Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર. તમે જે બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરી રહ્યા છો તેના વર્ઝનમાં મર્યાદિત CSS સપોર્ટ છે. શ્રેષ્ઠ પરિણામો માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે તમારા બ્રાઉઝરના નવા વર્ઝનનો ઉપયોગ કરો (અથવા ઇન્ટરનેટ એક્સપ્લોરરમાં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો). આ દરમિયાન, ચાલુ સપોર્ટ સુનિશ્ચિત કરવા માટે, અમે સ્ટાઇલિંગ અથવા JavaScript વિના સાઇટ બતાવી રહ્યા છીએ.
ઓટીઝમ સ્પેક્ટ્રમ ડિસઓર્ડર જેવા ન્યુરોડેવલપમેન્ટલ ડિસઓર્ડરમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનની ભૂમિકાનો અભ્યાસ કરવા માટે પ્રોપિયોનિક એસિડ (PPA) નો ઉપયોગ થાય છે. PPA માઇટોકોન્ડ્રીયલ બાયોજેનેસિસ, મેટાબોલિઝમ અને ટર્નઓવરને વિક્ષેપિત કરવા માટે જાણીતું છે. જો કે, આ મિકેનિઝમ્સની જટિલ ટેમ્પોરલ પ્રકૃતિને કારણે માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડાયનેમિક્સ, ફિશન અને ફ્યુઝન પર PPA ની અસરો સમસ્યારૂપ રહે છે. અહીં, અમે ન્યુરોન જેવા SH-SY5Y કોષોમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ અલ્ટ્રાસ્ટ્રક્ચર, મોર્ફોલોજી અને ગતિશીલતાને PPA કેવી રીતે અસર કરે છે તેની તપાસ કરવા માટે પૂરક જથ્થાત્મક ઇમેજિંગ તકનીકોનો ઉપયોગ કરીએ છીએ. PPA (5 mM) એ માઇટોકોન્ડ્રીયલ વિસ્તાર (p < 0.01), ફેરેટ વ્યાસ અને પરિઘ (p < 0.05), અને ક્ષેત્ર 2 (p < 0.01) માં નોંધપાત્ર ઘટાડો કર્યો. માઇટોકોન્ડ્રીયલ ઇવેન્ટ લોકેટર વિશ્લેષણમાં ફિશન અને ફ્યુઝન ઇવેન્ટ્સમાં નોંધપાત્ર વધારો (p < 0.05) જોવા મળ્યો, જેનાથી તણાવની પરિસ્થિતિઓમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ નેટવર્કની અખંડિતતા જાળવી રાખવામાં આવી. વધુમાં, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) અને OPA1 (p < 0.05) ની mRNA અભિવ્યક્તિ નોંધપાત્ર રીતે ઓછી થઈ ગઈ હતી. 01). આ તણાવની પરિસ્થિતિઓમાં કાર્ય જાળવવા માટે માઇટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજી, બાયોજેનેસિસ અને ગતિશીલતાના પુનર્નિર્માણને દર્શાવે છે. અમારો ડેટા માઇટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતા પર PPA ની અસરોમાં નવી સમજ પ્રદાન કરે છે અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ તણાવ પ્રતિભાવોમાં સામેલ જટિલ નિયમનકારી પદ્ધતિઓનો અભ્યાસ કરવા માટે ઇમેજિંગ તકનીકોની ઉપયોગિતાને પ્રકાશિત કરે છે.
મિટોકોન્ડ્રિયા ઊર્જા ઉત્પાદન અને જૈવસંશ્લેષણમાં તેમની લાક્ષણિક ભૂમિકાઓ ઉપરાંત વિવિધ કોષીય કાર્યોમાં અભિન્ન સહભાગીઓ છે. મિટોકોન્ડ્રિયાલ ચયાપચય એ કેલ્શિયમ સિગ્નલિંગ, મેટાબોલિક અને રેડોક્સ હોમિયોસ્ટેસિસ, બળતરા સંકેત, એપિજેનેટિક ફેરફારો, કોષ પ્રસાર, ભિન્નતા અને પ્રોગ્રામ કરેલ કોષ મૃત્યુનું મુખ્ય નિયમનકાર છે. ખાસ કરીને, મિટોકોન્ડ્રિયાલ ચયાપચય ચેતાકોષીય વિકાસ, અસ્તિત્વ અને કાર્ય માટે મહત્વપૂર્ણ છે અને ન્યુરોપેથોલોજી 2,3,4 ના વિવિધ અભિવ્યક્તિઓમાં વ્યાપકપણે સંકળાયેલું છે.
છેલ્લા દાયકામાં, મેટાબોલિક સ્થિતિ ન્યુરોજેનેસિસ, ડિફરન્શિયેશન, પરિપક્વતા અને પ્લાસ્ટિસિટીના કેન્દ્રીય નિયમનકાર તરીકે ઉભરી આવી છે5,6. તાજેતરમાં, મિટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજી અને ગતિશીલતા મિટોસિસના ખાસ કરીને મહત્વપૂર્ણ ઘટકો બની ગયા છે, એક ગતિશીલ પ્રક્રિયા જે કોષોની અંદર સ્વસ્થ મિટોકોન્ડ્રિયાના પૂલને જાળવી રાખે છે. મિટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતા મિટોકોન્ડ્રીયલ બાયોજેનેસિસ અને બાયોએનર્જેટિક્સથી લઈને મિટોકોન્ડ્રીયલ ફિશન, ફ્યુઝન, ટ્રાન્સપોર્ટ અને ક્લિયરન્સ7,8 સુધીના જટિલ પરસ્પર નિર્ભર માર્ગો દ્વારા નિયંત્રિત થાય છે. આમાંના કોઈપણ સંકલિત મિકેનિઝમનું વિક્ષેપ સ્વસ્થ મિટોકોન્ડ્રીયલ નેટવર્ક્સના જાળવણીને અવરોધે છે અને ન્યુરોડેવલપમેન્ટ માટે ગહન કાર્યાત્મક પરિણામો ધરાવે છે9,10. ખરેખર, ઓટીઝમ સ્પેક્ટ્રમ ડિસઓર્ડર (ASD)11,12 સહિત ઘણા માનસિક, ન્યુરોડિજનરેટિવ અને ન્યુરોડેવલપમેન્ટલ વિકૃતિઓમાં મિટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતાનું ડિસરેગ્યુલેશન જોવા મળે છે.
ASD એ એક વિજાતીય ન્યુરોડેવલપમેન્ટલ ડિસઓર્ડર છે જેમાં જટિલ આનુવંશિક અને એપિજેનેટિક આર્કિટેક્ચર છે. ASD ની વારસાગતતા નિર્વિવાદ છે, પરંતુ અંતર્ગત મોલેક્યુલર ઇટીઓલોજી નબળી રીતે સમજી શકાય છે. પ્રીક્લિનિકલ મોડેલ્સ, ક્લિનિકલ અભ્યાસો અને મલ્ટી-ઓમિક્સ મોલેક્યુલર ડેટાસેટ્સમાંથી ડેટા એકઠા કરવાથી ASD13,14 માં માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનના વધતા પુરાવા મળે છે. અમે અગાઉ ASD ધરાવતા દર્દીઓના સમૂહમાં જીનોમ-વ્યાપી DNA મેથિલેશન સ્ક્રીન કરી હતી અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ મેટાબોલિક પાથવે15 સાથે ક્લસ્ટર થયેલ ડિફરન્શિયલલી મેથિલેટેડ જનીનો ઓળખી કાઢ્યા હતા. અમે ત્યારબાદ માઇટોકોન્ડ્રીયલ બાયોજેનેસિસ અને ડાયનેમિક્સના સેન્ટ્રલ રેગ્યુલેટર્સના ડિફરન્શિયલ મેથિલેશનની જાણ કરી હતી, જે ASD16 માં વધેલા mtDNA કોપી નંબર અને બદલાયેલ પેશાબની મેટાબોલિક પ્રોફાઇલ સાથે સંકળાયેલું હતું. અમારો ડેટા વધતા પુરાવા પૂરા પાડે છે કે માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડાયનેમિક્સ અને હોમિયોસ્ટેસિસ ASD ના પેથોફિઝિયોલોજીમાં કેન્દ્રિય ભૂમિકા ભજવે છે. તેથી, માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડાયનેમિક્સ, મોર્ફોલોજી અને ફંક્શન વચ્ચેના સંબંધની યાંત્રિક સમજણમાં સુધારો કરવો એ ગૌણ માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શન દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ ન્યુરોલોજીકલ રોગોમાં ચાલુ સંશોધનનો મુખ્ય ધ્યેય છે.
મિટોકોન્ડ્રીયલ તણાવ પ્રતિભાવોમાં ચોક્કસ જનીનોની ભૂમિકાનો અભ્યાસ કરવા માટે ઘણીવાર પરમાણુ તકનીકોનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. જો કે, આ અભિગમ મિટોટિક નિયંત્રણ પદ્ધતિઓના બહુપક્ષીય અને સમયલક્ષી સ્વભાવ દ્વારા મર્યાદિત હોઈ શકે છે. વધુમાં, મિટોકોન્ડ્રીયલ જનીનોની વિભેદક અભિવ્યક્તિ કાર્યાત્મક ફેરફારોનું પરોક્ષ સૂચક છે, ખાસ કરીને કારણ કે ફક્ત મર્યાદિત સંખ્યામાં જનીનોનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે. તેથી, મિટોકોન્ડ્રીયલ કાર્ય અને બાયોએનર્જેટિક્સનો અભ્યાસ કરવા માટે વધુ સીધી પદ્ધતિઓ પ્રસ્તાવિત કરવામાં આવી છે17. મિટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજી મિટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતા સાથે ગાઢ રીતે સંબંધિત છે. મિટોકોન્ડ્રીયલ આકાર, જોડાણ અને માળખું ઊર્જા ઉત્પાદન અને મિટોકોન્ડ્રીયલ અને કોષ અસ્તિત્વ માટે મહત્વપૂર્ણ છે5,18. વધુમાં, મિટોસિસના વિવિધ ઘટકો મિટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજીમાં ફેરફારો પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરે છે, જે મિટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનના ઉપયોગી અંતિમ બિંદુઓ તરીકે સેવા આપી શકે છે અને અનુગામી યાંત્રિક અભ્યાસો માટે આધાર પૂરો પાડી શકે છે.
ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી (TEM) નો ઉપયોગ કરીને મિટોકોન્ડ્રિયલ મોર્ફોલોજીનું સીધું અવલોકન કરી શકાય છે, જે સેલ્યુલર અલ્ટ્રાસ્ટ્રક્ચરનો વિગતવાર અભ્યાસ કરવાની મંજૂરી આપે છે. TEM કોષ વસ્તીમાં જનીન ટ્રાન્સક્રિપ્શન, પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ અથવા મિટોકોન્ડ્રિયલ કાર્યાત્મક પરિમાણો પર સંપૂર્ણપણે આધાર રાખવાને બદલે, વ્યક્તિગત મિટોકોન્ડ્રિયાના રિઝોલ્યુશન પર મિટોકોન્ડ્રિયલ ક્રિસ્ટીના મોર્ફોલોજી, આકાર અને માળખાને સીધી રીતે વિઝ્યુઅલાઈઝ કરે છે17,19,20. વધુમાં, TEM મિટોકોન્ડ્રિયા અને અન્ય ઓર્ગેનેલ્સ, જેમ કે એન્ડોપ્લાઝમિક રેટિક્યુલમ અને ઓટોફેગોસોમ્સ, વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓના અભ્યાસને સરળ બનાવે છે, જે મિટોકોન્ડ્રિયલ કાર્ય અને હોમિયોસ્ટેસિસમાં મુખ્ય ભૂમિકા ભજવે છે21,22. આમ, આ ચોક્કસ માર્ગો અથવા જનીનો પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરતા પહેલા મિટોકોન્ડ્રિયલ ડિસફંક્શનનો અભ્યાસ કરવા માટે TEM ને એક સારો પ્રારંભિક બિંદુ બનાવે છે. જેમ જેમ મિટોકોન્ડ્રિયલ કાર્ય ન્યુરોપેથોલોજી માટે વધુને વધુ સુસંગત બનતું જાય છે, તેમ ઇન વિટ્રો ન્યુરોનલ મોડેલોમાં મિટોકોન્ડ્રિયલ મોર્ફોલોજી અને ગતિશીલતાનો સીધો અને માત્રાત્મક રીતે અભ્યાસ કરવા સક્ષમ બનવાની સ્પષ્ટ જરૂર છે.
આ લેખમાં, અમે ઓટીઝમ સ્પેક્ટ્રમ ડિસઓર્ડરમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનના ન્યુરોનલ મોડેલમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડાયનેમિક્સનું પરીક્ષણ કરીએ છીએ. અમે અગાઉ ASD15 માં પ્રોપિયોનાઇલ-CoA કાર્બોક્સિલેઝ બીટા (PCCB) ના ડિફરન્શિયલ મેથિલેશનની જાણ કરી હતી, જે માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રોપિયોનાઇલ-CoA કાર્બોક્સિલેઝ એન્ઝાઇમ PCC ના સબયુનિટ છે. PCC નું ડિસરેગ્યુલેશન પ્રોપિયોનાઇલ ડેરિવેટિવ્ઝના ઝેરી સંચયનું કારણ બને છે, જેમાં પ્રોપિયોનિક એસિડ (PPA)23,24,25નો સમાવેશ થાય છે. PPA ન્યુરોનલ મેટાબોલિઝમને વિક્ષેપિત કરે છે અને ઇન વિવો વર્તનમાં ફેરફાર કરે છે અને ASD26,27,28 માં સામેલ ન્યુરોડેવલપમેન્ટલ મિકેનિઝમ્સનો અભ્યાસ કરવા માટે એક સ્થાપિત પ્રાણી મોડેલ છે. વધુમાં, PPA ઇન વિટ્રોમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ મેમ્બ્રેન સંભવિતતા, બાયોજેનેસિસ અને શ્વસનને વિક્ષેપિત કરે છે અને ચેતાકોષોમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનને મોડેલ કરવા માટે વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાય છે29,30. જો કે, માઇટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજી અને ગતિશીલતા પર PPA-પ્રેરિત માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનની અસર નબળી રીતે સમજી શકાય છે.
આ અભ્યાસ SH-SY5Y કોષોમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજી, ગતિશીલતા અને કાર્ય પર PPA ની અસરોનું માપન કરવા માટે પૂરક ઇમેજિંગ તકનીકોનો ઉપયોગ કરે છે. પ્રથમ, અમે માઇટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજી અને અલ્ટ્રાસ્ટ્રક્ચરમાં ફેરફારોની કલ્પના કરવા માટે TEM પદ્ધતિ વિકસાવી17,31,32. માઇટોકોન્ડ્રીયલ33 ની ગતિશીલ પ્રકૃતિને ધ્યાનમાં રાખીને, અમે PPA તણાવ હેઠળ ફિશન અને ફ્યુઝન ઘટનાઓ, માઇટોકોન્ડ્રીયલ સંખ્યા અને વોલ્યુમ વચ્ચેના સંતુલનમાં ફેરફારોનું માપન કરવા માટે માઇટોકોન્ડ્રીયલ ઇવેન્ટ લોકલાઈઝર (MEL) વિશ્લેષણનો પણ ઉપયોગ કર્યો. અંતે, અમે તપાસ કરી કે શું માઇટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજી અને ગતિશીલતા બાયોજેનેસિસ, ફિશન અને ફ્યુઝનમાં સામેલ જનીનોની અભિવ્યક્તિમાં ફેરફારો સાથે સંકળાયેલા છે. એકસાથે લેવામાં આવે તો, અમારો ડેટા માઇટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતાને નિયંત્રિત કરતી પદ્ધતિઓની જટિલતાને સ્પષ્ટ કરવાના પડકારને દર્શાવે છે. અમે SH-SY5Y કોષોમાં માઇટોસિસના માપી શકાય તેવા કન્વર્જન્ટ એન્ડપોઇન્ટ તરીકે માઇટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજીનો અભ્યાસ કરવામાં TEM ની ઉપયોગિતાને પ્રકાશિત કરીએ છીએ. વધુમાં, અમે હાઇલાઇટ કરીએ છીએ કે TEM ડેટા ઇમેજિંગ તકનીકો સાથે જોડવામાં આવે ત્યારે સૌથી સમૃદ્ધ માહિતી પ્રદાન કરે છે જે મેટાબોલિક તણાવના પ્રતિભાવમાં ગતિશીલ ઘટનાઓને પણ કેપ્ચર કરે છે. ન્યુરોનલ સેલ મિટોસિસને ટેકો આપતા મોલેક્યુલર રેગ્યુલેટરી મિકેનિઝમ્સનું વધુ વર્ણન નર્વસ સિસ્ટમના મિટોકોન્ડ્રીયલ ઘટક અને ન્યુરોડિજનરેટિવ રોગોમાં મહત્વપૂર્ણ સમજ પ્રદાન કરી શકે છે.
મિટોકોન્ડ્રીયલ તણાવ પ્રેરિત કરવા માટે, SH-SY5Y કોષોને 3 mM અને 5 mM સોડિયમ પ્રોપિયોનેટ (NaP) નો ઉપયોગ કરીને PPA સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી. TEM પહેલાં, નમૂનાઓને ઉચ્ચ-દબાણ ફ્રીઝિંગ અને ફ્રીઝિંગનો ઉપયોગ કરીને ક્રાયોજેનિક નમૂના તૈયારીને આધિન કરવામાં આવતા હતા (આકૃતિ 1a). અમે ત્રણ જૈવિક પ્રતિકૃતિઓમાં મિટોકોન્ડ્રીયલ વસ્તીના આઠ મોર્ફોલોજિકલ પરિમાણોને માપવા માટે એક સ્વચાલિત મિટોકોન્ડ્રીયલ છબી વિશ્લેષણ પાઇપલાઇન વિકસાવી. અમને જાણવા મળ્યું કે PPA સારવારથી ચાર પરિમાણોમાં નોંધપાત્ર ફેરફાર થયો છે: ક્ષેત્ર 2, ક્ષેત્ર, પરિમિતિ અને ફેરેટ વ્યાસ (આકૃતિ 1b–e). ક્ષેત્ર 2 માં 3 mM અને 5 mM PPA સારવાર (અનુક્રમે p = 0.0183 અને p = 0.002) (આકૃતિ 1b) બંને સાથે નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો છે, જ્યારે ક્ષેત્ર (p = 0.003), પરિમિતિ (p = 0.0106) અને ફેરેટ વ્યાસ બધામાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો છે. નિયંત્રણ જૂથ (આકૃતિ 1c–e) ની તુલનામાં 5 mM સારવાર જૂથમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો (p = 0.0172) હતો. વિસ્તાર અને પરિઘમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો દર્શાવે છે કે 5 mM PPA સાથે સારવાર કરાયેલા કોષોમાં નાના, વધુ ગોળાકાર માઇટોકોન્ડ્રિયા હતા, અને આ માઇટોકોન્ડ્રિયા નિયંત્રણ કોષો કરતા ઓછા વિસ્તરેલ હતા. આ ફેરેટ વ્યાસમાં નોંધપાત્ર ઘટાડા સાથે પણ સુસંગત છે, જે એક સ્વતંત્ર પરિમાણ છે જે કણોની ધાર વચ્ચેના સૌથી મોટા અંતરમાં ઘટાડો દર્શાવે છે. ક્રિસ્ટીના અલ્ટ્રાસ્ટ્રક્ચરમાં ફેરફારો જોવા મળ્યા: PPA તણાવના પ્રભાવ હેઠળ ક્રિસ્ટા ઓછા સ્પષ્ટ બન્યા (આકૃતિ 1a, પેનલ B). જો કે, બધી છબીઓ ક્રિસ્ટાના અલ્ટ્રાસ્ટ્રક્ચરને સ્પષ્ટ રીતે પ્રતિબિંબિત કરતી નથી, તેથી આ ફેરફારોનું માત્રાત્મક વિશ્લેષણ હાથ ધરવામાં આવ્યું ન હતું. આ TEM ડેટા ત્રણ સંભવિત દૃશ્યોને પ્રતિબિંબિત કરી શકે છે: (1) PPA વિભાજનને વધારે છે અથવા ફ્યુઝનને અટકાવે છે, જેના કારણે હાલના માઇટોકોન્ડ્રિયા કદમાં સંકોચાય છે; (2) ઉન્નત બાયોજેનેસિસ નવા, નાના માઇટોકોન્ડ્રિયા બનાવે છે અથવા (3) બંને પદ્ધતિઓને એકસાથે પ્રેરિત કરે છે. જોકે આ પરિસ્થિતિઓને TEM દ્વારા ઓળખી શકાતી નથી, નોંધપાત્ર મોર્ફોલોજિકલ ફેરફારો PPA તણાવ હેઠળ માઇટોકોન્ડ્રિયા હોમિયોસ્ટેસિસ અને ગતિશીલતામાં ફેરફારો સૂચવે છે. અમે ત્યારબાદ આ ગતિશીલતા અને તેમને અંતર્ગત સંભવિત પદ્ધતિઓને વધુ લાક્ષણિકતા આપવા માટે વધારાના પરિમાણોની શોધ કરી.
પ્રોપિયોનિક એસિડ (PPA) માઇટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજીને ફરીથી બનાવે છે. (a) પ્રતિનિધિ ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી (TEM) છબીઓ દર્શાવે છે કે PPA સારવારમાં વધારો થવાથી માઇટોકોન્ડ્રીયલ કદ ઘટે છે અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ નાના અને વધુ ગોળાકાર બને છે; અનુક્રમે 0 mM (સારવાર ન કરાયેલ), 3 mM અને 5 mM. લાલ તીર માઇટોકોન્ડ્રીયા દર્શાવે છે. (b–e) 24 કલાક માટે PPA સાથે સારવાર કરાયેલ SH-SY5Y કોષો TEM માટે તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા અને પરિણામોનું વિશ્લેષણ Fiji/ImageJ નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. આઠ પરિમાણોમાંથી ચારે નિયંત્રણ (સારવાર ન કરાયેલ, 0 mM PPA) અને સારવાર ન કરાયેલ (3 mM અને 5 mM PPA) કોષો વચ્ચે નોંધપાત્ર તફાવત દર્શાવ્યા હતા. (b) પ્રદેશ 2, (c) વિસ્તાર, (d) પરિમિતિ, (e) ફેરેટ વ્યાસ. નોંધપાત્ર તફાવતો નક્કી કરવા માટે ભિન્નતા (નિયંત્રણ વિરુદ્ધ સારવાર) અને ડનેટના બહુવિધ સરખામણી પરીક્ષણનું એક-માર્ગી વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો (p < 0.05). ડેટા પોઇન્ટ દરેક વ્યક્તિગત કોષ માટે સરેરાશ માઇટોકોન્ડ્રીયલ મૂલ્યનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, અને ભૂલ બાર સરેરાશ ± SEM દર્શાવે છે. બતાવેલ ડેટા n = 3 દર્શાવે છે, પ્રતિ પ્રતિકૃતિ ઓછામાં ઓછા 24 કોષો; કુલ 266 છબીઓનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું; * p < 0.05 દર્શાવે છે, ** p < 0.01 દર્શાવે છે.
PPA ને મિટોકોન્ડ્રીયલ ડાયનેમિક્સ કેવી રીતે પ્રતિભાવ આપે છે તે વધુ લાક્ષણિકતા આપવા માટે, અમે ટેટ્રામેથાઈલરોડામાઈન એથિલ એસ્ટર (TMRE) સાથે મિટોકોન્ડ્રીયાને સ્ટેન કર્યું અને 3 અને 5 mM PPA પર 24 કલાક પછી મિટોકોન્ડ્રીયાને સ્થાનિક અને પ્રમાણિત કરવા માટે સમય-લેપ્સ માઇક્રોસ્કોપી અને MEL વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કર્યો. વિભાજન અને ફ્યુઝન ઘટનાઓની સારવાર. (આકૃતિ 2a). MEL વિશ્લેષણ પછી, મિટોકોન્ડ્રીયલ રચનાઓની સંખ્યા અને તેમના સરેરાશ જથ્થાને માપવા માટે મિટોકોન્ડ્રીયાનું વધુ વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. અમે વિભાજન [5.6 ± 0.3 (p < 0.05) )] અને ફ્યુઝન [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] અને ફ્યુઝન [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] ની તુલનામાં 5 mM પર બનતી વિભાજન ઘટનાઓની સંખ્યામાં એક નાનો પણ નોંધપાત્ર વધારો જોયો (આકૃતિ 3b). મિટોકોન્ડ્રિયાની સંખ્યામાં 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] અને 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (આકૃતિ 3c) બંને પર નોંધપાત્ર વધારો થયો છે, જ્યારે દરેક મિટોકોન્ડ્રિયા રચનાનું સરેરાશ વોલ્યુમ યથાવત રહ્યું છે (આકૃતિ 3c). 3d). એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ સૂચવે છે કે મિટોકોન્ડ્રિયા ગતિશીલતાનું પુનર્નિર્માણ એક વળતર પ્રતિભાવ તરીકે કામ કરે છે જે સફળતાપૂર્વક મિટોકોન્ડ્રિયા નેટવર્કની અખંડિતતા જાળવી રાખે છે. 3 mM PPA પર વિભાજન ઘટનાઓની સંખ્યામાં વધારો સૂચવે છે કે મિટોકોન્ડ્રિયા સંખ્યામાં વધારો આંશિક રીતે મિટોકોન્ડ્રિયા વિભાજનને કારણે છે, પરંતુ સરેરાશ મિટોકોન્ડ્રિયા વોલ્યુમ આવશ્યકપણે અપરિવર્તિત રહે છે તે જોતાં, બાયોજેનેસિસને વધારાના વળતર પ્રતિભાવ તરીકે નકારી શકાય નહીં. જો કે, આ ડેટા TEM દ્વારા અવલોકન કરાયેલ નાના, ગોળાકાર મિટોકોન્ડ્રિયા માળખાં સાથે સુસંગત છે અને PPA દ્વારા પ્રેરિત મિટોકોન્ડ્રિયા ગતિશીલતામાં નોંધપાત્ર ફેરફારો પણ દર્શાવે છે.
પ્રોપિયોનિક એસિડ (PPA) નેટવર્ક અખંડિતતા જાળવવા માટે ગતિશીલ માઇટોકોન્ડ્રીયલ રિમોડેલિંગને પ્રેરિત કરે છે. SH-SY5Y કોષોને 24 કલાક માટે 3 અને 5 mM PPA સાથે સંવર્ધન કરવામાં આવ્યું હતું, સારવાર આપવામાં આવી હતી અને TMRE અને Hoechst 33342 સાથે સ્ટેઇન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા અને ત્યારબાદ MEL વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. (a) દરેક સ્થિતિ માટે સમય 2 (t2) પર રંગ અને દ્વિસંગી મહત્તમ તીવ્રતા અંદાજ દર્શાવતી પ્રતિનિધિ સમય-લેપ્સ માઇક્રોસ્કોપી છબીઓ. દરેક દ્વિસંગી છબીમાં દર્શાવેલ પસંદ કરેલા પ્રદેશોને સમય જતાં ગતિશીલતા દર્શાવવા માટે ત્રણ અલગ અલગ સમય ફ્રેમ (t1-t3) પર 3D માં વિસ્તૃત અને પ્રદર્શિત કરવામાં આવે છે; ફ્યુઝન ઇવેન્ટ્સ લીલા રંગમાં પ્રકાશિત થાય છે; વિભાજન ઇવેન્ટ્સ લીલા રંગમાં પ્રકાશિત થાય છે. લાલ રંગમાં પ્રદર્શિત થાય છે. (b) પ્રતિ સ્થિતિ ગતિશીલ ઘટનાઓની સરેરાશ સંખ્યા. (c) પ્રતિ કોષ માઇટોકોન્ડ્રીયલ રચનાઓની સરેરાશ સંખ્યા. (d) પ્રતિ કોષ માઇટોકોન્ડ્રીયલ રચનાનું સરેરાશ વોલ્યુમ (µm3). દર્શાવેલ ડેટા પ્રતિ સારવાર જૂથ n = 15 કોષોનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. દર્શાવેલ ભૂલ બાર સરેરાશ ± SEM, સ્કેલ બાર = 10 μm, * p < 0.05 દર્શાવે છે.
પ્રોપિયોનિક એસિડ (PPA) મિટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતા સાથે સંકળાયેલા જનીનોના ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ સપ્રેસનનું કારણ બને છે. SH-SY5Y કોષોને 24 કલાક માટે 3 અને 5 mM PPA સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી. RT-qPCR નો ઉપયોગ કરીને સંબંધિત જનીન પ્રમાણીકરણ કરવામાં આવ્યું હતું અને B2M માં સામાન્ય કરવામાં આવ્યું હતું. મિટોકોન્ડ્રીયલ બાયોજેનેસિસ જનીનો (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 અને (d) NFE2L2. મિટોકોન્ડ્રીયલ ફ્યુઝન અને ફિશન જનીનો (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 અને (i) DRP1. એક-માર્ગી ANOVA (નિયંત્રણ વિરુદ્ધ સારવાર) અને ડનેટના બહુવિધ સરખામણી પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને નોંધપાત્ર તફાવતો (p < 0.05) નું પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું: * p < 0.05 સૂચવે છે, ** p < 0.01 સૂચવે છે, અને **** p < 0.0001 સૂચવે છે. બાર સરેરાશ અભિવ્યક્તિ ± SEM દર્શાવે છે. દર્શાવેલ ડેટા n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), અને n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) જૈવિક પ્રતિકૃતિઓનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.
TEM અને MEL વિશ્લેષણમાંથી મળેલા ડેટા સૂચવે છે કે PPA મિટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજી અને ગતિશીલતાને બદલી નાખે છે. જો કે, આ ઇમેજિંગ તકનીકો આ પ્રક્રિયાઓને ચલાવતા અંતર્ગત મિકેનિઝમ્સમાં સમજ આપતી નથી. તેથી અમે PPA સારવારના પ્રતિભાવમાં મિટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતા, બાયોજેનેસિસ અને મિટોસિસના નવ મુખ્ય નિયમનકારોના mRNA અભિવ્યક્તિની તપાસ કરી. અમે સેલ માયલોમા ઓન્કોજીન (cMYC), ન્યુક્લિયર રેસ્પિરેટરી ફેક્ટર (NRF1), મિટોકોન્ડ્રીયલ ટ્રાન્સક્રિપ્શન ફેક્ટર 1 (TFAM), NFE2-જેવા ટ્રાન્સક્રિપ્શન ફેક્ટર BZIP (NFE2L2), ગેસ્ટ્રિન-જેવા પ્રોટીન 2 (STOML2), ઓપ્ટિક નર્વ એટ્રોફી 1 (OPA1), મિટોફ્યુસિન 1 (MFN1), મિટોફ્યુસિન 2 (MFN2) અને ડાયનામિન-સંબંધિત પ્રોટીન 1 (DRP1) 3 mM અને 5 mM PPA સાથે 24 કલાકની સારવાર પછી માપન કર્યું. અમે 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 અને p < 0.0001, અનુક્રમે) અને 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA સારવાર અવલોકન કરી. (આકૃતિ 3a–c). mRNA અભિવ્યક્તિમાં ઘટાડો ડોઝ-આધારિત હતો: cMYC, NRF1 અને TFAM ની અભિવ્યક્તિ 3 mM પર અનુક્રમે 5.7, 2.6 અને 1.9 ગણી ઘટી, અને 5 mM પર 11.2, 3 અને 2.2 ગણી ઘટી. તેનાથી વિપરીત, PPA ની કોઈપણ સાંદ્રતા પર કેન્દ્રીય રેડોક્સ બાયોજેનેસિસ જનીન NFE2L2 માં કોઈ ફેરફાર થયો ન હતો, જોકે ઘટેલી અભિવ્યક્તિનો સમાન ડોઝ-આધારિત વલણ જોવા મળ્યું હતું (આકૃતિ 3d).
અમે વિભાજન અને ફ્યુઝનના નિયમનમાં સામેલ શાસ્ત્રીય જનીનોની અભિવ્યક્તિની પણ તપાસ કરી. STOML2 ફ્યુઝન, મિટોફેજી અને બાયોજેનેસિસમાં સામેલ હોવાનું માનવામાં આવે છે, અને તેની અભિવ્યક્તિમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો હતો (p < 0.0001) 3 mM (2.4-ગણો ફેરફાર) અને 5 mM (2.8-ગણો ફેરફાર) PPA (આકૃતિ 1). 3d). તેવી જ રીતે, OPA1 ફ્યુઝન જનીન અભિવ્યક્તિમાં 3 mM (1.6-ગણો ફેરફાર) અને 5 mM (1.9-ગણો ફેરફાર) PPA (p = 0.006 અને p = 0.0024, અનુક્રમે) (આકૃતિ 3f) પર ઘટાડો થયો હતો. જોકે, અમને 24-કલાક PPA તણાવ (આકૃતિ 3g–i) હેઠળ ફ્યુઝન જનીનો MFN1, MFN2 અથવા ફિશન જનીન DRP1 ની અભિવ્યક્તિમાં નોંધપાત્ર તફાવત મળ્યા નથી. વધુમાં, અમને જાણવા મળ્યું કે ચાર ફ્યુઝન અને ફિશન પ્રોટીન (OPA1, MFN1, MFN2 અને DRP1) ના સ્તરો સમાન પરિસ્થિતિઓ હેઠળ બદલાયા નથી (આકૃતિ 4a–d). એ નોંધવું મહત્વપૂર્ણ છે કે આ ડેટા સમયના એક બિંદુને પ્રતિબિંબિત કરે છે અને PPA તણાવના પ્રારંભિક તબક્કા દરમિયાન પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ અથવા પ્રવૃત્તિ સ્તરમાં ફેરફારને પ્રતિબિંબિત કરી શકશે નહીં. જો કે, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 અને OPA1 ની અભિવ્યક્તિમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો મિટોકોન્ડ્રીયલ ચયાપચય, બાયોજેનેસિસ અને ગતિશીલતાના નોંધપાત્ર ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ ડિસરેગ્યુલેશન સૂચવે છે. વધુમાં, આ ડેટા મિટોકોન્ડ્રીયલ કાર્યમાં અંતિમ-સ્થિતિ ફેરફારોનો સીધો અભ્યાસ કરવા માટે ઇમેજિંગ તકનીકોની ઉપયોગિતાને પ્રકાશિત કરે છે.
પ્રોપિયોનિક એસિડ (PPA) સારવાર પછી ફ્યુઝન અને ફિશન ફેક્ટર પ્રોટીન સ્તર બદલાયા નથી. SH-SY5Y કોષોને 24 કલાક માટે 3 અને 5 mM PPA સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી. પ્રોટીન સ્તરોને પશ્ચિમી બ્લોટ વિશ્લેષણ દ્વારા માપવામાં આવ્યા હતા, અને અભિવ્યક્તિ સ્તરોને કુલ પ્રોટીનમાં સામાન્ય બનાવવામાં આવ્યા હતા. સરેરાશ પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ અને લક્ષ્ય અને કુલ પ્રોટીનના પ્રતિનિધિ પશ્ચિમી બ્લોટ્સ બતાવવામાં આવ્યા છે. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. બાર સરેરાશ ± SEM દર્શાવે છે, અને દર્શાવેલ ડેટા n = 3 જૈવિક પ્રતિકૃતિઓનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. ભિન્નતાના એક-માર્ગી વિશ્લેષણ અને ડનેટના પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને બહુવિધ સરખામણીઓ (p < 0.05) કરવામાં આવી હતી. મૂળ જેલ અને બ્લોટ આકૃતિ S1 માં બતાવવામાં આવ્યા છે.
મિટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શન મેટાબોલિક, કાર્ડિયોવેસ્ક્યુલર અને સ્નાયુબદ્ધ રોગોથી લઈને ન્યુરોલોજીકલ રોગો સુધીના બહુ-સિસ્ટમ રોગો સાથે સંકળાયેલું છે1,10. ઘણા ન્યુરોડિજનરેટિવ અને ન્યુરોડિજનરેટિવ રોગો માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શન સાથે સંકળાયેલા છે, જે મગજના સમગ્ર જીવનકાળ દરમિયાન આ ઓર્ગેનેલ્સના મહત્વને પ્રકાશિત કરે છે. આ રોગોમાં પાર્કિન્સન રોગ, અલ્ઝાઇમર રોગ અને ASD3,4,18 શામેલ છે. જો કે, આ રોગોનો અભ્યાસ કરવા માટે મગજની પેશીઓ સુધી પહોંચવું મુશ્કેલ છે, ખાસ કરીને યાંત્રિક સ્તરે, સેલ્યુલર મોડેલ સિસ્ટમ્સને જરૂરી વિકલ્પ બનાવે છે. આ અભ્યાસમાં, અમે ન્યુરોનલ રોગો, ખાસ કરીને ઓટીઝમ સ્પેક્ટ્રમ ડિસઓર્ડરમાં જોવા મળતા મિટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનનું પુનરાવર્તન કરવા માટે PPA-સારવાર કરાયેલ SH-SY5Y કોષોનો ઉપયોગ કરીને સેલ્યુલર મોડેલ સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીએ છીએ. ચેતાકોષોમાં મિટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતાનો અભ્યાસ કરવા માટે આ PPA મોડેલનો ઉપયોગ કરવાથી ASD ના ઇટીઓલોજીમાં સમજ મળી શકે છે.
અમે મિટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજીમાં ફેરફારો જોવા માટે TEM નો ઉપયોગ કરવાની શક્યતા શોધી કાઢી. એ નોંધવું મહત્વપૂર્ણ છે કે TEM નો ઉપયોગ તેની અસરકારકતા વધારવા માટે યોગ્ય રીતે થવો જોઈએ. ક્રાયો-નમુનાઓની તૈયારી સેલ્યુલર ઘટકોને એકસાથે ઠીક કરીને અને કલાકૃતિઓની રચના ઘટાડીને ચેતાકોષીય માળખાને વધુ સારી રીતે સાચવવાની મંજૂરી આપે છે34. આ સાથે સુસંગત, અમે અવલોકન કર્યું કે ચેતાકોષ જેવા SH-SY5Y કોષોમાં અકબંધ સબસેલ્યુલર ઓર્ગેનેલ્સ અને વિસ્તરેલ મિટોકોન્ડ્રિયા (આકૃતિ 1a) હતા. આ ન્યુરોનલ સેલ મોડેલોમાં મિટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજીનો અભ્યાસ કરવા માટે ક્રાયોજેનિક તૈયારી તકનીકોની ઉપયોગિતાને પ્રકાશિત કરે છે. TEM ડેટાના ઉદ્દેશ્ય વિશ્લેષણ માટે જથ્થાત્મક માપન મહત્વપૂર્ણ હોવા છતાં, મિટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજીકલ ફેરફારોની પુષ્ટિ કરવા માટે કયા ચોક્કસ પરિમાણો માપવા જોઈએ તે અંગે હજુ પણ કોઈ સર્વસંમતિ નથી. મિટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજી17,31,32 ની માત્રાત્મક રીતે તપાસ કરનારા મોટી સંખ્યામાં અભ્યાસોના આધારે, અમે એક સ્વચાલિત મિટોકોન્ડ્રીયલ છબી વિશ્લેષણ પાઇપલાઇન વિકસાવી છે જે આઠ મોર્ફોલોજીકલ પરિમાણોને માપે છે, જેમ કે: ક્ષેત્રફળ, ક્ષેત્રફળ2, પાસા ગુણોત્તર, પરિમિતિ, પરિપત્ર, ડિગ્રી, ફેરેટ વ્યાસ. અને ગોળાકારતા.
તેમાંથી, PPA એ ક્ષેત્રફળ 2, ક્ષેત્રફળ, પરિમિતિ અને ફેરેટ વ્યાસમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો કર્યો (આકૃતિ 1b–e). આ દર્શાવે છે કે મિટોકોન્ડ્રિયા નાનું અને વધુ ગોળાકાર બન્યું છે, જે અગાઉના અભ્યાસો સાથે સુસંગત છે જે PPA30-પ્રેરિત મિટોકોન્ડ્રિયલ તણાવના 72 કલાક પછી મિટોકોન્ડ્રિયલ ક્ષેત્રમાં ઘટાડો દર્શાવે છે. આ મોર્ફોલોજિકલ લક્ષણો મિટોકોન્ડ્રિયલ વિભાજન સૂચવી શકે છે, જે મિટોકોન્ડ્રિયલ નેટવર્કમાંથી ક્ષતિગ્રસ્ત ઘટકોને અલગ કરવા માટે જરૂરી પ્રક્રિયા છે જેથી મિટોકોન્ડ્રિયલ નેટવર્ક દ્વારા તેમના અધોગતિને પ્રોત્સાહન મળે35,36,37. બીજી બાજુ, સરેરાશ મિટોકોન્ડ્રિયલ કદમાં ઘટાડો બાયોજેનેસિસમાં વધારો સાથે સંકળાયેલ હોઈ શકે છે, જેના પરિણામે નાના નવજાત મિટોકોન્ડ્રિયાની રચના થાય છે. વધેલા વિભાજન અથવા બાયોજેનેસિસ મિટોકોન્ડ્રિયલ તણાવ સામે મિટોસિસ જાળવવા માટે વળતર આપતી પ્રતિક્રિયા રજૂ કરે છે. જો કે, મિટોકોન્ડ્રિયલ વૃદ્ધિમાં ઘટાડો, ક્ષતિગ્રસ્ત ફ્યુઝન અથવા અન્ય પરિસ્થિતિઓને બાકાત રાખી શકાતી નથી.
TEM દ્વારા બનાવેલ ઉચ્ચ-રિઝોલ્યુશન છબીઓ વ્યક્તિગત મિટોકોન્ડ્રિયાના સ્તરે મોર્ફોલોજિકલ લાક્ષણિકતાઓ નક્કી કરવાની મંજૂરી આપે છે, તેમ છતાં આ પદ્ધતિ એક જ સમયે દ્વિ-પરિમાણીય સ્નેપશોટ ઉત્પન્ન કરે છે. મેટાબોલિક તણાવ પ્રત્યે ગતિશીલ પ્રતિભાવોનો અભ્યાસ કરવા માટે, અમે TMRE સાથે મિટોકોન્ડ્રિયાને સ્ટેન કર્યું અને MEL વિશ્લેષણ સાથે સમય-લેપ્સ માઇક્રોસ્કોપીનો ઉપયોગ કર્યો, જે સમય જતાં મિટોકોન્ડ્રિયા નેટવર્કમાં ફેરફારોના ઉચ્ચ-થ્રુપુટ 3D વિઝ્યુલાઇઝેશનને મંજૂરી આપે છે33,38. અમે PPA તણાવ હેઠળ મિટોકોન્ડ્રિયા ગતિશીલતામાં સૂક્ષ્મ પરંતુ નોંધપાત્ર ફેરફારો જોયા (આકૃતિ 2). 3 mM પર, વિભાજન ઘટનાઓની સંખ્યામાં નોંધપાત્ર વધારો થયો, જ્યારે ફ્યુઝન ઘટનાઓ નિયંત્રણમાં જેટલી જ રહી. 5 mM PPA પર વિભાજન અને ફ્યુઝન ઘટનાઓ બંનેની સંખ્યામાં વધારો જોવા મળ્યો, પરંતુ આ ફેરફારો લગભગ પ્રમાણસર હતા, જે સૂચવે છે કે વિભાજન અને ફ્યુઝન ગતિશાસ્ત્ર ઉચ્ચ સાંદ્રતા પર સંતુલન સુધી પહોંચે છે (આકૃતિ 2b). સરેરાશ મિટોકોન્ડ્રિયા વોલ્યુમ 3 અને 5 mM PPA બંને પર યથાવત રહ્યું, જે દર્શાવે છે કે મિટોકોન્ડ્રિયા નેટવર્કની અખંડિતતા સાચવવામાં આવી હતી (આકૃતિ 2d). આ ગતિશીલ માઇટોકોન્ડ્રીયલ નેટવર્ક્સની હળવા મેટાબોલિક તણાવનો પ્રતિભાવ આપવા અને નેટવર્ક ફ્રેગમેન્ટેશન કર્યા વિના હોમિયોસ્ટેસિસને અસરકારક રીતે જાળવવાની ક્ષમતાને પ્રતિબિંબિત કરે છે. 3 mM PPA પર, વિભાજનમાં વધારો નવા સંતુલનમાં સંક્રમણને પ્રોત્સાહન આપવા માટે પૂરતો છે, પરંતુ PPA ની ઉચ્ચ સાંદ્રતા દ્વારા પ્રેરિત તણાવના પ્રતિભાવમાં વધુ ગહન ગતિ પુનઃનિર્માણ જરૂરી છે.
બંને PPA તણાવ સાંદ્રતા પર મિટોકોન્ડ્રિયાની સંખ્યામાં વધારો થયો, પરંતુ સરેરાશ મિટોકોન્ડ્રિયાના જથ્થામાં નોંધપાત્ર ફેરફાર થયો નહીં (આકૃતિ 2c). આ બાયોજેનેસિસમાં વધારો અથવા વિભાજનમાં વધારો થવાને કારણે હોઈ શકે છે; જો કે, સરેરાશ મિટોકોન્ડ્રિયાના જથ્થામાં નોંધપાત્ર ઘટાડો ન થયો હોય તો, બાયોસિન્થેસિસમાં વધારો થવાની શક્યતા વધુ છે. જો કે, આકૃતિ 2 માંનો ડેટા બે વળતર આપતી પદ્ધતિઓના અસ્તિત્વને સમર્થન આપે છે: મિટોકોન્ડ્રિયાના વિભાજનના અપરેગ્યુલેશન સાથે સુસંગત વિભાજન ઘટનાઓની સંખ્યામાં વધારો, અને મિટોકોન્ડ્રિયાના બાયોજેનેસિસ સાથે સુસંગત ઘટનાઓની સંખ્યામાં વધારો. આખરે, હળવા તાણ માટે ગતિશીલ વળતરમાં વિભાજન, ફ્યુઝન, બાયોજેનેસિસ અને મિટોફેજીનો સમાવેશ થાય છે. જોકે અગાઉના લેખકોએ દર્શાવ્યું છે કે PPA મિટોસિસ30,39 અને મિટોફેજી29 ને વધારે છે, અમે PPA ના પ્રતિભાવમાં મિટોકોન્ડ્રિયાના વિભાજન અને ફ્યુઝન ગતિશીલતાના પુનઃનિર્માણ માટે પુરાવા પ્રદાન કરીએ છીએ. આ ડેટા TEM દ્વારા અવલોકન કરાયેલ મોર્ફોલોજિકલ ફેરફારોની પુષ્ટિ કરે છે અને PPA-પ્રેરિત મિટોકોન્ડ્રિયાના ડિસફંક્શન સાથે સંકળાયેલ પદ્ધતિઓમાં વધુ સમજ આપે છે.
TEM કે MEL વિશ્લેષણમાંથી કોઈએ પણ અવલોકન કરાયેલા મોર્ફોલોજિકલ ફેરફારોને લગતા જનીન નિયમનકારી મિકેનિઝમ્સના સીધા પુરાવા આપ્યા ન હોવાથી, અમે મિટોકોન્ડ્રીયલ ચયાપચય, બાયોજેનેસિસ અને ગતિશીલતામાં સામેલ જનીનોની RNA અભિવ્યક્તિની તપાસ કરી. cMYC પ્રોટો-ઓન્કોજીન એ મિટોકોન્ડ્રીયા, ગ્લાયકોલિસિસ, એમિનો એસિડ અને ફેટી એસિડ ચયાપચય40 ના નિયમનમાં સામેલ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળ છે. વધુમાં, cMYC મિટોકોન્ડ્રીયલ ટ્રાન્સક્રિપ્શન, ટ્રાન્સલેશન અને જટિલ એસેમ્બલીમાં સામેલ લગભગ 600 મિટોકોન્ડ્રીયલ જનીનોની અભિવ્યક્તિને નિયંત્રિત કરવા માટે જાણીતું છે, જેમાં NRF1 અને TFAM41નો સમાવેશ થાય છે. NRF1 અને TFAM એ મિટોસિસના બે કેન્દ્રીય નિયમનકારો છે, જે mtDNA પ્રતિકૃતિને સક્રિય કરવા માટે PGC-1α ના ડાઉનસ્ટ્રીમમાં કાર્ય કરે છે. આ માર્ગ cAMP અને AMPK સિગ્નલિંગ દ્વારા સક્રિય થાય છે અને ઊર્જા ખર્ચ અને મેટાબોલિક તણાવ પ્રત્યે સંવેદનશીલ છે. અમે મિટોકોન્ડ્રીયલ બાયોજેનેસિસના રેડોક્સ નિયમનકાર NFE2L2 ની પણ તપાસ કરી, જેથી PPA ની અસરો ઓક્સિડેટીવ તણાવ દ્વારા મધ્યસ્થી થઈ શકે છે કે કેમ તે નક્કી કરી શકાય.
NFE2L2 અભિવ્યક્તિ યથાવત રહી હોવા છતાં, 3 mM અને 5 mM PPA (આકૃતિ 3a–c) સાથે 24 કલાકની સારવાર પછી અમને cMYC, NRF1 અને TFAM ની અભિવ્યક્તિમાં સતત ડોઝ-આધારિત ઘટાડો જોવા મળ્યો. cMYC અભિવ્યક્તિનું ડાઉનરેગ્યુલેશન અગાઉ મિટોકોન્ડ્રીયલ તણાવ42 ના પ્રતિભાવ તરીકે નોંધાયું છે, અને તેનાથી વિપરીત, cMYC અભિવ્યક્તિનું ડાઉનરેગ્યુલેશન મિટોકોન્ડ્રીયલ ચયાપચય, નેટવર્ક કનેક્ટિવિટી અને મેમ્બ્રેન ધ્રુવીકરણ43 ને રિમોડેલિંગ કરીને મિટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનનું કારણ બની શકે છે. રસપ્રદ વાત એ છે કે, cMYC મિટોકોન્ડ્રીયલ વિભાજન અને ફ્યુઝન42,43 ના નિયમનમાં પણ સામેલ છે અને કોષ વિભાજન44 દરમિયાન DRP1 ફોસ્ફોરાયલેશન અને મિટોકોન્ડ્રીયલ સ્થાનિકીકરણ વધારવા માટે જાણીતું છે, તેમજ ન્યુરોનલ સ્ટેમ સેલ્સમાં મિટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજિકલ રિમોડેલિંગમાં મધ્યસ્થી કરે છે45. ખરેખર, cMYC-ઉણપવાળા ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ્સ PPA43 તણાવ દ્વારા પ્રેરિત ફેરફારો સાથે સુસંગત, ઘટાડેલા મિટોકોન્ડ્રીયલ કદ દર્શાવે છે. આ ડેટા cMYC અને મિટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતા વચ્ચે એક રસપ્રદ પરંતુ હજુ સુધી અસ્પષ્ટ સંબંધ દર્શાવે છે, જે PPA તણાવ-પ્રેરિત રિમોડેલિંગના ભાવિ અભ્યાસ માટે એક રસપ્રદ લક્ષ્ય પૂરું પાડે છે.
NRF1 અને TFAM માં ઘટાડો એ એક મહત્વપૂર્ણ ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ એક્ટિવેટર તરીકે cMYC ની ભૂમિકા સાથે સુસંગત છે. આ ડેટા માનવ કોલોન કેન્સર કોષોમાં અગાઉના અભ્યાસો સાથે પણ સુસંગત છે જે દર્શાવે છે કે PPA એ 22 કલાકે NRF1 mRNA અભિવ્યક્તિ ઘટાડી હતી, જે ATP અવક્ષય સાથે સંકળાયેલી હતી અને ROS46 માં વધારો થયો હતો. આ લેખકોએ એમ પણ અહેવાલ આપ્યો હતો કે TFAM અભિવ્યક્તિ 8.5 કલાકે વધી હતી પરંતુ 22 કલાકે બેઝલાઇન સ્તર પર પાછી આવી હતી. તેનાથી વિપરીત, કિમ એટ અલ. (2019) એ દર્શાવ્યું હતું કે SH-SY5Y કોષોમાં 4 કલાકના PPA તણાવ પછી TFAM mRNA અભિવ્યક્તિ નોંધપાત્ર રીતે ઘટી હતી; જો કે, 72 કલાક પછી, TFAM પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ નોંધપાત્ર રીતે વધી હતી અને mtDNA નકલ સંખ્યામાં નોંધપાત્ર વધારો થયો હતો. આમ, 24 કલાક પછી અમે અવલોકન કરેલા મિટોકોન્ડ્રિયા બાયોજેનેસિસ જનીનોની સંખ્યામાં ઘટાડો એ શક્યતાને બાકાત રાખતો નથી કે મિટોકોન્ડ્રિયાની સંખ્યામાં વધારો અગાઉના સમય બિંદુઓ પર બાયોજેનેસિસના સક્રિયકરણ સાથે સંકળાયેલ છે. અગાઉના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે PPA 4 કલાક 30 મિનિટે SH-SY5Y કોષોમાં PGC-1α mRNA અને પ્રોટીનને નોંધપાત્ર રીતે અપરેગ્યુલેટ કરે છે, જ્યારે પ્રોપિયોનિક એસિડ 12 કલાક 39 મિનિટે PGC-1α દ્વારા વાછરડાના હિપેટોસાઇટ્સમાં મિટોકોન્ડ્રીયલ બાયોજેનેસિસને વધારે છે. રસપ્રદ વાત એ છે કે, PGC-1α એ NRF1 અને TFAM નું ડાયરેક્ટ ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ રેગ્યુલેટર જ નથી, પરંતુ ફિશન અને ફ્યુઝન47 ને નિયંત્રિત કરીને MFN2 અને DRP1 ની પ્રવૃત્તિને નિયંત્રિત કરવાનું પણ દર્શાવવામાં આવ્યું છે. એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ PPA દ્વારા પ્રેરિત મિટોકોન્ડ્રીયલ વળતર પ્રતિભાવોને નિયંત્રિત કરતી પદ્ધતિઓના નજીકના જોડાણને પ્રકાશિત કરે છે. વધુમાં, અમારો ડેટા PPA તણાવ હેઠળ બાયોજેનેસિસ અને ચયાપચયના ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ નિયમનના નોંધપાત્ર ડિસરેગ્યુલેશનને પ્રતિબિંબિત કરે છે.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 અને DRP1 જનીનો મિટોકોન્ડ્રીયલ ફિશન, ફ્યુઝન અને ડાયનેમિક્સ 37,48,49 ના કેન્દ્રીય નિયમનકારોમાં શામેલ છે. મિટોકોન્ડ્રીયલ ડાયનેમિક્સ માં ઘણા અન્ય જનીનો સામેલ છે, જોકે, STOML2, OPA1 અને MFN2 અગાઉ ASD કોહોર્ટ્સમાં વિભેદક રીતે મેથિલેટેડ હોવાનું જાણવા મળ્યું છે, 16 અને ઘણા સ્વતંત્ર અભ્યાસોએ મિટોકોન્ડ્રીયલ તણાવના પ્રતિભાવમાં આ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોમાં ફેરફારોની જાણ કરી છે50,51. 52. OPA1 અને STOML2 બંનેની અભિવ્યક્તિ 3 mM અને 5 mM PPA સારવાર દ્વારા નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડવામાં આવી હતી (આકૃતિ 3e, f). OPA1 એ MFN1 અને 2 સાથે સીધી ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા મિટોકોન્ડ્રીયલ ફ્યુઝનના શાસ્ત્રીય નિયમનકારોમાંનું એક છે અને ક્રિસ્ટા રિમોડેલિંગ અને મિટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજીમાં ભૂમિકા ભજવે છે53. મિટોકોન્ડ્રીયલ ડાયનેમિક્સ માં STOML2 ની ચોક્કસ ભૂમિકા અસ્પષ્ટ રહે છે, પરંતુ પુરાવા સૂચવે છે કે તે મિટોકોન્ડ્રીયલ ફ્યુઝન, બાયોજેનેસિસ અને મિટોફેજીમાં ભૂમિકા ભજવે છે.
STOML2 મિટોકોન્ડ્રીયલ શ્વસન જોડાણ જાળવવા અને શ્વસન સાંકળ સંકુલ 54,55 ની રચનામાં સામેલ છે અને કેન્સર કોષોની મેટાબોલિક લાક્ષણિકતાઓમાં ગંભીર ફેરફાર કરે છે તેવું દર્શાવવામાં આવ્યું છે56. અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે STOML2 BAN અને કાર્ડિયોલિપિન 55, 57, 58 સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા મિટોકોન્ડ્રીયલ મેમ્બ્રેન સંભવિતતા અને બાયોજેનેસિસને પ્રોત્સાહન આપે છે. વધુમાં, સ્વતંત્ર અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે STOML2 અને PINK1 વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા મિટોફેજીને નિયંત્રિત કરે છે59,60. નોંધનીય છે કે, STOML2 MFN2 સાથે સીધી ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે અને સ્થિર કરે છે અને OPA1 ડિગ્રેડેશન માટે જવાબદાર પ્રોટીઝને અટકાવીને લાંબા OPA1 આઇસોફોર્મ્સને સ્થિર કરવામાં પણ મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે53,61,62. PPA પ્રતિક્રિયાઓમાં જોવા મળતા STOML2 અભિવ્યક્તિમાં ઘટાડો આ ફ્યુઝન પ્રોટીનને યુબિક્વિટિન- અને પ્રોટીઝોમ-આધારિત માર્ગો48 દ્વારા ડિગ્રેડેશન માટે વધુ સંવેદનશીલ બનાવી શકે છે. PPA ના ગતિશીલ પ્રતિભાવમાં STOML2 અને OPA1 ની ચોક્કસ ભૂમિકા અસ્પષ્ટ હોવા છતાં, આ ફ્યુઝન જનીનોની અભિવ્યક્તિમાં ઘટાડો (આકૃતિ 3) વિભાજન અને ફ્યુઝન વચ્ચેના સંતુલનને વિક્ષેપિત કરી શકે છે અને મિટોકોન્ડ્રિયાના કદમાં ઘટાડો તરફ દોરી શકે છે (આકૃતિ 3). 1).
બીજી બાજુ, OPA1 પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ 24 કલાક પછી યથાવત રહી, જ્યારે PPA સારવાર પછી MFN1, MFN2 અથવા DRP1 ના mRNA અને પ્રોટીન સ્તરમાં નોંધપાત્ર ફેરફાર થયો નહીં (આકૃતિ 3g-i, આકૃતિ 4). આ સૂચવે છે કે માઇટોકોન્ડ્રીયલ ફ્યુઝન અને ફિશનમાં સામેલ આ પરિબળોના નિયમનમાં કોઈ ફેરફાર થયા નથી. જો કે, એ નોંધવું યોગ્ય છે કે આ ચાર જનીનોમાંથી દરેક પ્રોટીન પ્રવૃત્તિને નિયંત્રિત કરતા પોસ્ટટ્રાન્સક્રિપ્શનલ મોડિફિકેશન (PTMs) દ્વારા પણ નિયંત્રિત થાય છે. OPA1 માં આઠ વૈકલ્પિક સ્પ્લિસ વેરિઅન્ટ્સ છે જે બે અલગ અલગ આઇસોફોર્મ્સ 63 ઉત્પન્ન કરવા માટે મિટોકોન્ડ્રિયામાં પ્રોટીઓલિટીકલી વિભાજીત થાય છે. લાંબા અને ટૂંકા આઇસોફોર્મ્સ વચ્ચેનું સંતુલન આખરે માઇટોકોન્ડ્રીયલ ફ્યુઝન અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ નેટવર્ક 64 ની જાળવણીમાં OPA1 ની ભૂમિકા નક્કી કરે છે. DRP1 પ્રવૃત્તિ કેલ્શિયમ/કેલ્મોડ્યુલિન-આધારિત પ્રોટીન કિનેઝ II (CaMKII) ફોસ્ફોરાયલેશન દ્વારા નિયંત્રિત થાય છે, જ્યારે DRP1 ડિગ્રેડેશન યુબિક્વિટિનેશન અને SUMOylation65 દ્વારા નિયંત્રિત થાય છે. છેલ્લે, DRP1 અને MFN1/2 બંને GTPases છે, તેથી પ્રવૃત્તિ મિટોકોન્ડ્રિયા 66 માં GTP ઉત્પાદનના દરથી પ્રભાવિત થઈ શકે છે. તેથી, જોકે આ પ્રોટીનની અભિવ્યક્તિ સ્થિર રહે છે, આ અપરિવર્તિત પ્રોટીન પ્રવૃત્તિ અથવા સ્થાનિકીકરણને પ્રતિબિંબિત કરી શકતું નથી67,68. ખરેખર, હાલના PTM પ્રોટીન ભંડારો ઘણીવાર તીવ્ર તાણ પ્રતિભાવોમાં મધ્યસ્થી કરવા માટે જવાબદાર સંરક્ષણની પ્રથમ લાઇન તરીકે સેવા આપે છે. અમારા મોડેલમાં મધ્યમ મેટાબોલિક તણાવની હાજરીમાં, એવી શક્યતા છે કે PTM mRNA અથવા પ્રોટીન સ્તરે આ જનીનોના વધારાના સક્રિયકરણની જરૂર વગર મિટોકોન્ડ્રિયાની અખંડિતતાને પૂરતા પ્રમાણમાં પુનઃસ્થાપિત કરવા માટે ફ્યુઝન અને ફિશન પ્રોટીનની વધેલી પ્રવૃત્તિને પ્રોત્સાહન આપે છે.
એકસાથે લેવામાં આવે તો, ઉપરોક્ત ડેટા મિટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજીના જટિલ અને સમય-આધારિત નિયમન અને આ પદ્ધતિઓને સ્પષ્ટ કરવાના પડકારોને પ્રકાશિત કરે છે. જનીન અભિવ્યક્તિનો અભ્યાસ કરવા માટે, પ્રથમ માર્ગમાં ચોક્કસ લક્ષ્ય જનીનો ઓળખવા જરૂરી છે. જો કે, અમારા ડેટા દર્શાવે છે કે સમાન માર્ગમાં જનીનો સમાન તાણનો સમાન રીતે પ્રતિભાવ આપતા નથી. હકીકતમાં, અગાઉના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે સમાન માર્ગમાં વિવિધ જનીનો વિવિધ ટેમ્પોરલ પ્રતિભાવ પ્રોફાઇલ્સ પ્રદર્શિત કરી શકે છે30,46. વધુમાં, ત્યાં જટિલ પોસ્ટ-ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ મિકેનિઝમ્સ છે જે ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને જનીન કાર્ય વચ્ચેના સંબંધને વિક્ષેપિત કરે છે. પ્રોટીઓમિક અભ્યાસો PTM અને પ્રોટીન કાર્યની અસરમાં સમજ આપી શકે છે, પરંતુ તેઓ ઓછા-થ્રુપુટ પદ્ધતિઓ, ઉચ્ચ સિગ્નલ-ટુ-નોઇઝ રેશિયો અને નબળા રિઝોલ્યુશન સહિતના પડકારો પણ ઉભા કરે છે.
આ સંદર્ભમાં, TEM અને MEL નો ઉપયોગ કરીને માઇટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજીનો અભ્યાસ કરવાથી માઇટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતા અને કાર્ય વચ્ચેના સંબંધ અને તે રોગને કેવી રીતે પ્રભાવિત કરે છે તે અંગેના મૂળભૂત પ્રશ્નોના ઉકેલ માટે મોટી સંભાવના છે. સૌથી અગત્યનું, TEM માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શન અને ડાયનેમિક્સ51 ના કન્વર્જન્ટ એન્ડપોઇન્ટ તરીકે માઇટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજીને માપવા માટે સીધી પદ્ધતિ પૂરી પાડે છે. MEL ત્રિ-પરિમાણીય સેલ્યુલર વાતાવરણમાં ફિશન અને ફ્યુઝન ઘટનાઓને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવા માટે સીધી પદ્ધતિ પણ પૂરી પાડે છે, જે જનીન અભિવ્યક્તિમાં ફેરફારોની ગેરહાજરીમાં પણ ગતિશીલ માઇટોકોન્ડ્રીયલ રિમોડેલિંગનું પ્રમાણ નક્કી કરવાની મંજૂરી આપે છે. અહીં આપણે ગૌણ માઇટોકોન્ડ્રીયલ રોગોમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ ઇમેજિંગ તકનીકોની ઉપયોગિતાને પ્રકાશિત કરીએ છીએ. આ રોગો સામાન્ય રીતે તીવ્ર માઇટોકોન્ડ્રીયલ નુકસાનને બદલે માઇટોકોન્ડ્રીયલ નેટવર્ક્સના સૂક્ષ્મ રિમોડેલિંગ દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ ક્રોનિક હળવા મેટાબોલિક તણાવ દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે. જો કે, ક્રોનિક તણાવ હેઠળ માઇટોસિસ જાળવવા માટે જરૂરી માઇટોકોન્ડ્રીયલ વળતરના ગહન કાર્યાત્મક પરિણામો છે. ન્યુરોસાયન્સના સંદર્ભમાં, આ વળતર પદ્ધતિઓની વધુ સારી સમજ માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શન સાથે સંકળાયેલ પ્લેયોટ્રોપિક ન્યુરોપેથોલોજી વિશે મહત્વપૂર્ણ માહિતી પ્રદાન કરી શકે છે.
આખરે, અમારો ડેટા જનીન અભિવ્યક્તિ, પ્રોટીન ફેરફારો અને ન્યુરોનલ માઇટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતાને નિયંત્રિત કરતી પ્રોટીન પ્રવૃત્તિ વચ્ચેની જટિલ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓના કાર્યાત્મક પરિણામોને સમજવા માટે ઇમેજિંગ તકનીકોની ઉપયોગિતાને પ્રકાશિત કરે છે. અમે ASD ના માઇટોકોન્ડ્રીયલ ઘટકમાં સમજ મેળવવા માટે ન્યુરોનલ સેલ મોડેલમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનનું મોડેલ બનાવવા માટે PPA નો ઉપયોગ કર્યો. PPA સાથે સારવાર કરાયેલ SH-SY5Y કોષોએ માઇટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજીમાં ફેરફારો દર્શાવ્યા: માઇટોકોન્ડ્રીયા નાના અને ગોળાકાર બન્યા, અને TEM દ્વારા અવલોકન કરવામાં આવે ત્યારે ક્રિસ્ટીને નબળી રીતે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવ્યા. MEL વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે હળવા મેટાબોલિક તણાવના પ્રતિભાવમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ નેટવર્ક જાળવવા માટે આ ફેરફારો વિભાજન અને ફ્યુઝન ઘટનાઓમાં વધારો સાથે થાય છે. વધુમાં, PPA માઇટોકોન્ડ્રીયલ ચયાપચય અને હોમિયોસ્ટેસિસના ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ નિયમનને નોંધપાત્ર રીતે વિક્ષેપિત કરે છે. અમે cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, અને OPA1 ને PPA તણાવ દ્વારા વિક્ષેપિત મુખ્ય માઇટોકોન્ડ્રીયલ નિયમનકારો તરીકે ઓળખ્યા અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજી અને કાર્યમાં PPA-પ્રેરિત ફેરફારોને મધ્યસ્થી કરવામાં ભૂમિકા ભજવી શકે છે. જનીન અભિવ્યક્તિ અને પ્રોટીન પ્રવૃત્તિ, સ્થાનિકીકરણ અને અનુવાદ પછીના ફેરફારોમાં PPA-પ્રેરિત ટેમ્પોરલ ફેરફારોને વધુ સારી રીતે દર્શાવવા માટે ભવિષ્યના અભ્યાસોની જરૂર છે. અમારા ડેટા મિટોકોન્ડ્રીયલ તણાવ પ્રતિભાવમાં મધ્યસ્થી કરતી નિયમનકારી પદ્ધતિઓની જટિલતા અને પરસ્પર નિર્ભરતા પર ભાર મૂકે છે અને વધુ લક્ષિત યાંત્રિક અભ્યાસ માટે TEM અને અન્ય ઇમેજિંગ તકનીકોની ઉપયોગિતા દર્શાવે છે.
SH-SY5Y સેલ લાઇન (ECACC, 94030304-1VL) સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ પાસેથી ખરીદવામાં આવી હતી. SH-SY5Y કોષોને ડલ્બેકોના સંશોધિત ઇગલના માધ્યમ/F-12 પોષક મિશ્રણ (DMEM/F-12) અને L-ગ્લુટામાઇન (SC09411, સાયનસેલ) માં 25 cm2 ફ્લાસ્કમાં ઉગાડવામાં આવ્યા હતા જેમાં 20% ફેટલ બોવાઇન સીરમ (FBS) (10493106, થર્મોફિશર સાયન્ટિફિક) અને 1% પેનિસિલિન-સ્ટ્રેપ્ટોમાસીન (P4333-20ML, સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) 37 °C, 5% CO2 પર પૂરક બનાવવામાં આવ્યા હતા. કોષોને 0.05% ટ્રિપ્સિન-EDTA (15400054, થર્મોફિશર સાયન્ટિફિક) નો ઉપયોગ કરીને 80% સંગમ સુધી સબકલ્ચર કરવામાં આવ્યા હતા, 300 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા અને લગભગ 7 × 105 કોષો/મિલીની ઘનતા પર પ્લેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા. બધા પ્રયોગો 19-22 પેસેજ વચ્ચે અવિભાજિત SH-SY5Y કોષો પર કરવામાં આવ્યા હતા. PPA ને NaP તરીકે આપવામાં આવે છે. NaP પાવડર (CAS નં. 137-40-6, રાસાયણિક સૂત્ર C3H5NaO2, P5436-100G, સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) ને ગરમ MilliQ પાણીમાં 1 M ની સાંદ્રતા સુધી ઓગાળો અને 4 °C પર સંગ્રહિત કરો. સારવારના દિવસે, આ દ્રાવણને 1 M PPA થી 3 mM અને 5 mM PPA સાથે સીરમ-મુક્ત માધ્યમ (DMEM/F-12 L-ગ્લુટામાઇન સાથે) માં પાતળું કરો. બધા પ્રયોગો માટે સારવાર સાંદ્રતા કોઈ PPA (0 mM, નિયંત્રણ), 3 mM, અને 5 mM PPA નહોતી. પ્રયોગો ઓછામાં ઓછા ત્રણ જૈવિક પ્રતિકૃતિઓમાં હાથ ધરવામાં આવ્યા હતા.
SH-SY5Y કોષોને 5.5 × 105 કોષો/મિલીના દરે 25 cm5 ફ્લાસ્કમાં સીડ કરવામાં આવ્યા હતા અને 24 કલાક સુધી ઉગાડવામાં આવ્યા હતા. 24 કલાકના ઇન્ક્યુબેશન પહેલાં ફ્લાસ્કમાં PPA ટ્રીટમેન્ટ ઉમેરવામાં આવી હતી. સામાન્ય સસ્તન પેશી સબકલ્ચર પ્રોટોકોલ (ઉપર વર્ણવેલ) ને અનુસરીને કોષ ગોળીઓ એકત્રિત કરો. કોષ ગોળીઓને 100 µl 2.5% ગ્લુટારાલ્ડીહાઇડ, 1× PBS માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરો અને પ્રક્રિયા થાય ત્યાં સુધી 4 °C પર સ્ટોર કરો. SH-SY5Y કોષોને કોષોને પેલેટ કરવા અને 2.5% ગ્લુટારાલ્ડીહાઇડ, 1× PBS દ્રાવણ દૂર કરવા માટે સંક્ષિપ્તમાં સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા. નિસ્યંદિત પાણીમાં તૈયાર કરેલા 4% એગારોઝ જેલમાં કાંપને ફરીથી સસ્પેન્ડ કરો (એગારોઝ અને કાંપના જથ્થાનો ગુણોત્તર 1:1 છે). એગારોઝના ટુકડાઓને સપાટ પ્લેટો પર ગ્રીડ પર મૂકવામાં આવ્યા હતા અને ઉચ્ચ-દબાણ ઠંડું થાય તે પહેલાં 1-હેક્સાડેસીન સાથે કોટેડ કરવામાં આવ્યા હતા. નમૂનાઓને -90°C પર 100% સૂકા એસીટોનમાં 24 કલાક માટે સ્થિર કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ તાપમાન -80°C સુધી વધારવામાં આવ્યું અને 1% ઓસ્મિયમ ટેટ્રોક્સાઇડ અને 0.1% ગ્લુટારાલ્ડીહાઇડનું દ્રાવણ ઉમેરવામાં આવ્યું. નમૂનાઓને -80°C પર 24 કલાક માટે સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા. આ પછી, તાપમાન ધીમે ધીમે ઘણા દિવસો સુધી ઓરડાના તાપમાને વધારવામાં આવ્યું: –80°C થી –50°C સુધી 24 કલાક માટે, –30°C સુધી 24 કલાક માટે, –10°C સુધી 24 કલાક માટે અને અંતે ઓરડાના તાપમાને.
ક્રાયોજેનિક તૈયારી પછી, નમૂનાઓને રેઝિનથી ગર્ભિત કરવામાં આવ્યા હતા અને લેઇકા રીચર્ટ અલ્ટ્રાકટએસ અલ્ટ્રામાઇક્રોટોમ (લેઇકા માઇક્રોસિસ્ટમ્સ) નો ઉપયોગ કરીને અલ્ટ્રાથિન સેક્શન (~100 nm) બનાવવામાં આવ્યા હતા. સેક્શનને 2% યુરેનાઇલ એસિટેટ અને લીડ સાઇટ્રેટથી રંગવામાં આવ્યા હતા. 200 kV (લેબ6 ટ્રાન્સમીટર) પર કાર્યરત FEI ટેકનાઇ 20 ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપ (થર્મોફિશર (અગાઉ FEI), આઇન્ડહોવન, ધ નેધરલેન્ડ્સ) અને ટ્રાઇડિમ એનર્જી ફિલ્ટરથી સજ્જ ગેટન CCD કેમેરા (ગેટન, યુકે) નો ઉપયોગ કરીને નમૂનાઓનું અવલોકન કરવામાં આવ્યું હતું.
દરેક ટેકનિકલ પ્રતિકૃતિમાં, ઓછામાં ઓછી 24 સિંગલ સેલ છબીઓ મેળવવામાં આવી હતી, કુલ 266 છબીઓ. બધી છબીઓનું વિશ્લેષણ રિજન ઓફ ઇન્ટરેસ્ટ (ROI) મેક્રો અને મિટોકોન્ડ્રિયા મેક્રોનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. મિટોકોન્ડ્રિયલ મેક્રો પ્રકાશિત પદ્ધતિઓ 17,31,32 પર આધારિત છે અને ફિજી/ઇમેજજે69 માં TEM છબીઓની અર્ધ-સ્વચાલિત બેચ પ્રક્રિયાને મંજૂરી આપે છે. ટૂંકમાં: છબીને રોલિંગ બોલ બેકગ્રાઉન્ડ બાદબાકી (60 પિક્સેલ ત્રિજ્યા) અને FFT બેન્ડપાસ ફિલ્ટર (અનુક્રમે 60 અને 8 પિક્સેલ ઉપલા અને નીચલા સીમાઓનો ઉપયોગ કરીને) અને 5% ની ઓરિએન્ટેશન સહિષ્ણુતા સાથે ઊભી રેખા દમનનો ઉપયોગ કરીને ઉલટાવી અને ઉલટાવી દેવામાં આવે છે. પ્રોસેસ્ડ છબી મહત્તમ એન્ટ્રોપી અલ્ગોરિધમનો ઉપયોગ કરીને આપમેળે થ્રેશોલ્ડ થાય છે અને બાઈનરી માસ્ક જનરેટ થાય છે. કાચા TEM છબીઓમાં મેન્યુઅલી પસંદ કરેલા ROI સાથે સંકળાયેલ છબી પ્રદેશો કાઢવામાં આવ્યા હતા, જે મિટોકોન્ડ્રિયાને લાક્ષણિકતા આપે છે અને પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેન અને અન્ય ઉચ્ચ-કોન્ટ્રાસ્ટ પ્રદેશોને બાકાત રાખે છે. દરેક કાઢવામાં આવેલા ROI માટે, 600 પિક્સેલ કરતા મોટા દ્વિસંગી કણોનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું, અને Fiji/ImageJ ના બિલ્ટ-ઇન માપન કાર્યોનો ઉપયોગ કરીને કણ ક્ષેત્ર, પરિમિતિ, મુખ્ય અને ગૌણ અક્ષો, ફેરેટ વ્યાસ, ગોળાકારતા અને ગોળાકારતા માપવામાં આવી હતી. આ ડેટામાંથી Merrill, Flippo, and Strack (2017), ક્ષેત્રફળ 2, કણ પાસા ગુણોત્તર (મુખ્ય થી ગૌણ અક્ષ ગુણોત્તર), અને આકાર પરિબળ (FF) ની ગણતરી કરવામાં આવી હતી, જ્યાં FF = પરિમિતિ 2/4pi x ક્ષેત્રફળ. પેરામેટ્રિક સૂત્રની વ્યાખ્યા Merrill, Flippo, and Strack (2017) માં મળી શકે છે. ઉલ્લેખિત મેક્રો GitHub પર ઉપલબ્ધ છે (ડેટા ઉપલબ્ધતા નિવેદન જુઓ). સરેરાશ, PPA સારવાર દીઠ આશરે 5,600 કણોનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું, કુલ આશરે 17,000 કણો માટે (ડેટા બતાવેલ નથી).
SH-SH5Y કોષોને 8-ચેમ્બર કલ્ચર ડીશ (થર્મોફિશર, #155411) માં મૂકવામાં આવ્યા હતા જેથી રાતોરાત સંલગ્નતા રહે અને પછી TMRE 1:1000 (થર્મોફિશર, #T669) અને Hoechst 33342 1:200 (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ, H6024) સાથે ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા. રંગકામ. 10 મિનિટના વાતાવરણમાં 405 nm અને 561 nm લેસરનો ઉપયોગ કરીને છબીઓ મેળવવામાં આવી હતી, અને કાચી છબીઓ z-સ્ટેક્સ તરીકે મેળવવામાં આવી હતી જેમાં 10 ઇમેજ માઇક્રોગ્રાફ્સ હતા જેમાં 12 અનુગામી સમય બિંદુઓ પર છબી ફ્રેમ્સ વચ્ચે 0.2 μm ના az સ્ટેપ સાથે. LCI પ્લાન એપોક્રોમેટ 100x/1.4 ઓઇલ DIC M27 લેન્સનો ઉપયોગ કરીને કાર્લ ઝીસ LSM780 ELYRA PS.1 સુપર-રિઝોલ્યુશન પ્લેટફોર્મ (કાર્લ ઝીસ, ઓબેરકોચેન, જર્મની) નો ઉપયોગ કરીને છબીઓ એકત્રિત કરવામાં આવી હતી. ફ્યુઝન અને ફિશન ઇવેન્ટ્સ, મિટોકોન્ડ્રીયલ સ્ટ્રક્ચર્સની સરેરાશ સંખ્યા અને સેલ દીઠ સરેરાશ મિટોકોન્ડ્રીયલ વોલ્યુમ માપવા માટે ImageJ માં અગાઉ વર્ણવેલ પાઇપલાઇન અને ImageJ પ્લગઇનનો ઉપયોગ કરીને છબીઓનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું33. MEL મેક્રો GitHub પર ઉપલબ્ધ છે (ડેટા ઉપલબ્ધતા નિવેદન જુઓ).
SH-SY5Y કોષોને સારવાર પહેલા 24 કલાક માટે છ-કુવા પ્લેટોમાં 0.3 × 106 કોષો/mL ની ઘનતા પર ઉગાડવામાં આવ્યા હતા. RNA ને Quick-RNA™ Miniprep પ્રોટોકોલ (ZR R1055, Zymo Research) નો ઉપયોગ કરીને થોડા ફેરફારો સાથે કાઢવામાં આવ્યું હતું: દૂર કરતા પહેલા દરેક કૂવામાં 300 μl RNA લિસિસ બફર ઉમેરો અને 30 μl DNase/RNase એલ્યુશન સાથે અંતિમ પગલા તરીકે દરેક નમૂનાનું લાઇસ કરો. -મુક્ત પાણી. બધા નમૂનાઓને NanoDrop ND-1000 UV-Vis સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટરનો ઉપયોગ કરીને જથ્થા અને ગુણવત્તા માટે તપાસવામાં આવ્યા હતા. સેલ લાઇસેટ્સમાંથી કુલ પ્રોટીન 200 μl RIPA લિસિસ બફરનો ઉપયોગ કરીને મેળવવામાં આવ્યું હતું, અને બ્રેડફોર્ડ પ્રોટીન એસે70 નો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીન સાંદ્રતાનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું.
ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર, કેટલાક ફેરફારો સાથે, ટેટ્રો™ cDNA સિન્થેસિસ કિટ (BIO-65043, મેરિડીયન બાયોસાયન્સ) નો ઉપયોગ કરીને cDNA સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. કુલ RNA ના 0.7 થી 1 μg નો ઉપયોગ કરીને 20-μl પ્રતિક્રિયાઓમાં cDNA ને સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. અગાઉ પ્રકાશિત પેપર્સ 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (કોષ્ટક S1) માંથી પ્રાઇમર્સ પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા અને ઇન્ટિગ્રેટેડ DNA ટેક્નોલોજીસના પ્રાઇમરક્વેસ્ટ ટૂલનો ઉપયોગ કરીને તેની સાથેના પ્રોબ્સ ડિઝાઇન કરવામાં આવ્યા હતા. રસ ધરાવતા બધા જનીનોને ન્યુક્લિયર B2M જનીનમાં સામાન્ય બનાવવામાં આવ્યા હતા. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC અને OPA1 ની જનીન અભિવ્યક્તિ RT-qPCR દ્વારા માપવામાં આવી હતી. માસ્ટર મિક્સમાં LUNA Taq પોલિમરેઝ (M3003L, ન્યૂ ઇંગ્લેન્ડ બાયોલેબ્સ), 10 μM ફોરવર્ડ અને રિવર્સ પ્રાઇમર્સ, cDNA અને PCR-ગ્રેડ પાણીનો સમાવેશ થતો હતો જેથી દરેક પ્રતિક્રિયા માટે 10 μL નું અંતિમ વોલ્યુમ મળે. TaqMan મલ્ટિપ્લેક્સ એસેસનો ઉપયોગ કરીને ડિવિઝન અને ફિશન જનીનો (DRP1, MFN1/2) ની અભિવ્યક્તિ માપવામાં આવી. લુના યુનિવર્સલ પ્રોબ qPCR માસ્ટર મિક્સ (M3004S, ન્યૂ ઇંગ્લેન્ડ બાયોલેબ્સ) નો ઉપયોગ ઉત્પાદકની સૂચનાઓ અનુસાર નાના ફેરફારો સાથે કરવામાં આવ્યો હતો. મલ્ટિપ્લેક્સ RT-qPCR માસ્ટર મિક્સમાં 1X LUNA Taq પોલિમરેઝ, 10 μM ફોરવર્ડ અને રિવર્સ પ્રાઇમર્સ, 10 μM પ્રોબ, cDNA અને PCR-ગ્રેડ પાણીનો સમાવેશ થાય છે, જેના પરિણામે દરેક પ્રતિક્રિયા માટે 20 μL નું અંતિમ વોલ્યુમ મળે છે. RT-qPCR રોટર-જીન Q 6-પ્લેક્સ (QIAGEN RG—સીરીયલ નંબર: R0618110) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. સાયકલિંગની સ્થિતિઓ કોષ્ટક S1 માં બતાવવામાં આવી છે. બધા cDNA નમૂનાઓને ત્રિપુટીમાં વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યા હતા અને દસ ગણા મંદનની શ્રેણીનો ઉપયોગ કરીને એક પ્રમાણભૂત વળાંક બનાવવામાં આવ્યો હતો. ડેટા પુનઃઉત્પાદનક્ષમતા30,72 સુનિશ્ચિત કરવા માટે ચક્ર થ્રેશોલ્ડ માનક વિચલન (Ct) >0.5 ધરાવતા ત્રિપુટી નમૂનાઓમાં આઉટલિયર્સને વિશ્લેષણમાંથી દૂર કરવામાં આવ્યા હતા. સંબંધિત જનીન અભિવ્યક્તિની ગણતરી 2-ΔΔCt79 પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી.
પ્રોટીન નમૂનાઓ (60 μg) ને 2:1 ગુણોત્તરમાં લેમ્લી લોડિંગ બફર સાથે મિશ્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને 12% રંગહીન પ્રોટીન જેલ (બાયો-રેડ #1610184) પર ચલાવવામાં આવ્યા હતા. ટ્રાન્સ-બ્લોટ ટર્બો સિસ્ટમ (#170-4155, બાયો-રેડ) નો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીનને PVDF (પોલિવિનાઇલિડેન ફ્લોરાઇડ) પટલ (#170-84156, બાયો-રેડ) માં ટ્રાન્સફર કરવામાં આવ્યા હતા. પટલને 48 કલાક માટે યોગ્ય પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ (OPA1, MFN1, MFN2, અને DRP1) (પાતળું 1:1000) સાથે અવરોધિત કરવામાં આવ્યું હતું, ત્યારબાદ 1 કલાક માટે ગૌણ એન્ટિબોડીઝ (1:10,000) સાથે ઇન્ક્યુબેશન કરવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ ક્લેરિટી વેસ્ટર્ન ECL સબસ્ટ્રેટ (#170-5061, બાયો-રેડ) નો ઉપયોગ કરીને પટલની છબી લેવામાં આવી હતી અને બાયો-રેડ કેમીડોક MP સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને રેકોર્ડ કરવામાં આવી હતી. વેસ્ટર્ન બ્લોટ વિશ્લેષણ માટે ઇમેજલેબ વર્ઝન 6.1 નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. મૂળ જેલ અને બ્લોટ આકૃતિ S1 માં દર્શાવેલ છે. એન્ટિબોડી માહિતી કોષ્ટક S2 માં આપવામાં આવી છે.
ડેટા સેટ્સને ઓછામાં ઓછા ત્રણ સ્વતંત્ર નમૂનાઓના સરેરાશ (SEM) ની સરેરાશ અને પ્રમાણભૂત ભૂલ તરીકે રજૂ કરવામાં આવે છે. ગૌસીયન વિતરણ અને સમાન પ્રમાણભૂત વિચલનો ધારણ કરતા પહેલા અને વિશ્લેષણ સાથે આગળ વધતા પહેલા શેપિરો-વિલ્ક્સ પરીક્ષણ (જ્યાં સુધી અન્યથા જણાવ્યું ન હોય) નો ઉપયોગ કરીને ડેટા સેટનું સામાન્યતા માટે પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ફિશરના MEL LSD (p < 0.05), એક-માર્ગી ANOVA (સારવાર વિરુદ્ધ નિયંત્રણ સરેરાશ), અને ડનેટના બહુવિધ સરખામણી પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને ડેટા સેટનું વિશ્લેષણ કરવા ઉપરાંત મહત્વ નક્કી કરવા માટે (p < 0.05). ગ્રાફમાં નોંધપાત્ર p મૂલ્યો *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યા છે. બધા આંકડાકીય વિશ્લેષણ અને ગ્રાફ ગ્રાફપેડ પ્રિઝમ 9.4.0 નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યા હતા અને જનરેટ કરવામાં આવ્યા હતા.
TEM ઇમેજ વિશ્લેષણ માટે Fiji/ImageJ મેક્રો GitHub પર સાર્વજનિક રીતે ઉપલબ્ધ છે: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Mitochondrial Event Locator (MEL) મેક્રો GitHub પર સાર્વજનિક રીતે ઉપલબ્ધ છે: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
મેઇલિયાના એ., દેવી એનએમ અને વિજયા એ. મિટોકોન્ડ્રિયા: ચયાપચય, હોમિયોસ્ટેસિસ, તણાવ, વૃદ્ધત્વ અને એપિજેનેટિક્સના મુખ્ય નિયમનકારો. ઇન્ડોનેશિયન. બાયોમેડિકલ સાયન્સ. જે. 13, 221–241 (2021).
બેન-શાચર, ડી. સ્કિઝોફ્રેનિયામાં બહુપક્ષીય માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શન, શક્ય રોગવિજ્ઞાનવિષયક લક્ષ્ય તરીકે જટિલ I. સ્કિઝોફ્રેનિયા. સંસાધન. 187, 3–10 (2017).
બોસ, એ. અને બીલ, એમએફ પાર્કિન્સન રોગમાં મિટોકોન્ડ્રિયા ડિસફંક્શન. જે. ન્યુરોકેમિસ્ટ્રી. 139, 216–231 (2016).
શર્મા વીકે, સિંઘ ટીજી અને મહેતા વી. તણાવયુક્ત માઇટોકોન્ડ્રિયા: અલ્ઝાઇમર રોગમાં આક્રમણના લક્ષ્યો. મિટોકોન્ડ્રિયા 59, 48–57 (2021).
બેલેંગુઅર પી., ડુઆર્ટે જેએમએન, શુક પીએફ અને ફેરેરા જીકે મિટોકોન્ડ્રિયા અને મગજ: બાયોએનર્જેટિક્સ અને વધુ. ન્યુરોટોક્સિન. સંસાધન. 36, 219–238 (2019).
રંગરાજુ, વી. એટ અલ. પ્લેયોટ્રોપિક માઇટોકોન્ડ્રિયા: ન્યુરોનલ વિકાસ અને રોગ પર માઇટોકોન્ડ્રિયાની અસર. જે. ન્યુરોસાયન્સ. 39, 8200–8208 (2019).
કાર્ડાનો-રામોસ, સી. અને મોરાઈસ, વી.એ. ન્યુરોન્સમાં મિટોકોન્ડ્રિયલ બાયોજેનેસિસ: કેવી રીતે અને ક્યાં. આંતરરાષ્ટ્રીયતા. જે. મોહર. ધ સાયન્સ. 22, 13059 (2021).
યુ, આર., લેન્ડાહલ, યુ., નિસ્ટર, એમ. અને ઝાઓ, જે. સસ્તન પ્રાણીઓના માઇટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતાનું નિયમન: તકો અને પડકારો. ફ્રન્ટ. અંતઃસ્ત્રાવી. (લૌઝેન) 11, 374 (2020).
ખાચો, એમ. અને સ્લેક, આરએસ ન્યુરોજેનેસિસના નિયમનમાં મિટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતા: વિકાસશીલ મગજથી પુખ્ત વયના મગજ સુધી. વિકાસ. ગતિશીલ. 247, 47–53 (2018).