઉકળતા પાણીના સ્નાનમાં ઉકાળવામાં આવ્યું હતું, પછી ઠંડુ કરવામાં આવ્યું હતું અને UV-160A સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર (શિમાડઝુ કોર્પોરેશન, જાપાન) નો ઉપયોગ કરીને 580 nm પર માપવામાં આવ્યું હતું. બીજી બાજુ, બેટ્સ પદ્ધતિ (બેટ્સ એટ અલ., 1973) દ્વારા પ્રોલાઇન નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું. પ્રોલાઇનને 3% સલ્ફોસાલિસિલિક એસિડ (થર્મો સાયન્ટિફિક કેમિકલ્સ, વોલ્થમ, MA, USA) સાથે કાઢવામાં આવ્યું હતું અને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પછી, 0.5 મિલી સુપરનેટન્ટને 1 મિલી ગ્લેશિયલ એસિટિક એસિડ (ફિશર સાયન્ટિફિક, હેમ્પટન, NH, USA) અને નિનહાઇડ્રિન રીએજન્ટ સાથે ભેળવવામાં આવ્યું હતું, 90°C પર 45 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું, ઠંડુ કરવામાં આવ્યું હતું અને ઉપરોક્ત સમાન સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટરનો ઉપયોગ કરીને 520 nm પર માપવામાં આવ્યું હતું. પાંદડાના અર્કમાં કુલ મુક્ત એમિનો એસિડ અને પ્રોલાઇન અનુક્રમે ગ્લાયસીન અને પ્રોલાઇન કેલિબ્રેશન કર્વ્સ (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ, સેન્ટ લૂઇસ, MO, USA) નો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા, અને mg/g તાજા વજન તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યા હતા.
એન્ટીઑકિસડન્ટ ઉત્સેચકોની ઉત્સેચક પ્રવૃત્તિ નક્કી કરવા માટે, આશરે 500 મિલિગ્રામ હોમોજનાઇઝ્ડ પેશી 3 મિલી 50 મિલીમીટર ટ્રિસ બફર (pH 7.8) સાથે કાઢવામાં આવી હતી જેમાં 1 મિલીમીટર EDTA-Na2 (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ, સેન્ટ લૂઇસ, MO, USA) અને 7.5% પોલીવિનાઇલપાયરોલિડોન (PVP; સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ, સેન્ટ લૂઇસ, MO, USA) હતું, રેફ્રિજરેશન (4 °C) હેઠળ 20 મિનિટ માટે 10,000 × g પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું, અને સુપરનેટન્ટ (ક્રૂડ એન્ઝાઇમ અર્ક) એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું (એલ-નાગર એટ અલ., 2023; ઓસ્માન એટ અલ., 2023). ત્યારબાદ કેટાલેઝ (CAT) ને 0.1 M સોડિયમ ફોસ્ફેટ બફર (pH 6.5; સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ, સેન્ટ લૂઇસ, MO, USA) ના 2 મિલી અને 269 mM H2O2 દ્રાવણના 100 μl સાથે પ્રતિક્રિયા આપવામાં આવી જેથી તેની ઉત્સેચક પ્રવૃત્તિ Aebi (1984) ની પદ્ધતિ અનુસાર થોડા ફેરફારો સાથે નક્કી કરી શકાય (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Harrach et al. (2009) ની પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને Guaiacol-dependent peroxidase (POX) ઉત્સેચક પ્રવૃત્તિ નક્કી કરવામાં આવી. (2008) નાના ફેરફારો સાથે (એલ-નાગર એટ અલ., 2023; ઓસ્માન એટ અલ., 2023) અને પોલિફેનોલ ઓક્સિડેઝ (PPO) ની એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિ 100 mM સોડિયમ ફોસ્ફેટ બફર (pH 6.0) ના 2.2 મિલી, ગુઆયાકોલ (TCI રસાયણો, પોર્ટલેન્ડ, OR, USA) ના 100 μl અને 12 mM H2O2 ના 100 μl સાથે પ્રતિક્રિયા પછી નક્કી કરવામાં આવી હતી. પદ્ધતિમાં થોડો ફેરફાર (એલ-નાગર એટ અલ., 2023; ઓસ્માન એટ અલ., 2023) થી કરવામાં આવ્યો હતો. 0.1 M ફોસ્ફેટ બફર (pH 6.0) માં તાજી રીતે તૈયાર કરાયેલા 3 મિલી કેટેકોલ દ્રાવણ (થર્મો સાયન્ટિફિક કેમિકલ્સ, વોલ્થમ, MA, USA) (0.01 M) સાથે પ્રતિક્રિયા પછી પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું. CAT પ્રવૃત્તિ 240 nm (A240) પર H2O2 ના વિઘટનનું નિરીક્ષણ કરીને માપવામાં આવી હતી, POX પ્રવૃત્તિ 436 nm (A436) પર શોષણમાં વધારાનું નિરીક્ષણ કરીને માપવામાં આવી હતી, અને PPO પ્રવૃત્તિ UV-160A સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર (શિમાડઝુ, જાપાન) નો ઉપયોગ કરીને દર 30 સેકન્ડે 495 nm (A495) પર શોષણ વધઘટ રેકોર્ડ કરીને માપવામાં આવી હતી.
છેલ્લી સારવાર પછી 72 કલાક પછી બીન પાંદડા (ઉપરથી બીજા અને ત્રીજા સંપૂર્ણ વિકસિત પાંદડા) માં પેરોક્સિસોમલ કેટાલેઝ (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), સુપરઓક્સાઇડ ડિસમ્યુટેઝ (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), અને ગ્લુટાથિઓન રીડક્ટેઝ (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1) સહિત ત્રણ એન્ટીઑકિસડન્ટ-સંબંધિત જનીનોના ટ્રાન્સક્રિપ્ટ સ્તરને શોધવા માટે રીઅલ-ટાઇમ RT-PCR નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. ટૂંકમાં, ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ અનુસાર સિમ્પલી પી ટોટલ RNA એક્સટ્રેક્શન કીટ (કેટ. નં. BSC52S1; બાયોફ્લક્સ, બાયોરી ટેકનોલોજી, ચીન) નો ઉપયોગ કરીને RNA ને અલગ કરવામાં આવ્યું હતું. પછી, ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર TOP script™ cDNA સિન્થેસિસ કીટનો ઉપયોગ કરીને cDNA ને સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ઉપરોક્ત ત્રણ જનીનોના પ્રાઈમર સિક્વન્સ પૂરક કોષ્ટક S3 માં સૂચિબદ્ધ છે. PvActin-3 (GenBank એક્સેસિયન નંબર: XM_068616709.1) નો ઉપયોગ હાઉસકીપિંગ જનીન તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો અને 2-ΔΔCT પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને સંબંધિત જનીન અભિવ્યક્તિની ગણતરી કરવામાં આવી હતી (લિવાક અને શ્મિટજેન, 2001). જૈવિક તાણ (સામાન્ય કઠોળ અને એન્થ્રેકનોઝ ફૂગ કોલેટોટ્રિચમ લિન્ડેમુથિયનમ વચ્ચે અસંગત ક્રિયાપ્રતિક્રિયા) અને અજૈવિક તાણ (દુષ્કાળ, ખારાશ, નીચા તાપમાન) હેઠળ એક્ટિન સ્થિરતા દર્શાવવામાં આવી હતી (બોર્જેસ એટ અલ., 2012).
અમે શરૂઆતમાં પ્રોટીન-પ્રોટીન BLAST ટૂલ (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) નો ઉપયોગ કરીને S. sclerotiorum માં oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) પ્રોટીનનું સિલિકો વિશ્લેષણ કર્યું. ટૂંકમાં, અમે S. sclerotiorum (taxide: 5180) માં હોમોલોગસ પ્રોટીનને મેપ કરવા માટે ક્વેરી સિક્વન્સ તરીકે Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; ટેક્સાઇડ: 1191702; GenBank એક્સેસિયન નંબર XP_040799428.1; 342 એમિનો એસિડ) અને Penicillium lagena (PlOAH; ટેક્સાઇડ: 94218; GenBank એક્સેસિયન નંબર XP_056833920.1; 316 એમિનો એસિડ) માંથી OAH નો ઉપયોગ કર્યો. નેશનલ સેન્ટર ફોર બાયોટેકનોલોજી ઇન્ફર્મેશન (NCBI) વેબસાઇટ, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ પર GenBank માં તાજેતરમાં ઉપલબ્ધ S. sclerotiorum જીનોમ ડેટા સામે BLASTp કરવામાં આવ્યું હતું.
વધુમાં, S. sclerotiorum (SsOAH) માંથી અનુમાનિત OAH જનીન અને A. fijiensis CBS 313.89 અને P. lagena માંથી PlOAH ના ઉત્ક્રાંતિ વિશ્લેષણ અને ફાયલોજેનેટિક વૃક્ષનું અનુમાન MEGA11 (Tamura et al., 2021) અને JTT મેટ્રિક્સ-આધારિત મોડેલ (Jones et al., 1992) માં મહત્તમ સંભાવના પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. ફાયલોજેનેટિક વૃક્ષને S. sclerotiorum માંથી બધા અનુમાનિત OAH જનીનો (SsOAH) ના પ્રોટીન સિક્વન્સના બહુવિધ સંરેખણ વિશ્લેષણ અને અવરોધ-આધારિત સંરેખણ સાધન (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007) નો ઉપયોગ કરીને ક્વેરી સિક્વન્સ સાથે જોડવામાં આવ્યું હતું. વધુમાં, S. sclerotiorum માંથી SsOAH ના શ્રેષ્ઠ મેળ ખાતા એમિનો એસિડ સિક્વન્સને ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) નો ઉપયોગ કરીને ક્વેરી સિક્વન્સ (AfOAH અને PlOAH) (Larkin et al., 2007) સાથે ગોઠવવામાં આવ્યા હતા, અને ગોઠવણીમાં સંરક્ષિત પ્રદેશોને ESPript ટૂલ (સંસ્કરણ 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) નો ઉપયોગ કરીને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવ્યા હતા.
વધુમાં, S. sclerotiorum SsOAH ના અનુમાનિત કાર્યાત્મક પ્રતિનિધિ ડોમેન્સ અને સંરક્ષિત સ્થળોને InterPro ટૂલ (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021) નો ઉપયોગ કરીને વિવિધ પરિવારોમાં ઇન્ટરેક્ટિવ રીતે વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યા હતા. અંતે, પ્રોટીન હોમોલોજી/એનાલોજી રેકગ્નિશન એન્જિન (Phyre2 સર્વર સંસ્કરણ 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) નો ઉપયોગ કરીને અનુમાનિત S. sclerotiorum SsOAH નું ત્રિ-પરિમાણીય (3D) માળખું મોડેલિંગ કરવામાં આવ્યું હતું અને SWISS-MODEL સર્વર (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014) નો ઉપયોગ કરીને માન્ય કરવામાં આવ્યું હતું. અનુમાનિત ત્રિ-પરિમાણીય રચનાઓ (PDB ફોર્મેટ) ને UCSF-Chimera પેકેજ (સંસ્કરણ 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004) નો ઉપયોગ કરીને ઇન્ટરેક્ટિવલી વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવી હતી.
સ્ક્લેરોટીનિયા સ્ક્લેરોટીઓરમના માયસેલિયામાં ઓક્સાલોએસેટેટ એસિટિલહાઇડ્રોલેઝ (SsOAH; GenBank એક્સેસિયન નંબર: XM_001590428.1) ના ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ સ્તરને નક્કી કરવા માટે જથ્થાત્મક રીઅલ-ટાઇમ ફ્લોરોસેન્સ PCR નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. ટૂંકમાં, S. સ્ક્લેરોટીઓરમને PDB ધરાવતા ફ્લાસ્કમાં ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવ્યું હતું અને ધ્રુજારી ઇન્ક્યુબેટર (મોડેલ: I2400, ન્યૂ બ્રુન્સવિક સાયન્ટિફિક કંપની, એડિસન, NJ, USA) માં 25 ± 2 °C પર 150 rpm પર 24 કલાક માટે અને સતત અંધારામાં (24 કલાક) મૂકવામાં આવ્યું હતું જેથી માયસેલિયાના વિકાસને ઉત્તેજીત કરી શકાય. ત્યારબાદ, કોષોને L-ઓર્નિથિન અને ફૂગનાશક રિઝોલેક્સ-ટી સાથે અંતિમ IC50 સાંદ્રતા (અનુક્રમે આશરે 40 અને 3.2 mg/L) પર સારવાર આપવામાં આવી હતી અને પછી તે જ પરિસ્થિતિઓમાં બીજા 24 કલાક માટે કલ્ચર કરવામાં આવ્યા હતા. ઇન્ક્યુબેશન પછી, કલ્ચર્સને 5 મિનિટ માટે 2500 rpm પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા અને જનીન અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ માટે સુપરનેટન્ટ (ફંગલ માયસેલિયમ) એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. તેવી જ રીતે, ચેપગ્રસ્ત છોડમાંથી ચેપ પછી 0, 24, 48, 72, 96 અને 120 કલાક પર ફંગલ માયસેલિયમ એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું જેમણે ચેપગ્રસ્ત પેશીઓની સપાટી પર સફેદ ઘાટ અને કપાસ માયસેલિયમ બનાવ્યું હતું. ફંગલ માયસેલિયમમાંથી RNA કાઢવામાં આવ્યું હતું અને પછી ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ cDNA સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. SsOAH માટે પ્રાઈમર સિક્વન્સ પૂરક કોષ્ટક S3 માં સૂચિબદ્ધ છે. SsActin (GenBank એક્સેસિયન નંબર: XM_001589919.1) નો ઉપયોગ હાઉસકીપિંગ જનીન તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો, અને સંબંધિત જનીન અભિવ્યક્તિની ગણતરી 2-ΔΔΔCT પદ્ધતિ (Livak and Schmittgen, 2001) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી.
બટાકાના ડેક્સ્ટ્રોઝ બ્રોથ (PDB) અને ફૂગના રોગકારક સ્ક્લેરોટીનિયા સ્ક્લેરોટીઓરમ ધરાવતા છોડના નમૂનાઓમાં થોડા ફેરફારો સાથે ઓક્સાલિક એસિડ નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, S. સ્ક્લેરોટીઓરમ આઇસોલેટ્સને PDB ધરાવતા ફ્લાસ્કમાં ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવ્યા હતા અને પછી ધ્રુજારી ઇન્ક્યુબેટર (મોડેલ I2400, ન્યૂ બ્રુન્સવિક સાયન્ટિફિક કંપની, એડિસન, NJ, USA) માં 150 rpm પર 25 ± 2 °C પર 3-5 દિવસ માટે સતત અંધારામાં (24 કલાક) માયસેલિયલ વૃદ્ધિને ઉત્તેજીત કરવા માટે કલ્ચર કરવામાં આવ્યું હતું. ઇન્ક્યુબેશન પછી, ફૂગના કલ્ચરને પહેલા વોટમેન #1 ફિલ્ટર પેપર દ્વારા ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યું હતું અને પછી શેષ માયસેલિયમ દૂર કરવા માટે 5 મિનિટ માટે 2500 rpm પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું. ઓક્સાલેટના વધુ જથ્થાત્મક નિર્ધારણ માટે સુપરનેટન્ટને 4°C પર એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું અને સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું હતું. છોડના નમૂનાઓ તૈયાર કરવા માટે, લગભગ 0.1 ગ્રામ છોડના પેશીઓના ટુકડાઓ નિસ્યંદિત પાણી (દર વખતે 2 મિલી) સાથે ત્રણ વખત કાઢવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ નમૂનાઓને 5 મિનિટ માટે 2500 rpm પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા, સુપરનેટન્ટને વોટમેન નંબર 1 ફિલ્ટર પેપર દ્વારા ડ્રાય ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યું અને વધુ વિશ્લેષણ માટે એકત્રિત કરવામાં આવ્યું.
ઓક્સાલિક એસિડના જથ્થાત્મક વિશ્લેષણ માટે, પ્રતિક્રિયા મિશ્રણ કાચની સ્ટોપર્ડ ટ્યુબમાં નીચેના ક્રમમાં તૈયાર કરવામાં આવ્યું હતું: 0.2 મિલી નમૂના (અથવા PDB કલ્ચર ફિલ્ટ્રેટ અથવા ઓક્સાલિક એસિડ સ્ટાન્ડર્ડ સોલ્યુશન), 0.11 મિલી બ્રોમોફેનોલ બ્લુ (BPB, 1 mM; ફિશર કેમિકલ, પિટ્સબર્ગ, PA, USA), 0.198 મિલી 1 M સલ્ફ્યુરિક એસિડ (H2SO4; અલ-ગોમહોરિયા ફાર્માસ્યુટિકલ્સ અને મેડિકલ સપ્લાય, કૈરો, ઇજિપ્ત) અને 0.176 મિલી 100 mM પોટેશિયમ ડાયક્રોમેટ (K2Cr2O7; TCI કેમિકલ્સ, પોર્ટલેન્ડ, OR, USA), અને પછી દ્રાવણને નિસ્યંદિત પાણી સાથે 4.8 મિલી સુધી પાતળું કરવામાં આવ્યું, જોરશોરથી મિશ્રિત કરવામાં આવ્યું અને તરત જ 60 °C પાણીના સ્નાનમાં મૂકવામાં આવ્યું. 10 મિનિટ પછી, 0.5 મિલી સોડિયમ હાઇડ્રોક્સાઇડ દ્રાવણ (NaOH; 0.75 M) ઉમેરીને પ્રતિક્રિયા બંધ કરવામાં આવી. પ્રતિક્રિયા મિશ્રણનું શોષણ (A600) UV-160 સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર (શિમાડઝુ કોર્પોરેશન, જાપાન) નો ઉપયોગ કરીને 600 nm પર માપવામાં આવ્યું હતું. કલ્ચર ફિલ્ટરેટ અને છોડના નમૂનાઓના જથ્થાત્મકકરણ માટે અનુક્રમે PDB અને નિસ્યંદિત પાણીનો ઉપયોગ નિયંત્રણો તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. કલ્ચર ફિલ્ટરેટમાં ઓક્સાલિક એસિડ સાંદ્રતા, PDB માધ્યમ (μg.mL−1) ના મિલીલીટર દીઠ માઇક્રોગ્રામ ઓક્સાલિક એસિડ તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવી હતી, અને પાંદડાના અર્કમાં, તાજા વજનના ગ્રામ (μg.g−1 FW) દીઠ માઇક્રોગ્રામ ઓક્સાલિક એસિડ તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવી હતી, તે ઓક્સાલિક એસિડ કેલિબ્રેશન કર્વ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક કેમિકલ્સ, વોલ્થમ, MA, USA) નો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવી હતી.
સમગ્ર અભ્યાસ દરમિયાન, બધા પ્રયોગો સંપૂર્ણપણે રેન્ડમાઇઝ્ડ ડિઝાઇન (CRD) માં ડિઝાઇન કરવામાં આવ્યા હતા જેમાં દરેક સારવાર દીઠ છ જૈવિક પ્રતિકૃતિઓ અને દરેક જૈવિક પ્રતિકૃતિ દીઠ પાંચ કુંડા (દરેક કુંડા દીઠ બે છોડ) હતા, સિવાય કે અન્યથા જણાવવામાં આવ્યું હોય. જૈવિક પ્રતિકૃતિઓનું ડુપ્લિકેટ (બે તકનીકી પ્રતિકૃતિઓ) માં વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. સમાન પ્રયોગની પ્રજનનક્ષમતા ચકાસવા માટે તકનીકી પ્રતિકૃતિઓનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો પરંતુ નકલી પ્રતિકૃતિઓ ટાળવા માટે આંકડાકીય વિશ્લેષણમાં તેનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો ન હતો. ડેટાનું આંકડાકીય વિશ્લેષણ ભિન્નતાના વિશ્લેષણ (ANOVA) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ ટુકી-ક્રેમર પ્રામાણિકપણે નોંધપાત્ર તફાવત (HSD) પરીક્ષણ (p ≤ 0.05) કરવામાં આવ્યું હતું. ઇન વિટ્રો પ્રયોગો માટે, IC50 અને IC99 મૂલ્યોની ગણતરી પ્રોબિટ મોડેલનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી અને 95% વિશ્વાસ અંતરાલોની ગણતરી કરવામાં આવી હતી.
ઇજિપ્તના અલ ગાબિયા ગવર્નરેટમાં વિવિધ સોયાબીન ખેતરોમાંથી કુલ ચાર આઇસોલેટ એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. પીડીએ માધ્યમ પર, બધા આઇસોલેટ્સે ક્રીમી સફેદ માયસેલિયમ ઉત્પન્ન કર્યું જે ઝડપથી કપાસ જેવું સફેદ થઈ ગયું (આકૃતિ 1A) અને પછી સ્ક્લેરોટિયમ તબક્કામાં બેજ અથવા ભૂરા રંગનું. સ્ક્લેરોટિયા સામાન્ય રીતે ગાઢ, કાળા, ગોળાકાર અથવા અનિયમિત આકારના હોય છે, 5.2 થી 7.7 મીમી લાંબા અને 3.4 થી 5.3 મીમી વ્યાસ (આકૃતિ 1B). જોકે ચાર આઇસોલેટ્સે 25 ± 2 °C (આકૃતિ 1A) પર 10-12 દિવસના ઇન્ક્યુબેશન પછી કલ્ચર માધ્યમની ધાર પર સ્ક્લેરોટિયાની સીમાંત પેટર્ન વિકસાવી હતી, તેમ છતાં પ્લેટ દીઠ સ્ક્લેરોટિયાની સંખ્યા તેમની વચ્ચે નોંધપાત્ર રીતે અલગ હતી (P < 0.001), આઇસોલેટ 3 માં સ્ક્લેરોટિયાની સૌથી વધુ સંખ્યા હતી (પ્લેટ દીઠ 32.33 ± 1.53 સ્ક્લેરોટિયા; આકૃતિ 1C). તેવી જ રીતે, આઇસોલેટ #3 એ અન્ય આઇસોલેટ્સ (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; આકૃતિ 1D) કરતાં PDB માં વધુ ઓક્સાલિક એસિડ ઉત્પન્ન કર્યું. આઇસોલેટ #3 એ ફાયટોપેથોજેનિક ફૂગ સ્ક્લેરોટીનિયા સ્ક્લેરોટીઓરમની લાક્ષણિક મોર્ફોલોજિકલ અને માઇક્રોસ્કોપિક લાક્ષણિકતાઓ દર્શાવી. ઉદાહરણ તરીકે, PDA પર, આઇસોલેટ #3 ની વસાહતો ઝડપથી વિકસતી હતી, ક્રીમી સફેદ (આકૃતિ 1A), વિપરીત બેજ અથવા આછા સૅલ્મોન પીળા-ભુરા રંગની હતી, અને 9 સેમી વ્યાસની પ્લેટની સપાટીને સંપૂર્ણપણે આવરી લેવા માટે 25 ± 2°C પર 6-7 દિવસની જરૂર હતી. ઉપરોક્ત મોર્ફોલોજિકલ અને માઇક્રોસ્કોપિક લાક્ષણિકતાઓના આધારે, આઇસોલેટ #3 ને સ્ક્લેરોટીનિયા સ્ક્લેરોટીઓરમ તરીકે ઓળખવામાં આવ્યું હતું.
આકૃતિ 1. સામાન્ય કઠોળના પાકમાંથી S. સ્ક્લેરોટીઓરમ આઇસોલેટ્સની લાક્ષણિકતાઓ અને રોગકારકતા. (A) PDA માધ્યમ પર ચાર S. સ્ક્લેરોટીઓરમ આઇસોલેટ્સની માયસેલિયલ વૃદ્ધિ, (B) ચાર S. સ્ક્લેરોટીઓરમ આઇસોલેટ્સની સ્ક્લેરોટીયા, (C) સ્ક્લેરોટીયાની સંખ્યા (પ્રતિ પ્લેટ), (D) PDB માધ્યમ પર ઓક્સાલિક એસિડ સ્ત્રાવ (μg.mL−1), અને (E) ગ્રીનહાઉસ પરિસ્થિતિઓ હેઠળ સંવેદનશીલ વાણિજ્યિક કઠોળના કલ્ટીવાર ગીઝા 3 પર ચાર S. સ્ક્લેરોટીઓરમ આઇસોલેટ્સની રોગની તીવ્રતા (%). મૂલ્યો પાંચ જૈવિક પ્રતિકૃતિઓના સરેરાશ ± SD (n = 5) દર્શાવે છે. વિવિધ અક્ષરો સારવાર વચ્ચે આંકડાકીય રીતે નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે (p < 0.05). (F–H) આઇસોલેટ #3 (dpi) સાથે ઇનોક્યુલેશન પછી 10 દિવસ પછી, જમીનની ઉપરની દાંડી અને સિલિક પર લાક્ષણિક સફેદ ફૂગના લક્ષણો દેખાયા. (I) S. sclerotiorum isolate #3 ના આંતરિક ટ્રાન્સક્રિપ્ટેડ સ્પેસર (ITS) ક્ષેત્રનું ઉત્ક્રાંતિ વિશ્લેષણ મહત્તમ સંભાવના પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું અને નેશનલ સેન્ટર ફોર બાયોટેકનોલોજી ઇન્ફર્મેશન (NCBI) ડેટાબેઝ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) માંથી મેળવેલા 20 સંદર્ભ આઇસોલેટ્સ/સ્ટ્રેન્સ સાથે સરખામણી કરવામાં આવી હતી. ક્લસ્ટરિંગ લાઇનની ઉપરની સંખ્યાઓ પ્રદેશ કવરેજ (%) દર્શાવે છે, અને ક્લસ્ટરિંગ લાઇનની નીચેની સંખ્યાઓ શાખાની લંબાઈ દર્શાવે છે.
વધુમાં, રોગકારકતાની પુષ્ટિ કરવા માટે, ગ્રીનહાઉસ પરિસ્થિતિઓમાં સંવેદનશીલ વ્યાપારી બીન કલ્ટીવાર ગીઝા 3 ને ઇનોક્યુલેટ કરવા માટે ચાર મેળવેલા S. સ્ક્લેરોટીઓરમ આઇસોલેટનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, જે કોચના સિદ્ધાંતો (આકૃતિ 1E) સાથે સુસંગત છે. જોકે મેળવેલા બધા ફંગલ આઇસોલેટ રોગકારક હતા અને લીલા બીન (cv. ગીઝા 3) ને ચેપ લગાવી શકતા હતા, જેના કારણે જમીનના ઉપરના બધા ભાગો (આકૃતિ 1F), ખાસ કરીને દાંડી (આકૃતિ 1G) અને શીંગો (આકૃતિ 1H) પર 10 દિવસ પછી ઇનોક્યુલેશન (dpi) પર લાક્ષણિક સફેદ ફૂગના લક્ષણો જોવા મળ્યા, બે સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાં આઇસોલેટ 3 સૌથી આક્રમક આઇસોલેટ હતું. આઇસોલેટ 3 માં બીન છોડ પર સૌથી વધુ રોગની તીવ્રતા (%) હતી (અનુક્રમે 7, 14 અને 21 દિવસ પછી ચેપ; આકૃતિ 1F).
સૌથી વધુ આક્રમક S. સ્ક્લેરોટીઓરમ આઇસોલેટ #3 ની ઓળખ આંતરિક ટ્રાન્સક્રિપ્ટેડ સ્પેસર (ITS) સિક્વન્સિંગ (આકૃતિ 1I) ના આધારે વધુ પુષ્ટિ મળી હતી. આઇસોલેટ #3 અને 20 સંદર્ભ આઇસોલેટ્સ/સ્ટ્રેન્સ વચ્ચેના ફાયલોજેનેટિક વિશ્લેષણમાં તેમની વચ્ચે ઉચ્ચ સમાનતા (>99%) જોવા મળી. એ નોંધવું યોગ્ય છે કે S. સ્ક્લેરોટીઓરમ આઇસોલેટ #3 (533 bp) સૂકા વટાણાના બીજમાંથી અલગ કરાયેલા અમેરિકન S. સ્ક્લેરોટીઓરમ આઇસોલેટ LPM36 (GenBank એક્સેસિયન નંબર MK896659.1; 540 bp) અને ચાઇનીઝ S. સ્ક્લેરોટીઓરમ આઇસોલેટ YKY211 (GenBank એક્સેસિયન નંબર OR206374.1; 548 bp) સાથે ઉચ્ચ સમાનતા ધરાવે છે, જે વાયોલેટ (મેથિઓલા ઇન્કાના) સ્ટેમ રોટનું કારણ બને છે, જે બધા ડેંડ્રોગ્રામ (આકૃતિ 1I) ની ટોચ પર અલગથી જૂથબદ્ધ છે. આ નવો ક્રમ NCBI ડેટાબેઝમાં જમા કરવામાં આવ્યો છે અને તેને "Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25" (GenBank એક્સેસિયન નંબર PV202792) નામ આપવામાં આવ્યું છે. તે જોઈ શકાય છે કે isolate 3 સૌથી આક્રમક isolate છે; તેથી, આ isolate ને પછીના બધા પ્રયોગોમાં અભ્યાસ માટે પસંદ કરવામાં આવ્યો હતો.
S. sclerotiorum isolate 3 સામે વિવિધ સાંદ્રતા (12.5, 25, 50, 75, 100 અને 125 mg/L) પર ડાયમાઇન L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) ની એન્ટિબેક્ટેરિયલ પ્રવૃત્તિની તપાસ ઇન વિટ્રોમાં કરવામાં આવી હતી. એ નોંધનીય છે કે L-ornithine એ એન્ટિબેક્ટેરિયલ અસર દર્શાવી હતી અને ધીમે ધીમે S. sclerotiorum hyphae ના રેડિયલ વૃદ્ધિને ડોઝ-આધારિત રીતે અટકાવી હતી (આકૃતિ 2A, B). પરીક્ષણ કરાયેલ સૌથી વધુ સાંદ્રતા (125 mg/L) પર, L-ornithine એ સૌથી વધુ માયસેલિયલ વૃદ્ધિ અવરોધ દર (99.62 ± 0.27%; આકૃતિ 2B) દર્શાવ્યો હતો, જે સૌથી વધુ સાંદ્રતા (10 mg/L) પર વ્યાપારી ફૂગનાશક Rizolex-T (નિરોધ દર 99.45 ± 0.39%; આકૃતિ 2C) ની સમકક્ષ હતો, જે સમાન અસરકારકતા દર્શાવે છે.
આકૃતિ 2. સ્ક્લેરોટીનિયા સ્ક્લેરોટીઓરમ સામે L-ઓર્નિથિનની ઇન વિટ્રો એન્ટિબેક્ટેરિયલ પ્રવૃત્તિ. (A) S. સ્ક્લેરોટીઓરમ સામે L-ઓર્નિથિનની વિવિધ સાંદ્રતાની એન્ટિબેક્ટેરિયલ પ્રવૃત્તિની વ્યાપારી ફૂગનાશક રિઝોલેક્સ-ટી (10 મિલિગ્રામ/લિટર) સાથે સરખામણી. (B, C) અનુક્રમે L-ઓર્નિથિન (12.5, 25, 50, 75, 100 અને 125 મિલિગ્રામ/લિટર) અથવા રિઝોલેક્સ-ટી (2, 4, 6, 8 અને 10 મિલિગ્રામ/લિટર) ની વિવિધ સાંદ્રતા સાથે સારવાર પછી S. સ્ક્લેરોટીઓરમ માયસેલિયલ વૃદ્ધિનો અવરોધ દર (%). મૂલ્યો પાંચ જૈવિક પ્રતિકૃતિઓના સરેરાશ ± SD (n = 5) દર્શાવે છે. વિવિધ અક્ષરો સારવાર વચ્ચે આંકડાકીય તફાવત દર્શાવે છે (p < 0.05). (D, E) અનુક્રમે L-ઓર્નિથિન અને વ્યાપારી ફૂગનાશક રિઝોલેક્સ-ટીનું પ્રોબિટ મોડેલ રીગ્રેશન વિશ્લેષણ. પ્રોબિટ મોડેલ રીગ્રેશન લાઇન એક ઘન વાદળી રેખા તરીકે બતાવવામાં આવી છે, અને આત્મવિશ્વાસ અંતરાલ (95%) એક ડેશેડ લાલ રેખા તરીકે બતાવવામાં આવ્યો છે.
વધુમાં, પ્રોબિટ રીગ્રેશન વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું અને અનુરૂપ પ્લોટ કોષ્ટક 1 અને આકૃતિ 2D,E માં દર્શાવવામાં આવ્યા છે. ટૂંકમાં, L-ઓર્નિથિનના સ્વીકાર્ય ઢાળ મૂલ્ય (y = 2.92x − 4.67) અને સંકળાયેલ નોંધપાત્ર આંકડા (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 અને p < 0.0001; આકૃતિ 2D) એ વાણિજ્યિક ફૂગનાશક Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 અને p < 0.0001) (કોષ્ટક 1) ની તુલનામાં S. sclerotiorum સામે વધેલી એન્ટિફંગલ પ્રવૃત્તિ દર્શાવી.
કોષ્ટક 1. એસ. સ્ક્લેરોટીઓરમ સામે L-ઓર્નિથિન અને વ્યાપારી ફૂગનાશક "રિઝોલેક્સ-ટી" ના અડધા-મહત્તમ અવરોધક સાંદ્રતા (IC50) અને IC99 (mg/l) ના મૂલ્યો.
એકંદરે, સારવાર ન કરાયેલ S. sclerotiorum-સંક્રમિત છોડની તુલનામાં સારવાર કરાયેલ સામાન્ય બીન છોડ પર સફેદ ફૂગના વિકાસ અને તીવ્રતામાં L-ornithine (250 mg/L) નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડો કર્યો (નિયંત્રણ; આકૃતિ 3A). ટૂંકમાં, સારવાર ન કરાયેલ ચેપગ્રસ્ત નિયંત્રણ છોડની રોગની તીવ્રતા ધીમે ધીમે વધી (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, અને 92.33 ± 3.06%), L-ornithine એ સમગ્ર પ્રયોગ દરમિયાન (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, અને 26.36 ± 3.07) અનુક્રમે 7, 14 અને 21 દિવસ પછી (dpt) રોગની તીવ્રતા (%) નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડી (આકૃતિ 3A). એ જ રીતે, જ્યારે S. sclerotiorum-સંક્રમિત બીન છોડને 250 mg/L L-ornithine થી સારવાર આપવામાં આવી, ત્યારે રોગ પ્રગતિ વળાંક (AUDPC) હેઠળનો વિસ્તાર સારવાર ન કરાયેલ નિયંત્રણમાં 1274.33 ± 33.13 થી ઘટીને 281.03 ± 7.95 થયો, જે હકારાત્મક નિયંત્રણ 50 mg/L Rizolex-T ફૂગનાશક (183.61 ± 7.71; આકૃતિ 3B) કરતા થોડો ઓછો હતો. બીજા પ્રયોગમાં પણ આ જ વલણ જોવા મળ્યું.
આકૃતિ 3. ગ્રીનહાઉસ પરિસ્થિતિઓમાં સ્ક્લેરોટીનિયા સ્ક્લેરોટીઓરમ દ્વારા થતા સામાન્ય બીનના સફેદ સડાના વિકાસ પર L-ઓર્નિથિનનો બાહ્ય ઉપયોગનો પ્રભાવ. (A) 250 mg/L L-ઓર્નિથિન સાથે સારવાર પછી સામાન્ય બીનના સફેદ ફૂગનો રોગ પ્રગતિ વળાંક. (B) L-ઓર્નિથિન સાથે સારવાર પછી સામાન્ય બીનના સફેદ ફૂગના રોગ પ્રગતિ વળાંક (AUDPC) હેઠળનો વિસ્તાર. મૂલ્યો પાંચ જૈવિક પ્રતિકૃતિઓના સરેરાશ ± SD (n = 5) દર્શાવે છે. વિવિધ અક્ષરો સારવાર વચ્ચે આંકડાકીય રીતે નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે (p < 0.05).
250 મિલિગ્રામ/લિટર એલ-ઓર્નિથિનનો બાહ્ય ઉપયોગ ધીમે ધીમે છોડની ઊંચાઈ (આકૃતિ 4A), છોડ દીઠ શાખાઓની સંખ્યા (આકૃતિ 4B) અને છોડ દીઠ પાંદડાઓની સંખ્યા (આકૃતિ 4C) 42 દિવસ પછી વધ્યો. જ્યારે વ્યાપારી ફૂગનાશક રિઝોલેક્સ-ટી (50 મિલિગ્રામ/લિટર) અભ્યાસ કરાયેલા તમામ પોષણ પરિમાણો પર સૌથી વધુ અસર કરતી હતી, ત્યારે 250 મિલિગ્રામ/લિટર એલ-ઓર્નિથિનનો બાહ્ય ઉપયોગ સારવાર ન કરાયેલ નિયંત્રણોની તુલનામાં બીજી સૌથી મોટી અસર કરતો હતો (આકૃતિ 4A–C). બીજી બાજુ, L-ઓર્નિથિન સારવારથી પ્રકાશસંશ્લેષણ રંગદ્રવ્યો ક્લોરોફિલ a (આકૃતિ 4D) અને ક્લોરોફિલ b (આકૃતિ 4E) ની સામગ્રી પર કોઈ નોંધપાત્ર અસર પડી ન હતી, પરંતુ નકારાત્મક નિયંત્રણ (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) અને હકારાત્મક નિયંત્રણ (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; આકૃતિ 4F) ની તુલનામાં કુલ કેરોટીનોઇડ સામગ્રી (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) માં થોડો વધારો થયો. એકંદરે, આ પરિણામો સૂચવે છે કે L-ઓર્નિથિન સારવાર કરાયેલ કઠોળ માટે ફાયટોટોક્સિક નથી અને તેમની વૃદ્ધિને ઉત્તેજીત પણ કરી શકે છે.
આકૃતિ 4. ગ્રીનહાઉસ પરિસ્થિતિઓમાં સ્ક્લેરોટીનિયા સ્ક્લેરોટીઓરમથી સંક્રમિત બીન પાંદડાઓની વૃદ્ધિ લાક્ષણિકતાઓ અને પ્રકાશસંશ્લેષણ રંગદ્રવ્યો પર બાહ્ય L-ઓર્નિથિન ઉપયોગની અસર. (A) છોડની ઊંચાઈ (સે.મી.), (B) છોડ દીઠ શાખાઓની સંખ્યા, (C) છોડ દીઠ પાંદડાઓની સંખ્યા, (D) ક્લોરોફિલ a સામગ્રી (mg g-1 fr wt), (E) ક્લોરોફિલ b સામગ્રી (mg g-1 fr wt), (F) કુલ કેરોટીનોઇડ સામગ્રી (mg g-1 fr wt). મૂલ્યો પાંચ જૈવિક પ્રતિકૃતિઓના સરેરાશ ± SD છે (n = 5). વિવિધ અક્ષરો સારવાર વચ્ચે આંકડાકીય રીતે નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે (p < 0.05).
પ્રતિક્રિયાશીલ ઓક્સિજન પ્રજાતિઓ (ROS; હાઇડ્રોજન પેરોક્સાઇડ [H2O2] તરીકે વ્યક્ત) અને મુક્ત રેડિકલ (સુપરઓક્સાઇડ આયન [O2•−] તરીકે વ્યક્ત) ના ઇન સીટુ હિસ્ટોકેમિકલ સ્થાનિકીકરણથી જાણવા મળ્યું કે L-ઓર્નિથિન (250 mg/L) ના બાહ્ય ઉપયોગથી H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; આકૃતિ 5A) અને O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; આકૃતિ 5B) ના સંચયમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો છે, જે સારવાર ન કરાયેલ ચેપગ્રસ્ત છોડ (અનુક્રમે 173.31 ± 12.06 અને 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) અને 50 mg/L વાણિજ્યિક ફૂગનાશક Rizolex-T (170.12 ± 9.50 અને 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt) સાથે સારવાર કરાયેલ છોડના સંચયની તુલનામાં છે. અનુક્રમે) 72 કલાકે. hpt હેઠળ H2O2 અને O2•− નું ઉચ્ચ સ્તર સંચિત થયું (આકૃતિ 5A, B). તેવી જ રીતે, TCA-આધારિત મેલોન્ડિયાલ્ડીહાઇડ (MDA) પરીક્ષણ દર્શાવે છે કે S. સ્ક્લેરોટીઓરમ-સંક્રમિત બીન છોડ તેમના પાંદડાઓમાં MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) નું ઉચ્ચ સ્તર સંચિત કરે છે (આકૃતિ 5C). જોકે, L-ઓર્નિથિનના બાહ્ય ઉપયોગથી લિપિડ પેરોક્સિડેશનમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો છે જે સારવાર કરાયેલા છોડમાં MDA સામગ્રીમાં ઘટાડો (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt) દ્વારા પુરાવા મળે છે.
આકૃતિ 5. ગ્રીનહાઉસ પરિસ્થિતિઓમાં ચેપ પછી 72 કલાક પછી S. sclerotiorum થી સંક્રમિત બીન પાંદડાઓમાં ઓક્સિડેટીવ તણાવ અને બિન-ઉત્સેચક એન્ટીઑકિસડન્ટ સંરક્ષણ પદ્ધતિઓના મુખ્ય માર્કર્સ પર બાહ્ય L-ઓર્નિથિન ઉપયોગની અસર. (A) 72 hpt પર હાઇડ્રોજન પેરોક્સાઇડ (H2O2; nmol g−1 FW), (B) 72 hpt પર સુપરઓક્સાઇડ આયન (O2•−; nmol g−1 FW), (C) 72 hpt પર મેલોન્ડિઆલ્ડીહાઇડ (MDA; nmol g−1 FW), (D) કુલ દ્રાવ્ય ફિનોલ્સ (mg GAE g−1 FW), (E) કુલ દ્રાવ્ય ફ્લેવોનોઇડ્સ (mg RE g−1 FW) 72 hpt પર, (F) કુલ મુક્ત એમિનો એસિડ (mg g−1 FW) 72 hpt પર, અને (G) 72 hpt પર પ્રોલાઇન સામગ્રી (mg g−1 FW). મૂલ્યો 5 જૈવિક પ્રતિકૃતિઓ (n = 5) ના સરેરાશ ± પ્રમાણભૂત વિચલન (સરેરાશ ± SD) દર્શાવે છે. વિવિધ અક્ષરો સારવાર વચ્ચે આંકડાકીય રીતે નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવે છે (p < 0.05).