હાલનું *હાલનું સરનામું: કોલોન ૫૦૯૩૧, જર્મની, કોલોન એક્સેલન્સ ક્લસ્ટર રિસર્ચ ઓન સેલ્યુલર સ્ટ્રેસ રિસ્પોન્સ ઇન એજિંગ-સંબંધિત રોગો (CECAD).
મિટોકોન્ડ્રીયલ રોગોના ન્યુરોડિજનરેશનને ઉલટાવી શકાય તેવું માનવામાં આવે છે કારણ કે ચેતાકોષોની મેટાબોલિક પ્લાસ્ટિસિટી મર્યાદિત છે, પરંતુ શરીરમાં ચેતાકોષીય ચયાપચયની કોષ સ્વાયત્તતા પર મિટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનની અસર નબળી રીતે સમજી શકાય છે. અહીં, અમે પુર્કિન્જે ન્યુરોન્સના કોષ-વિશિષ્ટ પ્રોટીઓમનો પરિચય આપીએ છીએ જે પ્રગતિશીલ OXPHOS ઉણપ સાથે વિક્ષેપિત માઇટોકોન્ડ્રીયલ ફ્યુઝન ગતિશીલતાને કારણે થાય છે. અમે જોયું કે માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શને પ્રોટીઓમિક્સના ક્ષેત્રમાં ગહન પરિવર્તન લાવ્યું, જે આખરે કોષ મૃત્યુ પહેલાં ચોક્કસ મેટાબોલિક કાર્યક્રમોના ક્રમિક સક્રિયકરણ તરફ દોરી ગયું. અણધારી રીતે, અમે પાયરુવેટ કાર્બોક્સિલેઝ (PCx) અને અન્ય એન્ટિ-એજિંગ ઉત્સેચકોનું સ્પષ્ટ ઇન્ડક્શન નક્કી કર્યું જે TCA ચક્રના મધ્યવર્તીઓને પૂરક બનાવે છે. PCx ના અવરોધથી ઓક્સિડેટીવ તણાવ અને ન્યુરોડિજનરેશનમાં વધારો થયો, જે દર્શાવે છે કે OXPHOS ના અભાવવાળા ચેતાકોષોમાં એથરોસ્ક્લેરોસિસનો રક્ષણાત્મક પ્રભાવ છે. ટર્મિનલી ડિજનરેટેડ ચેતાકોષોમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ ફ્યુઝનની પુનઃસ્થાપના આ મેટાબોલિક લાક્ષણિકતાઓને સંપૂર્ણપણે ઉલટાવી દે છે, જેનાથી કોષ મૃત્યુને અટકાવે છે. અમારા તારણો અગાઉ અજાણ્યા માર્ગોને ઓળખે છે જે માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનને સ્થિતિસ્થાપકતા આપે છે અને દર્શાવે છે કે રોગના અંતિમ તબક્કામાં પણ ન્યુરોડિજનરેશન ઉલટાવી શકાય છે.
માનવ માઇટોકોન્ડ્રીયલ રોગો સાથે સંકળાયેલા વ્યાપક ન્યુરોલોજીકલ લક્ષણો દ્વારા ચેતાકોષીય ઊર્જા ચયાપચય જાળવવામાં મિટોકોન્ડ્રિયાની મુખ્ય ભૂમિકા પર ભાર મૂકવામાં આવે છે. આમાંના મોટાભાગના રોગો જનીન પરિવર્તનને કારણે થાય છે જે માઇટોકોન્ડ્રીયલ જનીન અભિવ્યક્તિને નિયંત્રિત કરે છે (1, 2) અથવા માઇટોકોન્ડ્રીયલ ગતિશીલતા સાથે સંબંધિત જનીન વિનાશ, જે પરોક્ષ રીતે માઇટોકોન્ડ્રીયલ DNA (mtDNA) (3, 4) ની સ્થિરતાને અસર કરે છે. પ્રાણી મોડેલોમાં કાર્ય દર્શાવે છે કે આસપાસના પેશીઓમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનના પ્રતિભાવમાં, રૂઢિચુસ્ત મેટાબોલિક માર્ગો (5-7) સક્રિય થઈ શકે છે, જે આ જટિલ રોગોના પેથોજેનેસિસની ઊંડાણપૂર્વકની સમજ માટે મહત્વપૂર્ણ માહિતી પૂરી પાડે છે. તેનાથી વિપરીત, મગજ માઇટોકોન્ડ્રીયલ એડેનોસિન ટ્રાઇફોસ્ફેટ (ATP) ઉત્પાદનની સામાન્ય નિષ્ફળતાને કારણે થતા ચોક્કસ કોષ પ્રકારોના મેટાબોલિક ફેરફારોની આપણી સમજ મૂળભૂત છે (8), રોગનિવારક લક્ષ્યોને ઓળખવાની જરૂરિયાત પર ભાર મૂકે છે જેનો ઉપયોગ રોગને રોકવા અથવા અટકાવવા માટે થઈ શકે છે. ન્યુરોડિજનરેશન અટકાવો (9). માહિતીનો અભાવ એ હકીકત છે કે ચેતા કોષોને આસપાસના પેશીઓના કોષ પ્રકારોની તુલનામાં ખૂબ જ મર્યાદિત મેટાબોલિક સુગમતા હોવાનું વ્યાપકપણે માનવામાં આવે છે (10). આ કોષો ચેતાકોષોને સિનેપ્ટિક ટ્રાન્સમિશનને પ્રોત્સાહન આપવા અને ઇજા અને રોગની પરિસ્થિતિઓમાં પ્રતિક્રિયા આપવા માટે ચયાપચયના પુરવઠાનું સંકલન કરવામાં કેન્દ્રિય ભૂમિકા ભજવે છે તે જોતાં, મગજની પેશીઓની પડકારજનક પરિસ્થિતિઓમાં કોષ ચયાપચયને અનુકૂલિત કરવાની ક્ષમતા લગભગ ગ્લિયલ કોષો સુધી મર્યાદિત છે (11-14). વધુમાં, મગજની પેશીઓની સહજ સેલ્યુલર વિજાતીયતા ચોક્કસ ચેતાકોષીય પેટાજૂથોમાં થતા મેટાબોલિક ફેરફારોના અભ્યાસમાં મોટાભાગે અવરોધ ઉભો કરે છે. પરિણામે, ચેતાકોષોમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનના ચોક્કસ સેલ્યુલર અને મેટાબોલિક પરિણામો વિશે બહુ ઓછું જાણીતું છે.
મિટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનના મેટાબોલિક પરિણામોને સમજવા માટે, અમે મિટોકોન્ડ્રીયલ બાહ્ય પટલ ફ્યુઝન (Mfn2) ના વિનાશને કારણે થતા ન્યુરોડિજનરેશનના વિવિધ તબક્કામાં પુર્કિન્જે ન્યુરોન્સ (PNs) ને અલગ કર્યા. જોકે માનવોમાં Mfn2 પરિવર્તન વારસાગત મોટર સંવેદનાત્મક ન્યુરોપથીના એક સ્વરૂપ સાથે સંકળાયેલા છે જેને ચાર્કોટ-મેરી-ટૂથ પ્રકાર 2A (15) તરીકે ઓળખવામાં આવે છે, ઉંદરોમાં Mfn2 નો શરતી વિનાશ એ ઓક્સિડેશનનું એક જાણીતું ઇન્ડક્શન છે. ફોસ્ફોરીલેશન (OXPHOS) ડિસફંક્શન પદ્ધતિ. વિવિધ ન્યુરોનલ પેટાપ્રકારો (16-19) અને પરિણામી ન્યુરોડિજનરેટિવ ફેનોટાઇપ પ્રગતિશીલ ન્યુરોલોજીકલ લક્ષણો સાથે હોય છે, જેમ કે ચળવળ વિકૃતિઓ (18, 19) અથવા સેરેબેલર એટેક્સિયા (16). લેબલ-ફ્રી ક્વોન્ટિટેટિવ ​​(LFQ) પ્રોટીઓમિક્સ, મેટાબોલોમિક્સ, ઇમેજિંગ અને વાયરોલોજીકલ પદ્ધતિઓના સંયોજનનો ઉપયોગ કરીને, અમે બતાવીએ છીએ કે પ્રગતિશીલ ન્યુરોડિજનરેશન પાયરુવેટ કાર્બોક્સિલેઝ (PCx) અને ઉત્સેચકોની અભિવ્યક્તિમાં PNs ના ધમનીય સ્ક્લેરોસિસમાં સામેલ અન્ય પરિબળોને મજબૂત રીતે પ્રેરિત કરે છે. આ શોધની સુસંગતતા ચકાસવા માટે, અમે ખાસ કરીને Mfn2-ઉણપવાળા PNs માં PCx ની અભિવ્યક્તિને ડાઉન-રેગ્યુલેટ કરી, અને જોયું કે આ કામગીરી ઓક્સિડેટીવ તણાવને વધારે છે અને ન્યુરોડિજનરેશનને ઝડપી બનાવે છે, આમ સાબિત કરે છે કે એઝોસ્પર્મિયા કોષ મૃત્યુને મેટાબોલિક અનુકૂલનક્ષમતા આપે છે. MFN2 ની ગંભીર અભિવ્યક્તિ ગંભીર OXPHOS ઉણપ, મિટોકોન્ડ્રીયલ DNA ના મોટા પ્રમાણમાં વપરાશ અને દેખીતી રીતે તૂટેલા મિટોકોન્ડ્રીયલ નેટવર્ક સાથે ટર્મિનલ ડિજનરેશન PN ને સંપૂર્ણપણે બચાવી શકે છે, જે વધુ ભાર મૂકે છે કે ન્યુરોડિજનરેશનનું આ સ્વરૂપ કોષ મૃત્યુ પહેલાં રોગના અદ્યતન તબક્કામાં પણ પુનઃપ્રાપ્ત થઈ શકે છે.
Mfn2 નોકઆઉટ PNs માં માઇટોકોન્ડ્રિયાને કલ્પના કરવા માટે, અમે માઉસ સ્ટ્રેનનો ઉપયોગ કર્યો જે Cre-આધારિત માઇટોકોન્ડ્રિયાને પીળા ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન (YFP) (mtYFP) (20) Cre અભિવ્યક્તિને લક્ષ્ય બનાવવા દે છે અને વિવોમાં માઇટોકોન્ડ્રિયાલ મોર્ફોલોજીની તપાસ કરી. અમને જાણવા મળ્યું કે PNs માં Mfn2 જનીનનો વિનાશ માઇટોકોન્ડ્રિયાલ નેટવર્ક (આકૃતિ S1A) ના ક્રમિક વિભાજન તરફ દોરી જશે, અને સૌથી પહેલો ફેરફાર 3 અઠવાડિયાની ઉંમરે જોવા મળ્યો હતો. તેનાથી વિપરીત, PN કોષ સ્તરનું નોંધપાત્ર અધોગતિ, જેમ કે કેલ્બિન્ડિન ઇમ્યુનોસ્ટેનિંગના નુકસાન દ્વારા પુરાવા મળે છે, તે 12 અઠવાડિયાની ઉંમર સુધી શરૂ થયું ન હતું (આકૃતિ 1, A અને B). માઇટોકોન્ડ્રિયાલ મોર્ફોલોજીમાં પ્રારંભિક ફેરફારો અને ન્યુરોનલ મૃત્યુની દૃશ્યમાન શરૂઆત વચ્ચેનો સમય મેળ ખાતો ન હોવાથી અમને કોષ મૃત્યુ પહેલાં માઇટોકોન્ડ્રિયાલ ડિસફંક્શન દ્વારા થતા મેટાબોલિક ફેરફારોની તપાસ કરવા માટે પ્રેરિત કરવામાં આવ્યા. અમે YFP (YFP+)-એક્સપ્રેસિંગ PN (આકૃતિ 1C) ને અલગ કરવા માટે ફ્લોરોસેન્સ-એક્ટિવેટેડ સેલ સોર્ટિંગ (FACS)-આધારિત વ્યૂહરચના વિકસાવી છે, અને નિયંત્રણ ઉંદરોમાં (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), જેને હવે CTRL (આકૃતિ S1B) તરીકે ઓળખવામાં આવશે. YFP સિગ્નલની સંબંધિત તીવ્રતાના આધારે ગેટિંગ વ્યૂહરચનાનું ઑપ્ટિમાઇઝેશન અમને PNs ના YFP+ બોડી (YFPhigh) ને નોન-PNs (YFPneg) (આકૃતિ S1B) અથવા પુટેટિવ ​​ફ્લોરોસન્ટ એક્સન/ડેન્ડ્રિટિક ટુકડાઓ (YFPlow; આકૃતિ S1D, ડાબે), કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપ (આકૃતિ S1D, જમણે) દ્વારા પુષ્ટિ થયેલ છે. વર્ગીકૃત વસ્તીની ઓળખ ચકાસવા માટે, અમે LFQ પ્રોટીઓમિક્સ અને પછી મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ હાથ ધર્યું, અને જોયું કે YFPhigh અને YFPneg કોષો (આકૃતિ S1C) વચ્ચે સ્પષ્ટ વિભાજન છે. YFPhigh કોષોએ જાણીતા PNs માર્કર્સ (જેમ કે Calb1, Pcp2, Grid2 અને Itpr3) (21, 22) નું ચોખ્ખું સંવર્ધન દર્શાવ્યું, પરંતુ ચેતાકોષો અથવા અન્ય કોષ પ્રકારોમાં સામાન્ય રીતે વ્યક્ત કરાયેલ પ્રોટીનનું કોઈ સંવર્ધન નથી (આકૃતિ 1D). સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાં એકત્રિત કરાયેલ વર્ગીકૃત YFPhigh કોષોમાં નમૂનાઓ વચ્ચેની સરખામણીએ સહસંબંધ ગુણાંક> 0.9 દર્શાવ્યું, જે જૈવિક પ્રતિકૃતિઓ (આકૃતિ S1E) વચ્ચે સારી પ્રજનનક્ષમતા દર્શાવે છે. સારાંશમાં, આ ડેટાએ શક્ય PN ના તીવ્ર અને ચોક્કસ અલગતા માટેની અમારી યોજનાને માન્ય કરી. કારણ કે ઉપયોગમાં લેવાતી L7-cre ડ્રાઇવર સિસ્ટમ ડિલિવરી પછીના પ્રથમ અઠવાડિયામાં મોઝેક પુનઃસંયોજનને પ્રેરિત કરે છે (23), અમે CTRL માંથી ઉંદરોને દૂર કરવાનું શરૂ કર્યું અને શરતી (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) ચેતાકોષો એકત્રિત કર્યા. પુનઃસંયોજન પૂર્ણ થયા પછી, તેને 4 અઠવાડિયાની ઉંમરે Mfn2cKO કહેવામાં આવે છે. અંતિમ બિંદુ તરીકે, અમે 8 અઠવાડિયાની ઉંમર પસંદ કરી જ્યારે સ્પષ્ટ મિટોકોન્ડ્રીયલ ફ્રેગમેન્ટેશન (આકૃતિ 1B અને આકૃતિ S1A) હોવા છતાં PN સ્તર અકબંધ હતું. કુલ મળીને, અમે કુલ 3013 પ્રોટીનનું પ્રમાણ નક્કી કર્યું, જેમાંથી લગભગ 22% મિટોકોન્ડ્રીયલ પ્રોટીઓમ પર આધારિત MitoCarta 2.0 એનોટેશન પર આધારિત હતા જે મિટોકોન્ડ્રીયલ પ્રોટીઓમ તરીકે મિટોકોન્ડ્રીયલ (આકૃતિ 1E) (આકૃતિ 1E) (24) પર આધારિત હતા. અઠવાડિયા 8 માં કરવામાં આવેલા વિભેદક જનીન અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે બધા પ્રોટીનમાંથી માત્ર 10.5% માં નોંધપાત્ર ફેરફારો થયા હતા (આકૃતિ 1F અને આકૃતિ S1F), જેમાંથી 195 પ્રોટીન ડાઉન-રેગ્યુલેટેડ હતા અને 120 પ્રોટીન અપ-રેગ્યુલેટેડ હતા (આકૃતિ 1F). એ નોંધવું યોગ્ય છે કે આ ડેટા સેટનું "નવીન માર્ગ વિશ્લેષણ" દર્શાવે છે કે વિભેદક રીતે વ્યક્ત જનીનો મુખ્યત્વે ચોક્કસ મેટાબોલિક માર્ગોના પ્રતિબંધિત સમૂહ (આકૃતિ 1G) થી સંબંધિત છે. રસપ્રદ વાત એ છે કે, OXPHOS અને કેલ્શિયમ સિગ્નલિંગ સંબંધિત માર્ગોનું ડાઉનરેગ્યુલેશન ફ્યુઝન-ડેફિશિયન્ટ PN માં મિટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનના ઇન્ડક્શનની પુષ્ટિ કરે છે, પરંતુ અન્ય શ્રેણીઓ જેમાં મુખ્યત્વે એમિનો એસિડ ચયાપચયનો સમાવેશ થાય છે તે નોંધપાત્ર રીતે અપરેગ્યુલેટેડ છે, જે મિટોકોન્ડ્રીયલ PN માં થતા ચયાપચય સાથે સુસંગત છે. રિવાયરિંગ સતત ડિસફંક્શન છે.
(A) CTRL અને Mfn2cKO ઉંદરોના સેરેબેલર વિભાગોના પ્રતિનિધિ કોન્ફોકલ ફોટોગ્રાફ્સ જે PNs (કેલ્બિન્ડિન, ગ્રે) ના પ્રગતિશીલ નુકસાન દર્શાવે છે; ન્યુક્લીને DAPI સાથે કાઉન્ટરસ્ટેઇન કરવામાં આવ્યા હતા. (B) (A) નું પ્રમાણીકરણ (વિભિન્નતાનું એક-માર્ગી વિશ્લેષણ, ***P<0.001; n = ત્રણ ઉંદરોમાંથી 4 થી 6 વર્તુળો). (C) પ્રાયોગિક કાર્યપ્રવાહ. (D) પુર્કિન્જે (ટોચ) અને અન્ય કોષ પ્રકારો (મધ્યમ) માટે વિશિષ્ટ માર્કર્સનું હીટ મેપ વિતરણ. (E) વર્ગીકૃત PN માં ઓળખાતા મિટોકોન્ડ્રીયલ પ્રોટીનની સંખ્યા દર્શાવતો વેન ડાયાગ્રામ. (F) 8 અઠવાડિયામાં Mfn2cKO ચેતાકોષોમાં વિભેદક રીતે વ્યક્ત પ્રોટીનનો જ્વાળામુખી પ્લોટ (મહત્વપૂર્ણ કટ-ઓફ મૂલ્ય 1.3). (G) સર્જનાત્મકતા માર્ગ વિશ્લેષણ 8 અઠવાડિયા તરીકે વર્ગીકૃત Mfn2cKO PN માં પાંચ સૌથી મહત્વપૂર્ણ અપ-રેગ્યુલેશન (લાલ) અને ડાઉન-રેગ્યુલેશન (વાદળી) માર્ગો દર્શાવે છે. દરેક શોધાયેલ પ્રોટીનનું સરેરાશ અભિવ્યક્તિ સ્તર બતાવવામાં આવ્યું છે. ગ્રેસ્કેલ હીટ મેપ: સમાયોજિત P મૂલ્ય. ns, મહત્વપૂર્ણ નથી.
પ્રોટીઓમિક્સ ડેટા દર્શાવે છે કે કોમ્પ્લેક્સ I, ​​III અને IV ની પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ ધીમે ધીમે ઓછી થઈ ગઈ. કોમ્પ્લેક્સ I, ​​III અને IV બધામાં આવશ્યક mtDNA-એન્કોડેડ સબ્યુનિટ્સ હતા, જ્યારે કોમ્પ્લેક્સ II, જે ફક્ત ન્યુક્લિયર-કોડેડ હતું, તે મૂળભૂત રીતે અપ્રભાવિત હતું (આકૃતિ 2A અને આકૃતિ S2A). . પ્રોટીઓમિક્સ પરિણામો સાથે સુસંગત, સેરેબેલર ટીશ્યુ વિભાગોની ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રી દર્શાવે છે કે PN માં કોમ્પ્લેક્સ IV ના MTCO1 (માઇટોકોન્ડ્રીયલ સાયટોક્રોમ C ઓક્સિડેઝ સબ્યુનિટ 1) સબ્યુનિટ સ્તર ધીમે ધીમે ઘટ્યું (આકૃતિ 2B). mtDNA-એન્કોડેડ સબ્યુનિટ Mtatp8 નોંધપાત્ર રીતે ઘટ્યું (આકૃતિ S2A), જ્યારે ન્યુક્લિયર-એન્કોડેડ ATP સિન્થેઝ સબ્યુનિટનું સ્થિર-સ્થિતિ સ્તર યથાવત રહ્યું, જે mtDNA અભિવ્યક્તિ સ્થિર હોય ત્યારે જાણીતા સ્થિર ATP સિન્થેઝ સબએસેમ્બલી F1 કોમ્પ્લેક્સ સાથે સુસંગત છે. રચના સુસંગત છે. વિક્ષેપ (7). રીઅલ-ટાઇમ પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન (qPCR) દ્વારા સૉર્ટ કરેલા Mfn2cKO PNs માં mtDNA સ્તરના મૂલ્યાંકનથી mtDNA કોપી નંબરમાં ધીમે ધીમે ઘટાડો થયો હોવાની પુષ્ટિ થઈ. નિયંત્રણ જૂથની તુલનામાં, 8 અઠવાડિયાની ઉંમરે, mtDNA સ્તરના માત્ર 20% જ જાળવી રાખવામાં આવ્યા હતા (આકૃતિ 2C). આ પરિણામો સાથે સુસંગત, Mfn2cKO PNs ના કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપી સ્ટેનિંગનો ઉપયોગ DNA શોધવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો, જે મિટોકોન્ડ્રીયલ ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ (આકૃતિ 2D) ના સમય-આધારિત વપરાશ દર્શાવે છે. અમને જાણવા મળ્યું કે મિટોકોન્ડ્રીયલ પ્રોટીન ડિગ્રેડેશન અને સ્ટ્રેસ રિસ્પોન્સમાં સામેલ કેટલાક ઉમેદવારો જ અપ-રેગ્યુલેટેડ હતા, જેમાં Lonp1, Afg3l2 અને Clpx, અને OXPHOS જટિલ એસેમ્બલી પરિબળોનો સમાવેશ થાય છે. એપોપ્ટોસિસમાં સામેલ પ્રોટીનના સ્તરમાં કોઈ નોંધપાત્ર ફેરફાર જોવા મળ્યા નથી (આકૃતિ S2B). તેવી જ રીતે, અમને જાણવા મળ્યું કે કેલ્શિયમ પરિવહનમાં સામેલ મિટોકોન્ડ્રિયા અને એન્ડોપ્લાઝમિક રેટિક્યુલમ ચેનલોમાં માત્ર નાના ફેરફારો થયા છે (આકૃતિ S2C). વધુમાં, ઓટોફેજી-સંબંધિત પ્રોટીનના મૂલ્યાંકનમાં કોઈ નોંધપાત્ર ફેરફારો જોવા મળ્યા નથી, જે ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રી અને ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી (આકૃતિ S3) દ્વારા વિવોમાં અવલોકન કરાયેલ ઓટોફેગોસોમ્સના દૃશ્યમાન ઇન્ડક્શન સાથે સુસંગત છે. જોકે, PNs માં પ્રગતિશીલ OXPHOS ડિસફંક્શન સ્પષ્ટ અલ્ટ્રાસ્ટ્રક્ચરલ મિટોકોન્ડ્રીયલ ફેરફારો સાથે છે. 5 અને 8 અઠવાડિયાની ઉંમરના Mfn2cKO PNs ના કોષ શરીર અને ડેંડ્રિટિક વૃક્ષોમાં મિટોકોન્ડ્રીયલ ક્લસ્ટરો જોઈ શકાય છે, અને આંતરિક પટલ રચનામાં ગહન ફેરફારો થયા છે (આકૃતિ S4, A અને B). આ અલ્ટ્રાસ્ટ્રક્ચરલ ફેરફારો અને mtDNA માં નોંધપાત્ર ઘટાડો સાથે સુસંગત, ટેટ્રામેથિલરોડામાઇન મિથાઇલ એસ્ટર (TMRM) સાથે તીવ્ર મગજના સેરેબેલર સ્લાઇસેસના વિશ્લેષણમાં દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે Mfn2cKO PNs માં મિટોકોન્ડ્રીયલ મેમ્બ્રેન સંભવિતતામાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો હતો (આકૃતિ S4C).
(A) OXPHOS સંકુલના અભિવ્યક્તિ સ્તરનું સમય અભ્યાસક્રમ વિશ્લેષણ. 8 અઠવાડિયામાં ફક્ત P<0.05 ધરાવતા પ્રોટીનનો વિચાર કરો (દ્વિ-માર્ગી ANOVA). ડોટેડ લાઇન: CTRL ની તુલનામાં કોઈ ગોઠવણ નથી. (B) ડાબે: એન્ટિ-MTCO1 એન્ટિબોડી (સ્કેલ બાર, 20 μm) સાથે લેબલ થયેલ સેરેબેલર વિભાગનું ઉદાહરણ. પુર્કિન્જે કોષ શરીર દ્વારા કબજે કરાયેલ વિસ્તાર પીળા રંગથી આવરી લેવામાં આવ્યો છે. જમણે: MTCO1 સ્તરનું પ્રમાણીકરણ (ભિન્નતાનું એક-માર્ગી વિશ્લેષણ; n = ત્રણ ઉંદરોમાંથી 7 થી 20 કોષોનું વિશ્લેષણ). (C) સૉર્ટ કરેલા PN માં mtDNA કોપી નંબરનું qPCR વિશ્લેષણ (ભિન્નતાનું એક-માર્ગી વિશ્લેષણ; n = 3 થી 7 ઉંદર). (D) ડાબે: એન્ટિ-DNA એન્ટિબોડી (સ્કેલ બાર, 20 μm) સાથે લેબલ થયેલ સેરેબેલર સ્લાઇસનું ઉદાહરણ. પુર્કિન્જે કોષ શરીર દ્વારા કબજે કરાયેલ વિસ્તાર પીળા રંગથી આવરી લેવામાં આવ્યો છે. જમણે: mtDNA જખમનું પ્રમાણીકરણ (ભિન્નતાનું એક-માર્ગી વિશ્લેષણ; n = ત્રણ ઉંદરોમાંથી 5 થી 9 કોષો). (E) એક્યુટ સેરેબેલર સેક્શનનું ઉદાહરણ જે આખા-કોષ પેચ ક્લેમ્પ રેકોર્ડિંગમાં mitoYFP + પુર્કિન્જે કોષો (તીર) દર્શાવે છે. (F) IV વળાંકનું પ્રમાણીકરણ. (G) CTRL અને Mfn2cKO પુર્કિન્જે કોષોમાં વિધ્રુવીકરણ વર્તમાન ઇન્જેક્શનના પ્રતિનિધિ રેકોર્ડિંગ્સ. ટોચનું ટ્રેસ: AP ને ટ્રિગર કરનાર પ્રથમ પલ્સ. નીચેનું ટ્રેસ: મહત્તમ AP આવર્તન. (H) પોસ્ટસિનેપ્ટિક સ્વયંભૂ ઇનપુટ્સ (sPSPs) નું પ્રમાણીકરણ. પ્રતિનિધિ રેકોર્ડિંગ ટ્રેસ અને તેનો ઝૂમ રેશિયો (I) માં બતાવવામાં આવ્યો છે. ત્રણ ઉંદરોમાંથી n = 5 થી 20 કોષોનું વિશ્લેષણ કરાયેલ ભિન્નતાનું એક-માર્ગી વિશ્લેષણ. ડેટા સરેરાશ±SEM તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવે છે; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) છિદ્રિત પેચ ક્લેમ્પ મોડનો ઉપયોગ કરીને રેકોર્ડ કરાયેલ સ્વયંભૂ AP ના પ્રતિનિધિ ટ્રેસ. ટોચનું ટ્રેસ: મહત્તમ AP આવર્તન. નીચેનું ટ્રેસ: એક જ AP નું ઝૂમ. (K) (J) અનુસાર સરેરાશ અને મહત્તમ AP આવર્તનનું પ્રમાણ નક્કી કરો. માન-વ્હીટની પરીક્ષણ; ચાર ઉંદરોમાંથી n = 5 કોષોનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ડેટા સરેરાશ ± SEM તરીકે દર્શાવવામાં આવે છે; મહત્વપૂર્ણ નથી.
8 અઠવાડિયાના Mfn2cKO PN માં સ્પષ્ટ OXPHOS નુકસાન જોવા મળ્યું હતું, જે દર્શાવે છે કે ચેતાકોષોનું શારીરિક કાર્ય ગંભીર રીતે અસામાન્ય છે. તેથી, અમે 4 થી 5 અઠવાડિયા અને 7 થી 8 અઠવાડિયામાં તીવ્ર સેરેબેલર સ્લાઇસેસમાં સંપૂર્ણ-કોષ પેચ ક્લેમ્પ રેકોર્ડિંગ કરીને OXPHOS-ઉણપવાળા ચેતાકોષોની નિષ્ક્રિય વિદ્યુત લાક્ષણિકતાઓનું વિશ્લેષણ કર્યું (આકૃતિ 2E). અણધારી રીતે, Mfn2cKO ચેતાકોષોની સરેરાશ વિશ્રામી કલા સંભવિતતા અને ઇનપુટ પ્રતિકાર નિયંત્રણ સમાન હતા, જોકે કોષો વચ્ચે સૂક્ષ્મ તફાવતો હતા (કોષ્ટક 1). તેવી જ રીતે, 4 થી 5 અઠવાડિયાની ઉંમરે, વર્તમાન-વોલ્ટેજ સંબંધ (IV વળાંક) માં કોઈ નોંધપાત્ર ફેરફારો જોવા મળ્યા ન હતા (આકૃતિ 2F). જો કે, 7 થી 8 અઠવાડિયાના કોઈ Mfn2cKO ચેતાકોષ IV શાસન (હાયપરપોલરાઇઝેશન સ્ટેપ) થી બચી શક્યા નથી, જે દર્શાવે છે કે આ અંતિમ તબક્કામાં હાયપરપોલરાઇઝેશન સંભવિતતા પ્રત્યે સ્પષ્ટ સંવેદનશીલતા છે. તેનાથી વિપરીત, Mfn2cKO ચેતાકોષોમાં, પુનરાવર્તિત સક્રિય કલા વીજસ્થિતિમાન (AP) વિસર્જનનું કારણ બનતા વિધ્રુવીકરણ પ્રવાહો સારી રીતે સહન કરવામાં આવે છે, જે દર્શાવે છે કે તેમના એકંદર વિસર્જન પેટર્ન 8-અઠવાડિયા જૂના નિયંત્રણ ચેતાકોષો (કોષ્ટક 1 અને આકૃતિ 2G) કરતા નોંધપાત્ર રીતે અલગ નથી. તેવી જ રીતે, સ્વયંસ્ફુરિત પોસ્ટસિનેપ્ટિક પ્રવાહો (sPSCs) ની આવર્તન અને કંપનવિસ્તાર નિયંત્રણ જૂથની જેમ તુલનાત્મક હતા, અને ઘટનાઓની આવર્તન 4 અઠવાડિયાથી 5 અઠવાડિયાથી 7 અઠવાડિયાથી 8 અઠવાડિયા સુધી સમાન વધારા સાથે વધી હતી (આકૃતિ 2, H અને I). PNs માં સિનેપ્ટિક પરિપક્વતાનો સમયગાળો (25). છિદ્રિત PNs પેચ પછી સમાન પરિણામો પ્રાપ્ત થયા હતા. આ રૂપરેખાંકન સેલ્યુલર ATP ખામીઓના સંભવિત વળતરને અટકાવે છે, જેમ કે આખા-કોષ પેચ ક્લેમ્પ રેકોર્ડિંગમાં થઈ શકે છે. ખાસ કરીને, Mfn2cKO ચેતાકોષોની વિશ્રામી કલા વીજસ્થિતિમાન અને સ્વયંસ્ફુરિત ફાયરિંગ આવર્તન પ્રભાવિત થયા ન હતા (આકૃતિ 2, J અને K). સારાંશમાં, આ પરિણામો દર્શાવે છે કે સ્પષ્ટ OXPHOS ડિસફંક્શન ધરાવતા PN ઉચ્ચ-આવર્તન ડિસ્ચાર્જ પેટર્નનો સારી રીતે સામનો કરી શકે છે, જે દર્શાવે છે કે એક વળતર પદ્ધતિ છે જે તેમને લગભગ સામાન્ય ઇલેક્ટ્રોફિઝીયોલોજીકલ પ્રતિભાવો જાળવવાની મંજૂરી આપે છે.
ડેટા સરેરાશ ± SEM (વિચલનનું એક-માર્ગી વિશ્લેષણ, હોલ્મ-સિડાકનું બહુવિધ સરખામણી પરીક્ષણ; *P<0.05) તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવે છે. એકમ નંબર કૌંસ દ્વારા સૂચવવામાં આવે છે.
અમે પ્રોટીઓમિક્સ ડેટાસેટ (આકૃતિ 1G) માં કોઈપણ શ્રેણીમાં એવા માર્ગો શામેલ છે કે કેમ તે તપાસવાનું શરૂ કર્યું જે ગંભીર OXPHOS ઉણપનો સામનો કરી શકે છે, જેનાથી સમજાવી શકાય છે કે અસરગ્રસ્ત PN શા માટે સામાન્ય ઇલેક્ટ્રોફિઝિયોલોજી જાળવી શકે છે (આકૃતિ 2, E થી K). પ્રોટીઓમિક્સ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે બ્રાન્ચેડ ચેઇન એમિનો એસિડ (BCAA) ના અપચયમાં સામેલ ઉત્સેચકો નોંધપાત્ર રીતે અપ-રેગ્યુલેટેડ હતા (આકૃતિ 3A અને આકૃતિ S5A), અને અંતિમ ઉત્પાદન એસિટિલ-CoA (CoA) અથવા સક્સીનાઇલ CoA ધમનીઓસ્ક્લેરોસિસ એસિડ (TCA) ચક્રમાં ટ્રાઇકાર્બોક્સિલેટ્સને પૂરક બનાવી શકે છે. અમને જાણવા મળ્યું કે BCAA ટ્રાન્સએમિનેઝ 1 (BCAT1) અને BCAT2 બંનેની સામગ્રીમાં વધારો થયો છે. તેઓ α-કેટોગ્લુટેરેટ (26) માંથી ગ્લુટામેટ ઉત્પન્ન કરીને BCAA અપચયના પ્રથમ પગલાને ઉત્પ્રેરિત કરે છે. બ્રાન્ચ્ડ ચેઇન કીટો એસિડ ડિહાઇડ્રોજેનેઝ (BCKD) સંકુલ બનાવતા બધા સબયુનિટ્સ અપરેગ્યુલેટેડ છે (આ સંકુલ પરિણામી BCAA કાર્બન સ્કેલેટનના અનુગામી અને બદલી ન શકાય તેવા ડિકાર્બોક્સિલેશનને ઉત્પ્રેરિત કરે છે) (આકૃતિ 3A અને આકૃતિ S5A). જો કે, સૉર્ટ કરેલા PN માં BCAA માં કોઈ સ્પષ્ટ ફેરફારો જોવા મળ્યા નથી, જે આ આવશ્યક એમિનો એસિડના વધેલા સેલ્યુલર શોષણ અથવા TCA ચક્ર (આકૃતિ S5B) ને પૂરક બનાવવા માટે અન્ય સ્ત્રોતો (ગ્લુકોઝ અથવા લેક્ટિક એસિડ) ના ઉપયોગને કારણે હોઈ શકે છે. OXPHOS નો અભાવ ધરાવતા PNs એ 8 અઠવાડિયાની ઉંમરે ગ્લુટામાઇન વિઘટન અને ટ્રાન્સએમિનેશન પ્રવૃત્તિઓમાં વધારો પણ દર્શાવ્યો હતો, જે મિટોકોન્ડ્રીયલ એન્ઝાઇમ્સ ગ્લુટામાઇનેસ (GLS) અને ગ્લુટામાઇન પાયરુવેટ ટ્રાન્સએમિનેઝ 2 (GPT2) (આકૃતિ 3, A અને C) ના અપ-રેગ્યુલેશન દ્વારા પ્રતિબિંબિત થઈ શકે છે. એ નોંધવું યોગ્ય છે કે GLS નું અપ-રેગ્યુલેશન સ્પ્લિસ્ડ આઇસોફોર્મ ગ્લુટામિનેઝ C (GLS-GAC) સુધી મર્યાદિત છે (Mfn2cKO/CTRL નું પરિવર્તન આશરે 4.5 ગણું છે, P = 0.05), અને કેન્સર પેશીઓમાં તેનું ચોક્કસ અપ-રેગ્યુલેશન મિટોકોન્ડ્રીયલ બાયોએનર્જીને ટેકો આપી શકે છે. (27).
(A) ગરમીનો નકશો 8 અઠવાડિયામાં નિર્દિષ્ટ માર્ગ માટે પ્રોટીન સ્તરમાં ફોલ્ડ ફેરફાર દર્શાવે છે. (B) એન્ટિ-PCx એન્ટિબોડી (સ્કેલ બાર, 20 μm) સાથે લેબલ થયેલ સેરેબેલર સ્લાઇસનું ઉદાહરણ. પીળો તીર પુર્કિન્જે કોષ શરીર તરફ નિર્દેશ કરે છે. (C) એથરોસ્ક્લેરોસિસ માટે મહત્વપૂર્ણ ઉમેદવાર તરીકે ઓળખાયેલ ટાઇમ કોર્સ પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ (મલ્ટીપલ ટી-ટેસ્ટ, *FDR <5%; n = 3-5 ઉંદર). (D) ઉપર: [1-13C]પાયરુવેટ ટ્રેસર (એટલે ​​\u200b\u200bકે PDH અથવા ટ્રાન્સ-ધમનીય માર્ગ દ્વારા) માં સમાવિષ્ટ લેબલવાળા કાર્બનમાં પ્રવેશવાની વિવિધ રીતો દર્શાવતો એક યોજનાકીય આકૃતિ. નીચે: વાયોલિન ચાર્ટ [1-13C]પાયરુવેટ (જોડી ટી-ટેસ્ટ; ** P <0.01) સાથે તીવ્ર સેરેબેલર સ્લાઇસેસને લેબલ કર્યા પછી એસ્પાર્ટિક એસિડ, સાઇટ્રિક એસિડ અને મેલિક એસિડમાં રૂપાંતરિત સિંગલ-લેબલવાળા કાર્બન (M1) ની ટકાવારી દર્શાવે છે. (E) દર્શાવેલ માર્ગનું વ્યાપક સમય ઇતિહાસ વિશ્લેષણ. 8 અઠવાડિયામાં ફક્ત P<0.05 ધરાવતા પ્રોટીનનો જ વિચાર કરો. ડેશેડ લાઇન: કોઈ ગોઠવણ મૂલ્ય નહીં (ભિન્નતાનું દ્વિ-માર્ગી વિશ્લેષણ; * P <0.05; *** P <0.001). ડેટા સરેરાશ±SEM તરીકે દર્શાવવામાં આવે છે.
અમારા વિશ્લેષણમાં, BCAA અપચય મુખ્ય અપ-નિયમન માર્ગોમાંનો એક બની ગયો છે. આ હકીકત ભારપૂર્વક સૂચવે છે કે TCA ચક્રમાં પ્રવેશતા વેન્ટિલેશન વોલ્યુમ OXPHOS ના અભાવવાળા PN માં બદલાઈ શકે છે. આ ન્યુરોનલ મેટાબોલિક રિવાયરિંગનું એક મુખ્ય સ્વરૂપ રજૂ કરી શકે છે, જે ગંભીર OXPHOS ડિસફંક્શનના જાળવણી દરમિયાન ન્યુરોનલ ફિઝિયોલોજી અને અસ્તિત્વ પર સીધી અસર કરી શકે છે. આ પૂર્વધારણા સાથે સુસંગત, અમે જોયું કે મુખ્ય એન્ટિ-એથેરોસ્ક્લેરોટિક એન્ઝાઇમ PCx અપ-નિયમિત છે (Mfn2cKO/CTRL લગભગ 1.5 વખત બદલાય છે; આકૃતિ 3A), જે પાયરુવેટના ઓક્સાલોએસેટેટમાં રૂપાંતરને ઉત્પ્રેરિત કરે છે (28), જે મગજના પેશીઓમાં હોવાનું માનવામાં આવે છે. અભિવ્યક્તિ એસ્ટ્રોસાઇટ્સ સુધી મર્યાદિત છે (29, 30). પ્રોટીઓમિક્સ પરિણામો સાથે સુસંગત, કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપીએ દર્શાવ્યું કે OXPHOS-ઉણપવાળા PN માં PCx અભિવ્યક્તિ ખાસ કરીને અને નોંધપાત્ર રીતે વધી હતી, જ્યારે PCx પ્રતિક્રિયા મુખ્યત્વે નિયંત્રણના અડીને આવેલા બર્ગમેન ગ્લિયલ કોષો સુધી મર્યાદિત હતી (આકૃતિ 3B). PCx ના અવલોકન કરેલ અપરેગ્યુલેશનનું કાર્યાત્મક રીતે પરીક્ષણ કરવા માટે, અમે [1-13C] પાયરુવેટ ટ્રેસર સાથે એક્યુટ સેરેબેલર સ્લાઇસેસની સારવાર કરી. જ્યારે પાયરુવેટને પાયરુવેટ ડિહાઇડ્રોજેનેઝ (PDH) દ્વારા ઓક્સિડાઇઝ કરવામાં આવ્યું હતું, ત્યારે તેનું આઇસોટોપ લેબલ અદૃશ્ય થઈ ગયું હતું, પરંતુ જ્યારે પાયરુવેટનું વેસ્ક્યુલર પ્રતિક્રિયાઓ દ્વારા ચયાપચય થાય છે ત્યારે તે TCA ચક્ર મધ્યવર્તીઓમાં સમાવિષ્ટ થાય છે (આકૃતિ 3D). અમારા પ્રોટીઓમિક્સ ડેટાના સમર્થનમાં, અમે Mfn2cKO સ્લાઇસેસના એસ્પાર્ટિક એસિડમાં આ ટ્રેસરમાંથી મોટી સંખ્યામાં માર્કર્સનું અવલોકન કર્યું, જ્યારે સાઇટ્રિક એસિડ અને મેલિક એસિડમાં પણ મધ્યમ વલણ હતું, જોકે નોંધપાત્ર નથી (આકૃતિ 3D).
મિટોપાર્ક ઉંદરના ડોપામાઇન ચેતાકોષોમાં, જે ડોપામાઇન ચેતાકોષો ખાસ કરીને માઇટોકોન્ડ્રીયલ ટ્રાન્સક્રિપ્શન ફેક્ટર A જનીન (Tfam) (આકૃતિ S6B) ને નષ્ટ કરે છે, તેમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શન પણ નોંધપાત્ર રીતે વધ્યું હતું (31), જે દર્શાવે છે કે એસીટોન એસિડ ધમનીઓસ્ક્લેરોસિસ શરીરમાં ન્યુરોનલ OXPHOS ના ડિસફંક્શન દરમિયાન રોગની ઘટનાનું નિયમન થાય છે. નોંધનીય છે કે એવું જાણવા મળ્યું છે કે ધમનીઓસ્ક્લેરોસિસ સાથે સંકળાયેલા ચેતાકોષોમાં વ્યક્ત થઈ શકે તેવા અનન્ય ઉત્સેચકો (32-34) OXPHOS માં અભાવ ધરાવતા PN માં નોંધપાત્ર રીતે વધ્યું છે, જેમ કે પ્રોપિયોનાઇલ-CoA કાર્બોક્સિલેઝ (PCC-A), મેલોનાઇલ-CoA ને સક્સિનાઇલ-CoA માં રૂપાંતરિત કરે છે અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ મેલિક એન્ઝાઇમ 3 (ME3), જેની મુખ્ય ભૂમિકા મેલેટમાંથી પાયરુવેટને પુનઃપ્રાપ્ત કરવાની છે (આકૃતિ 3, A અને C) (33, 35). વધુમાં, અમને Pdk3 એન્ઝાઇમમાં નોંધપાત્ર વધારો જોવા મળ્યો, જે ફોસ્ફોરીલેટ કરે છે અને આમ PDH ને નિષ્ક્રિય કરે છે (36), જ્યારે Pdp1 એન્ઝાઇમમાં કોઈ ફેરફાર જોવા મળ્યા નથી જે PDH અથવા PDH એન્ઝાઇમ સંકુલને સક્રિય કરે છે (આકૃતિ 3A). સતત, Mern2cKO PNs માં, Ser293 (PDH ની એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિને અટકાવવા માટે જાણીતું) માં PDH સંકુલના પાયરુવેટ ડિહાઇડ્રોજેનેઝ E1 ઘટકના α1 સબ્યુનિટ α (PDHE1α) સબ્યુનિટનું ફોસ્ફોરાયલેશન વધારવામાં આવ્યું હતું (આકૃતિ S6C) (આકૃતિ S6C). પાયરુવેટ પાસે કોઈ વેસ્ક્યુલર એક્સેસ નથી.
અંતે, અમને જાણવા મળ્યું કે સક્રિયકરણ પ્રક્રિયા દરમિયાન, અહેવાલો અનુસાર, સેરીન અને ગ્લાયસીન બાયોસિન્થેસિસનો સુપર પાથવે, સંબંધિત મિટોકોન્ડ્રીયલ ફોલેટ (1C) ચક્ર અને પ્રોલાઇન બાયોસિન્થેસિસ (આકૃતિ 1G અને આકૃતિ S5C) બધા નોંધપાત્ર રીતે ઉપર-નિયમિત થાય છે. આસપાસના પેશીઓ માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શન (5-7) સાથે સક્રિય થાય છે. આ પ્રોટીઓમિક્સ ડેટાને ટેકો આપતા કોન્ફોકલ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે OXPHOS ગુમ થયેલ PN માં, 8-અઠવાડિયાના ઉંદરના સેરેબેલર સ્લાઇસેસને સેરીન હાઇડ્રોક્સિમિથાઇલટ્રાન્સફેરેઝ 2 (SHMT2) ને આધિન કરવામાં આવ્યા હતા, જે મિટોકોન્ડ્રીયલ ફોલેટ ચક્રનું મુખ્ય એન્ઝાઇમ છે. નોંધપાત્ર રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવ (આકૃતિ S5D). 13 CU-ગ્લુકોઝ-ઇન્ક્યુબેટેડ એક્યુટ સેરેબેલર સ્લાઇસેસમાં, મેટાબોલિક ટ્રેસિંગ પ્રયોગોએ સેરીન અને પ્રોલાઇન બાયોસિન્થેસિસના ઉપર-નિયમનની પુષ્ટિ કરી, જે દર્શાવે છે કે સેરીન અને પ્રોલાઇનમાં કાર્બન આઇસોફોર્મ્સનો પ્રવાહ વધ્યો છે (આકૃતિ S5E). GLS અને GPT2 દ્વારા પ્રમોટ કરાયેલી પ્રતિક્રિયાઓ ગ્લુટામાઇનમાંથી ગ્લુટામેટના સંશ્લેષણ અને ગ્લુટામેટ અને α-કેટોગ્લુટેરેટ વચ્ચે ટ્રાન્સએમિનેશન માટે જવાબદાર હોવાથી, તેમનું અપરેગ્યુલેશન સૂચવે છે કે OXPHOS-ઉણપવાળા ચેતાકોષોમાં ગ્લુટામેટની માંગમાં વધારો થયો છે, આનો હેતુ પ્રોલાઇનના વધેલા જૈવસંશ્લેષણને જાળવવાનો હોઈ શકે છે (આકૃતિ S5C). આ ફેરફારોથી વિપરીત, PN-વિશિષ્ટ Mfn2cKO ઉંદરોમાંથી સેરેબેલર એસ્ટ્રોસાઇટ્સના પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે આ માર્ગો (બધા એન્ટિપેરોક્સિડેઝ સહિત) અભિવ્યક્તિમાં નોંધપાત્ર રીતે બદલાયા નથી, આમ દર્શાવે છે કે આ મેટાબોલિક રીડાયરેક્શન ડિગ્રેડેડ PN (આકૃતિ S6, D થી G) માટે પસંદગીયુક્ત છે.
સારાંશમાં, આ વિશ્લેષણોએ PNs માં ચોક્કસ મેટાબોલિક માર્ગોના ટેમ્પોરલ સક્રિયકરણના નોંધપાત્ર રીતે અલગ પેટર્ન જાહેર કર્યા. જોકે અસામાન્ય ન્યુરોનલ માઇટોકોન્ડ્રીયલ કાર્ય પ્રારંભિક એથરોસ્ક્લેરોસિસ અને 1C રિમોડેલિંગ (આકૃતિ 3E અને આકૃતિ S5C) તરફ દોરી શકે છે, અને I અને IV સંકુલની અભિવ્યક્તિમાં પણ અનુમાનિત ફેરફારો થઈ શકે છે, સેરીન ડી નોવો સંશ્લેષણમાં ફેરફારો ફક્ત અંતમાં તબક્કામાં જ સ્પષ્ટ થયા. OXPHOS ડિસફંક્શન (આકૃતિ 3E અને આકૃતિ S5C). આ તારણો એક ક્રમિક પ્રક્રિયાને વ્યાખ્યાયિત કરે છે જેમાં તણાવ-પ્રેરિત માઇટોકોન્ડ્રીયલ (1C ચક્ર) અને સાયટોપ્લાઝમિક (સેરીન બાયોસિન્થેસિસ) ન્યુરોનલ ચયાપચયને ફરીથી આકાર આપવા માટે TCA ચક્રમાં એથરોસ્ક્લેરોસિસમાં વધારા સાથે સિનર્જિસ્ટિક રીતે પ્રતિભાવ આપે છે.
8 અઠવાડિયાના OXPHOS-ઉણપવાળા PNs ઉચ્ચ-આવર્તન ઉત્તેજના પ્રવૃત્તિ જાળવી શકે છે અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શનને વળતર આપવા માટે નોંધપાત્ર મેટાબોલિક પુનઃજોડાણમાંથી પસાર થઈ શકે છે. આ શોધ એક રસપ્રદ શક્યતા ઉભી કરે છે કે આ ક્ષણે પણ, આ કોષો ન્યુરોડિજનરેશનને વિલંબિત કરવા અથવા અટકાવવા માટે ઉપચારાત્મક હસ્તક્ષેપ પણ મેળવી શકે છે. મોડું. અમે બે સ્વતંત્ર હસ્તક્ષેપો દ્વારા આ શક્યતાનો ઉકેલ લાવ્યો. પ્રથમ પદ્ધતિમાં, અમે Cre-આધારિત એડેનો-સંકળાયેલ વાયરસ (AAV) વેક્ટર ડિઝાઇન કર્યો જેથી MFN2 ને OXPHOS-ઉણપવાળા PNs ઇન વિવો (આકૃતિ S7A) માં પસંદગીપૂર્વક વ્યક્ત કરી શકાય. AAV એન્કોડિંગ MFN2 અને ફ્લોરોસન્ટ રિપોર્ટર જનીન mCherry (Mfn2-AAV) ને પ્રાથમિક ન્યુરોન કલ્ચર ઇન વિટ્રોમાં ચકાસવામાં આવ્યા હતા, જેના કારણે MFN2 ને Cre-આધારિત રીતે વ્યક્ત કરવામાં આવ્યું હતું અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ મોર્ફોલોજીને બચાવી લેવામાં આવી હતી, જેનાથી Mfn2cKO ન્યુરોન્સમાં ન્યુરોમ્યુટેશન અટકાવાયું હતું (આકૃતિ S7, B, D અને E). આગળ, અમે 8 અઠવાડિયાના Mfn2-AAV ને Mfn2cKO અને નિયંત્રણ ઉંદરોના સેરેબેલર કોર્ટેક્સમાં સ્ટીરિયોટેક્ટિકલી પહોંચાડવા માટે ઇન વિવો પ્રયોગો કર્યા, અને 12 અઠવાડિયાના ઉંદરનું વિશ્લેષણ કર્યું (આકૃતિ 4A). સારવાર કરાયેલ Mfn2cKO ઉંદર મૃત્યુ પામ્યા (આકૃતિ 1, A અને B) (16). ઇન વિવો વાયરલ ટ્રાન્સડક્શનના પરિણામે કેટલાક સેરેબેલર વર્તુળોમાં PN ની પસંદગીયુક્ત અભિવ્યક્તિ થઈ (આકૃતિ S7, G અને H). ફક્ત mCherry (Ctrl-AAV) વ્યક્ત કરતા નિયંત્રણ AAV ના ઇન્જેક્શનથી Mfn2cKO પ્રાણીઓમાં ન્યુરોડિજનરેશનની ડિગ્રી પર કોઈ નોંધપાત્ર અસર પડી ન હતી. તેનાથી વિપરીત, Mfn2-AAV સાથે ટ્રાન્સડ્યુસ કરાયેલ Mfn2cKO ના વિશ્લેષણમાં PN કોષ સ્તર (આકૃતિ 4, B અને C) ની નોંધપાત્ર રક્ષણાત્મક અસર જોવા મળી. ખાસ કરીને, ચેતાકોષ ઘનતા નિયંત્રણ પ્રાણીઓ (આકૃતિ 4, B અને C, અને આકૃતિ S7, H અને I) થી લગભગ અસ્પષ્ટ લાગે છે. MFN1 ની અભિવ્યક્તિ પરંતુ MFN2 નહીં, ન્યુરોનલ મૃત્યુને બચાવવામાં સમાન રીતે અસરકારક છે (આકૃતિ 4C અને આકૃતિ S7, C અને F), જે દર્શાવે છે કે એક્ટોપિક MFN1 ની અભિવ્યક્તિ MFN2 ના અભાવને અસરકારક રીતે પૂરક બનાવી શકે છે. સિંગલ PN સ્તર પર વધુ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે Mfn2-AAV એ મોટાભાગે મિટોકોન્ડ્રિયાના અલ્ટ્રાસ્ટ્રક્ચરને બચાવ્યું, mtDNA સ્તરને સામાન્ય બનાવ્યું, અને એન્ટિ-એન્જિયોજેનેસિસ માર્કર PCx (આકૃતિ 4, C થી E) ની ઉચ્ચ અભિવ્યક્તિને ઉલટાવી દીધી. આરામની સ્થિતિમાં બચાવેલા Mfn2cKO ઉંદરોનું દ્રશ્ય નિરીક્ષણ દર્શાવે છે કે તેમની મુદ્રા અને મોટર લક્ષણો (S1 થી S3 ની ગતિ) માં સુધારો થયો હતો. નિષ્કર્ષમાં, આ પ્રયોગો દર્શાવે છે કે OXPHOS માં ગંભીર ઉણપ ધરાવતા PN માં MFN2 નું વિલંબિત પુનઃપ્રવેશ mtDNA વપરાશને ઉલટાવી દેવા અને એથરોસ્ક્લેરોસિસને પ્રેરિત કરવા માટે પૂરતું છે, જેનાથી ચેતાક્ષ અધોગતિ અને ચેતાકોષીય મૃત્યુને વિવોમાં અટકાવી શકાય છે.
(A) સૂચવેલ મેટાબોલિક પાથવે સક્રિય થાય ત્યારે AAV એન્કોડિંગ MFN2 ઇન્જેક્ટ કરવા માટે પ્રાયોગિક સમયપત્રક દર્શાવતી યોજના. (B) Mfn2cKO ઉંદરોમાં 8 અઠવાડિયામાં ટ્રાન્સડ્યુસ કરાયેલા 12-અઠવાડિયા જૂના સેરેબેલર સ્લાઇસેસની પ્રતિનિધિ કોન્ફોકલ છબીઓ અને એન્ટિ-કેલ્બિન્ડિન એન્ટિબોડી સાથે લેબલ. જમણે: ચેતાક્ષ તંતુઓનું સ્કેલિંગ. ચેતાક્ષ ઝૂમનું સ્કેલ 450 અને 75 μm છે. (C) ડાબે: AAV ટ્રાન્સડક્શન લૂપ (AAV+) માં પુર્કિન્જે કોષ ઘનતાનું પ્રમાણીકરણ (વેરિઅન્સનું એક-માર્ગી વિશ્લેષણ; n = 3 ઉંદર). જમણે: અઠવાડિયા 12 પર ટ્રાન્સડ્યુસ કરેલા PN માં mtDNA ફોકસ વિશ્લેષણ (અનપેયર્ડ ટી-ટેસ્ટ; ત્રણ ઉંદરોમાંથી n = 6 કોષો). * P <0.05; ** P <0.01. (D) સૂચવેલ વાયરલ વેક્ટર સાથે ટ્રાન્સડ્યુસ કરાયેલ Mfn2cKO સેરેબેલર વિભાગોના PN ના પ્રતિનિધિ ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોગ્રાફ્સ. ગુલાબી માસ્ક ડેંડ્રાઇટ્સ દ્વારા કબજે કરાયેલ વિસ્તાર દર્શાવે છે, અને પીળો ડોટેડ ચોરસ જમણી બાજુએ આપેલા ઝૂમ દર્શાવે છે; n ન્યુક્લિયસ દર્શાવે છે. સ્કેલ બાર, 1μm. (E) 12 અઠવાડિયામાં ટ્રાન્સડ્યુસ થયેલા PN માં PCx સ્ટેનિંગનું ઉદાહરણ દર્શાવે છે. સ્કેલ બાર, 20μm. OE, ઓવરએક્સપ્રેશન; FC, ફોલ્ડ ચેન્જ.
છેલ્લે, અમે OXPHOS ડિસફંક્શનનો અનુભવ કરનારા PN માં પેરોક્સિડેઝ-પ્રેરિત કોષ અસ્તિત્વના મહત્વની તપાસ કરી. અમે ખાસ કરીને માઉસ PCx mRNA (AAV-shPCx) ને લક્ષ્ય બનાવતા mCherry એન્કોડિંગ AAV-shRNA (શોર્ટ હેરપિન RNA) જનરેટ કર્યું, અને Mfn2cKO ઉંદરના સેરેબેલમમાં વાયરસ અથવા તેના સ્ક્રેમ્બલ્ડ કંટ્રોલ (AAV-scr) ને ઇન્જેક્ટ કર્યું. PCx અભિવ્યક્તિમાં વધારો થયો (આકૃતિ 3C) અને PN કોષ સ્તર હજુ પણ અકબંધ હતો (આકૃતિ 1A) તે સમયગાળા દરમિયાન અસરકારક PCx નોકડાઉન પ્રાપ્ત કરવા માટે ઇન્જેક્શન વયના ચોથા અઠવાડિયામાં (આકૃતિ 5A) કરવામાં આવ્યું હતું. એ નોંધવું યોગ્ય છે કે PCx (આકૃતિ S8A) ને નીચે પાડવાથી PN મૃત્યુમાં નોંધપાત્ર પ્રવેગ થાય છે, જે ચેપગ્રસ્ત રિંગ (આકૃતિ 5, B અને C) સુધી મર્યાદિત છે. PCx અપ-રેગ્યુલેશન દ્વારા પ્રેરિત મેટાબોલિક અસરોની પદ્ધતિને સમજવા માટે, અમે PCx નોકડાઉન પછી PNs ની રેડોક્સ સ્થિતિનો અભ્યાસ કર્યો અને AAV-મધ્યસ્થી ઓપ્ટિકલ બાયોસેન્સર Grx1-roGFP2 એકસાથે વ્યક્ત કરવામાં આવ્યા (આકૃતિ S8, B થી D) ગ્લુટાથિઓનનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે પેપ્ટાઇડ રેડોક્સ સંભવિત (38) ના સંબંધિત ફેરફાર. પછી, અમે FLIM સ્થિતિઓ (આકૃતિ S8, E થી G) ચકાસ્યા પછી સાયટોપ્લાઝમિક રેડોક્સ સ્થિતિમાં સંભવિત ફેરફારો શોધવા માટે 7-અઠવાડિયા જૂના Mfn2cKO અથવા કંટ્રોલ લિટરમેટ્સના તીવ્ર મગજના ટુકડાઓમાં બે-ફોટોન ફ્લોરોસેન્સ લાઇફટાઇમ ઇમેજિંગ માઇક્રોસ્કોપી (FLIM) કર્યું. વિશ્લેષણમાં PCx અભિવ્યક્તિનો અભાવ ધરાવતા એકલ Mfn2cKO PNs ની ઓક્સિડેશન સ્થિતિમાં નોંધપાત્ર વધારો જોવા મળ્યો, જે ફક્ત સ્ક્રેમ્બલ્ડ shRNA વ્યક્ત કરતા નિયંત્રણ ચેતાકોષો અથવા Mfn2cKO PNs થી અલગ છે (આકૃતિ 5, D અને E). જ્યારે PCx અભિવ્યક્તિ ડાઉન-રેગ્યુલેટેડ હતી, ત્યારે ખૂબ જ ઓક્સિડાઇઝ્ડ સ્થિતિ દર્શાવતા Mfn2cKO PN ની ટકાવારી ત્રણ ગણાથી વધુ વધી ગઈ (આકૃતિ 5E), જે દર્શાવે છે કે PCx અપ-રેગ્યુલેશને ડિજનરેટેડ ચેતાકોષોની રેડોક્સ ક્ષમતા જાળવી રાખી હતી.
(A) દર્શાવેલ મેટાબોલિક પાથવે સક્રિય થાય ત્યારે AAV એન્કોડિંગ shPCx ઇન્જેક્ટ કરવા માટે પ્રાયોગિક સમયપત્રક દર્શાવતી યોજના. (B) Mfn2cKO ઉંદરોમાં 8-અઠવાડિયાના સેરેબેલર વિભાગોના પ્રતિનિધિ કોન્ફોકલ ફોટોગ્રાફ્સ 4 અઠવાડિયામાં એન્ટિ-કેલ્સીન્યુરિન એન્ટિબોડી સાથે ટ્રાન્સડ્યુસ અને લેબલ કરવામાં આવ્યા હતા. સ્કેલ બાર, 450μm. (C) AAV-ટ્રાન્સડ્યુસ્ડ લૂપ્સમાં પુર્કિન્જે કોષ ઘનતાનું પ્રમાણ (ભિન્નતાનું એક-માર્ગી વિશ્લેષણ; n = 3 થી 4 ઉંદર). ડેટા સરેરાશ ±SEM તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવે છે; ***P<0.001. (D) પ્રતિનિધિ FLIM ચિત્ર ઉલ્લેખિત પ્રાયોગિક પરિસ્થિતિઓ હેઠળ 7-અઠવાડિયાના PN વ્યક્ત કરતા ગ્લુટાથિઓન રેડોક્સ સેન્સર Grx1-roGFP2 નું સરેરાશ આયુષ્ય દર્શાવે છે. LUT (લુક-અપ ટેબલ) ગુણોત્તર: સર્વાઇવલ સમય અંતરાલ (પિકોસેકન્ડમાં). સ્કેલ બાર, 25μm. (E) હિસ્ટોગ્રામ દરેક સ્થિતિમાં બે ઉંદરોમાં (D) (n=158 થી 368 કોષો) સુધીના Grx1-roGFP2 જીવનકાળ મૂલ્યોનું વિતરણ દર્શાવે છે. દરેક હિસ્ટોગ્રામ ઉપરનો પાઇ ચાર્ટ: નોંધપાત્ર રીતે લાંબા (લાલ, ઓક્સિડાઇઝ્ડ) અથવા ટૂંકા (વાદળી, ઘટાડેલા) જીવનકાળ મૂલ્યો ધરાવતા કોષોની સંખ્યા દર્શાવે છે, જે CTRL-AAV-scr માં સરેરાશ જીવનકાળ મૂલ્યના 1 SD કરતાં વધુ છે. (F) પ્રસ્તાવિત મોડેલ ન્યુરોનલ PCx ના અપરેગ્યુલેશનની રક્ષણાત્મક અસર દર્શાવે છે.
એકંદરે, અમે અહીં આપેલા ડેટા દર્શાવે છે કે MFN2 નું પુનઃઅભિવ્યક્તિ ગંભીર OXPHOS ઉણપ, ગંભીર mtDNA અવક્ષય અને અત્યંત અસામાન્ય ઇસ્ટા-જેવા મોર્ફોલોજી સાથે અદ્યતન PN ને સંપૂર્ણપણે બચાવી શકે છે, જેનાથી અદ્યતન રોગોમાં પણ સતત પ્રગતિ થાય છે. ન્યુરોડિજનરેશન કોષ મૃત્યુ પહેલાના તબક્કાના ઉલટાવી શકાય તેવા પુરાવા પૂરા પાડે છે. મેટાબોલિક સુગમતાની આ ડિગ્રી એથરોસ્ક્લેરોસિસ (TCA ચક્રનું પુનઃવાયરિંગ) ને પ્રેરિત કરવાની ચેતાકોષોની ક્ષમતા દ્વારા વધુ ભાર મૂકવામાં આવે છે, જે OXPHOS ના અભાવવાળા PN માં PCx અભિવ્યક્તિને અટકાવે છે અને કોષ મૃત્યુને વધારે છે, જેનાથી રક્ષણાત્મક ભૂમિકા ભજવે છે (આકૃતિ 5F).
આ અભ્યાસમાં, અમે પુરાવા આપ્યા છે કે OXPHOS ડિસફંક્શન પ્રત્યે PNs નો પ્રતિભાવ મેટાબોલિક પ્રોગ્રામ્સ દ્વારા સક્રિય થયેલ ડિફરન્શિયલ એક્ટિવેશન પાથવે દ્વારા ધીમે ધીમે TCA ચક્ર એથરોસ્ક્લેરોસિસમાં રૂપાંતરિત થાય છે. અમે ઘણી પૂરક પદ્ધતિઓ સાથે પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણની પુષ્ટિ કરી અને જાહેર કર્યું કે જ્યારે ગંભીર મિટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શન દ્વારા પડકારવામાં આવે છે, ત્યારે ચેતાકોષોમાં મેટાબોલિક સ્થિતિસ્થાપકતાનું અગાઉ અજાણ્યું સ્વરૂપ હોય છે. અમારા આશ્ચર્યની વાત એ છે કે, સમગ્ર રિવાયરિંગ પ્રક્રિયા જરૂરી નથી કે ન્યુરોડિજનરેશન સાથે ધીમે ધીમે અને ઉલટાવી શકાય તેવું ટર્મિનલ મેટાબોલિક સ્થિતિને ચિહ્નિત કરે, પરંતુ અમારા ડેટા સૂચવે છે કે તે કોષ મૃત્યુ પહેલાના તબક્કામાં પણ જાળવણી ચેતાકોષની રચના કરી શકે છે. કાર્યાત્મક વળતર પદ્ધતિ. આ શોધ સૂચવે છે કે ચેતાકોષોમાં શરીરમાં મેટાબોલિક પ્લાસ્ટિસિટીની નોંધપાત્ર ડિગ્રી હોય છે. આ હકીકત સાબિત કરે છે કે MFN2 નું પાછળથી પુનઃપ્રવેશ મુખ્ય મેટાબોલિક માર્કર્સની અભિવ્યક્તિને ઉલટાવી શકે છે અને PN ડિજનરેશનને અટકાવી શકે છે. તેનાથી વિપરીત, તે એથરોસ્ક્લેરોસિસને અટકાવે છે અને ચેતાને વેગ આપે છે. ટ્રાન્સસેક્સ્યુઅલ.
અમારા સંશોધનમાં સૌથી રસપ્રદ તારણો પૈકી એક એ છે કે OXPHOS નો અભાવ ધરાવતા PNs ખાસ કરીને ધમનીઓના સ્ક્લેરોસિસને ઉત્તેજિત કરતા ઉત્સેચકોને અપ-રેગ્યુલેટ કરીને TCA ચક્ર ચયાપચયમાં ફેરફાર કરી શકે છે. મેટાબોલિક પુનર્ગઠન એ કેન્સર કોષોનું એક સામાન્ય લક્ષણ છે, જેમાંથી કેટલાક ગ્લુટામાઇન પર આધાર રાખે છે જેથી TCA ચક્ર મધ્યસ્થીઓને પૂરક બનાવી શકાય જેથી રિડ્યુસિંગ સમકક્ષ ઉત્પન્ન થાય, જે શ્વસન શૃંખલાને ચલાવે છે અને લિપિડ અને ન્યુક્લિયોટાઇડ બાયોસિન્થેસિસ પૂર્વગામીઓનું ઉત્પાદન જાળવી રાખે છે (39, 40). તાજેતરના અભ્યાસમાં દર્શાવવામાં આવ્યું છે કે OXPHOS ડિસફંક્શનનો અનુભવ કરતા પેરિફેરલ પેશીઓમાં, ગ્લુટામાઇન/ગ્લુટામેટ ચયાપચયનું પુનઃજોડાણ પણ એક અગ્રણી લક્ષણ છે (5, 41), જ્યાં TCA ચક્રમાં ગ્લુટામાઇન પ્રવેશની દિશા OXPHOS ઇજાની તીવ્રતાને કારણે આધાર રાખે છે (41). જો કે, શરીરમાં ન્યુરોનલ મેટાબોલિક પ્લાસ્ટિસિટીની કોઈપણ સમાનતા અને રોગના સંદર્ભમાં તેની સંભવિત સુસંગતતા અંગે સ્પષ્ટ પુરાવાનો અભાવ છે. તાજેતરના ઇન વિટ્રો અભ્યાસમાં, પ્રાથમિક કોર્ટિકલ ચેતાકોષો ન્યુરોટ્રાન્સમિશન માટે ગ્લુટામેટ પૂલને ગતિશીલ બનાવવા માટે દર્શાવવામાં આવ્યા હતા, જેનાથી મેટાબોલિક તણાવની પરિસ્થિતિઓમાં ઓક્સિડેટીવ ચયાપચય અને એથરોસ્ક્લેરોસિસને પ્રોત્સાહન મળે છે (42). એ નોંધવું યોગ્ય છે કે TCA ચક્ર એન્ઝાઇમ સક્સીનેટ ડિહાઇડ્રોજેનેઝના ફાર્માકોલોજિકલ અવરોધ હેઠળ, પાયરુવેટ કાર્બોક્સિલેશન કલ્ચર્ડ સેરેબેલર ગ્રાન્યુલ ન્યુરોન્સમાં ઓક્સાલોએસેટેટના સંશ્લેષણને જાળવી રાખે છે તેવું માનવામાં આવે છે (34). જો કે, મગજની પેશીઓ (જ્યાં એથરોસ્ક્લેરોસિસ મુખ્યત્વે એસ્ટ્રોસાઇટ્સ સુધી મર્યાદિત હોવાનું માનવામાં આવે છે) માટે આ પદ્ધતિઓની શારીરિક સુસંગતતા હજુ પણ મહત્વપૂર્ણ શારીરિક મહત્વ ધરાવે છે (43). આ કિસ્સામાં, અમારા ડેટા દર્શાવે છે કે શરીરમાં OXPHOS દ્વારા નુકસાન પામેલા PN ને BCAA ડિગ્રેડેશન અને પાયરુવેટ કાર્બોક્સિલેશનમાં ફેરવી શકાય છે, જે TCA પૂલ ઇન્ટરમીડિએટ્સના પૂરકના બે મુખ્ય સ્ત્રોત છે. જોકે ચેતા ઊર્જા ચયાપચયમાં BCAA કેટાબોલિઝમનું અનુમાનિત યોગદાન પ્રસ્તાવિત કરવામાં આવ્યું છે, ન્યુરોટ્રાન્સમિશન માટે ગ્લુટામેટ અને GABA ની ભૂમિકા ઉપરાંત, વિવોમાં આ પદ્ધતિઓ માટે હજુ પણ કોઈ પુરાવા નથી. તેથી, એવું અનુમાન કરવું સરળ છે કે નિષ્ક્રિય PN એથરોસ્ક્લેરોસિસ વધારીને એસિમિલેશન પ્રક્રિયા દ્વારા સંચાલિત TCA ઇન્ટરમીડિએટ્સના વપરાશ માટે આપમેળે વળતર આપી શકે છે. ખાસ કરીને, એસ્પાર્ટિક એસિડની વધતી માંગ જાળવવા માટે PCx નું અપરેગ્યુલેશન જરૂરી હોઈ શકે છે, જે મિટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શન (45) સાથે પ્રસારિત કોષોમાં સૂચવવામાં આવે છે. જો કે, અમારા મેટાબોલોમિક્સ વિશ્લેષણમાં Mfn2cKO PNs (આકૃતિ S6A) માં એસ્પાર્ટિક એસિડના સ્થિર-સ્થિતિ સ્તરમાં કોઈ નોંધપાત્ર ફેરફારો જાહેર થયા નથી, જે સંભવતઃ પ્રસારિત કોષો અને પોસ્ટ-મિટોટિક ચેતાકોષો વચ્ચે એસ્પાર્ટિક એસિડના વિવિધ મેટાબોલિક ઉપયોગને પ્રતિબિંબિત કરે છે. જોકે વિવોમાં નિષ્ક્રિય ચેતાકોષોમાં PCx અપરેગ્યુલેશનની ચોક્કસ પદ્ધતિ દર્શાવવાનું બાકી છે, અમે દર્શાવ્યું છે કે આ અકાળ પ્રતિભાવ ચેતાકોષોની રેડોક્સ સ્થિતિ જાળવવામાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે, જે સેરેબેલર સ્લાઇસેસ પર FLIM પ્રયોગોમાં દર્શાવવામાં આવ્યું હતું. ખાસ કરીને, PN ને PCx ને અપ-રેગ્યુલેટ કરવાથી અટકાવવાથી વધુ ઓક્સિડાઇઝ્ડ સ્થિતિ થઈ શકે છે અને કોષ મૃત્યુને વેગ મળે છે. BCAA ડિગ્રેડેશનનું સક્રિયકરણ અને પાયરુવેટનું કાર્બોક્સિલેશન એ મિટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શન (7) ના પેરિફેરલ પેશીઓને લાક્ષણિકતા આપવાની રીતો નથી. તેથી, તેઓ OXPHOS-ઉણપવાળા ચેતાકોષોનું પ્રાથમિક લક્ષણ હોય તેવું લાગે છે, ભલે તે એકમાત્ર લક્ષણ ન હોય, જે ન્યુરોડિજનરેશન માટે મહત્વપૂર્ણ છે. .
સેરેબેલર રોગ એ એક વિજાતીય પ્રકારનો ન્યુરોડિજનરેટિવ રોગ છે જે સામાન્ય રીતે એટેક્સિયા તરીકે પ્રગટ થાય છે અને ઘણીવાર PN ને નુકસાન પહોંચાડે છે (46). આ ચેતાકોષ વસ્તી ખાસ કરીને માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શન માટે સંવેદનશીલ હોય છે કારણ કે ઉંદરોમાં તેમનું પસંદગીયુક્ત અધોગતિ માનવ સ્પિનોસેરેબેલર એટેક્સિયા (16, 47, 48) ને લાક્ષણિકતા આપતા ઘણા મોટર લક્ષણોનું પુનરુત્પાદન કરવા માટે પૂરતું છે. અહેવાલો અનુસાર, મ્યુટન્ટ જનીન સાથે ટ્રાન્સજેનિક માઉસ મોડેલ માનવ સ્પિનોસેરેબેલર એટેક્સિયા સાથે સંકળાયેલું છે અને તેમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શન (49, 50) છે, જે PNPH માં OXPHOS ની ઉણપના પરિણામોનો અભ્યાસ કરવાના મહત્વ પર ભાર મૂકે છે. તેથી, આ અનન્ય ચેતાકોષ વસ્તીને અસરકારક રીતે અલગ કરવા અને અભ્યાસ કરવા માટે ખાસ કરીને યોગ્ય છે. જો કે, PN દબાણ પ્રત્યે ખૂબ જ સંવેદનશીલ હોય છે અને સમગ્ર સેરેબેલર કોષ વસ્તીના ઓછા પ્રમાણ માટે જવાબદાર હોય છે, ઘણા ઓમિક્સ-આધારિત અભ્યાસો માટે, તેમને સંપૂર્ણ કોષો તરીકે પસંદગીયુક્ત અલગ કરવા હજુ પણ એક પડકારજનક પાસું છે. અન્ય કોષ પ્રકારો (ખાસ કરીને પુખ્ત પેશીઓ) ના દૂષણનો સંપૂર્ણ અભાવ પ્રાપ્ત કરવો લગભગ અશક્ય હોવા છતાં, અમે ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રોટીઓમિક્સ વિશ્લેષણ માટે પૂરતી સંખ્યામાં સધ્ધર ચેતાકોષો મેળવવા માટે FACS સાથે અસરકારક વિયોજન પગલું જોડ્યું, અને સમગ્ર સેરેબેલમ (51) ના હાલના ડેટા સેટની તુલનામાં ખૂબ જ ઉચ્ચ પ્રોટીન કવરેજ (લગભગ 3000 પ્રોટીન) ધરાવીએ છીએ. આખા કોષોની સધ્ધરતા જાળવી રાખીને, અમે અહીં જે પદ્ધતિ પ્રદાન કરીએ છીએ તે અમને માત્ર મિટોકોન્ડ્રિયામાં મેટાબોલિક માર્ગોમાં ફેરફારો તપાસવાની જ નહીં, પણ તેના સાયટોપ્લાઝમિક સમકક્ષોમાં ફેરફારો પણ તપાસવાની મંજૂરી આપે છે, જે કોષ પ્રકારને સમૃદ્ધ બનાવવા માટે મિટોકોન્ડ્રિયા મેમ્બ્રેન ટૅગ્સના ઉપયોગને પૂરક બનાવે છે. જટિલ પેશીઓમાં મિટોકોન્ડ્રિયાની સંખ્યા માટેની નવી પદ્ધતિ (52, 53). અમે જે પદ્ધતિનું વર્ણન કરીએ છીએ તે ફક્ત પુર્કિન્જે કોષોના અભ્યાસ સાથે સંબંધિત નથી, પરંતુ માઇટોકોન્ડ્રિયા ડિસફંક્શનના અન્ય મોડેલો સહિત રોગગ્રસ્ત મગજમાં મેટાબોલિક ફેરફારોને સંબોધવા માટે કોઈપણ પ્રકારના કોષ પર સરળતાથી લાગુ કરી શકાય છે.
અંતે, અમે આ મેટાબોલિક પુનર્ગઠન પ્રક્રિયા દરમિયાન એક ઉપચારાત્મક વિન્ડો ઓળખી કાઢી છે જે સેલ્યુલર તણાવના મુખ્ય સંકેતોને સંપૂર્ણપણે ઉલટાવી શકે છે અને ન્યુરોનલ અધોગતિને અટકાવી શકે છે. તેથી, અહીં વર્ણવેલ રિવાયરિંગના કાર્યાત્મક અસરોને સમજવાથી મિટોકોન્ડ્રીયલ ડિસફંક્શન દરમિયાન ન્યુરોનલ સધ્ધરતા જાળવવા માટે શક્ય સારવારમાં મૂળભૂત આંતરદૃષ્ટિ મળી શકે છે. અન્ય મગજના કોષોમાં ઊર્જા ચયાપચયમાં થતા ફેરફારોનું વિશ્લેષણ કરવાના હેતુથી ભવિષ્યના સંશોધનની જરૂર છે જેથી અન્ય ન્યુરોલોજીકલ રોગો માટે આ સિદ્ધાંતની ઉપયોગિતા સંપૂર્ણપણે પ્રગટ થાય.
MitoPark ઉંદરોનું વર્ણન અગાઉ કરવામાં આવ્યું છે (31). LoxP સાથે C57BL/6N ઉંદરોનું વર્ણન અગાઉ કરવામાં આવ્યું છે (18) અને Mfn2 જનીનો સાથે ક્રોસ કરવામાં આવ્યા છે (23). પરિણામી ડબલ હેટરોઝાયગસ સંતાનને પછી હોમોઝાયગસ Mfn2loxP/Mfn2loxP ઉંદર સાથે ક્રોસ કરવામાં આવ્યા હતા જેથી Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) માટે પુર્કિન્જે-વિશિષ્ટ જનીન નોકઆઉટ્સ ઉત્પન્ન થાય. સમાગમના સબસેટમાં, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP એલીલ (stop-mtYFP) વધારાના ક્રોસિંગ (20) દ્વારા રજૂ કરવામાં આવ્યું હતું. બધી પ્રાણી પ્રક્રિયાઓ યુરોપિયન, રાષ્ટ્રીય અને સંસ્થાકીય માર્ગદર્શિકા અનુસાર કરવામાં આવી હતી અને જર્મનીના નોર્થ રાઈન-વેસ્ટફેલિયાના ઉમવેલ્ટ અને વર્બ્રોચરશુટ્ઝના લેન્ડેસમટફુરનાતુર દ્વારા મંજૂર કરવામાં આવી હતી. પ્રાણીઓનું કાર્ય યુરોપિયન ફેડરેશન ઓફ લેબોરેટરી એનિમલ સાયન્સિસ એસોસિએશનના માર્ગદર્શનને પણ અનુસરે છે.
સગર્ભા સ્ત્રીના સર્વાઇકલ ડિસલોકેશનને એનેસ્થેટાઇઝ કર્યા પછી, ઉંદર ગર્ભને અલગ કરવામાં આવે છે (E13). કોર્ટેક્સને હેન્ક્સ બેલેન્સ્ડ સોલ્ટ સોલ્યુશન (HBSS) માં 10 mM હેપ્સ સાથે પૂરક બનાવવામાં આવ્યું હતું અને ડલ્બેકોના મોડિફાઇડ ઇગલના માધ્યમમાં પેપેઇન (20 U/ml) અને સિસ્ટીન (1μg/ml) ધરાવતા માધ્યમમાં પસાર કરવામાં આવ્યું હતું. પેશીઓને DMEM માં ઇન્ક્યુબેટ કરો અને એન્ઝાઇમેટિક પાચન દ્વારા તેને અલગ કરો. Ml) 37°C પર 20 મિનિટ માટે, અને પછી 10% ગર્ભ બોવાઇન સીરમ સાથે પૂરક DMEM માં યાંત્રિક રીતે મિલ્ડ કરવામાં આવ્યા હતા. ઇમેજિંગ વિશ્લેષણ માટે કોષોને પોલિલિસિનથી કોટેડ કાચના કવરસ્લિપ્સ પર 6 સેમી કલ્ચર ડીશ દીઠ 2×106 ની ઘનતા પર અથવા 0.5×105 કોષો/cm2 ની ઘનતા પર સીડ કરવામાં આવ્યા હતા. 4 કલાક પછી, માધ્યમને 1% B27 પૂરક અને 0.5 mM ગ્લુટામેક્સ ધરાવતા ન્યુરોબેસલ સીરમ-મુક્ત માધ્યમથી બદલવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ પ્રયોગ દરમ્યાન ચેતાકોષોને 37°C અને 5% CO2 પર જાળવવામાં આવ્યા, અને અઠવાડિયામાં એકવાર ખવડાવવામાં આવ્યા. ઇન વિટ્રોમાં પુનઃસંયોજનને પ્રેરિત કરવા માટે, 3μl (24-વેલ કલ્ચર ડીશ) અથવા 0.5μl (24-વેલ પ્લેટ) નો ઉપયોગ ઇન વિટ્રોમાં બીજા દિવસે ચેતાકોષોની સારવાર માટે કરવામાં આવ્યો: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (એડજીન, કેટલોગ નંબર 105530-AAV9) અને AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (એડજીન, કેટલોગ નંબર 105545-AAV9).
માઉસ Mfn1 અને Mfn2 પૂરક DNA (અનુક્રમે Addgene plasmid #23212 અને #23213 માંથી મેળવેલ) C-ટર્મિનસ પર V5 ક્રમ (GKPIPNPLLGLDST) સાથે ચિહ્નિત થયેલ છે, અને T2A ક્રમ દ્વારા ફ્રેમમાં mCherry સાથે જોડાયેલા છે. Grx1-roGFP2 એ હાઇડેલબર્ગ TP ડિક DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) તરફથી ભેટ છે. પરંપરાગત ક્લોનિંગ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને tdTomato કેસેટને બદલીને, pAAV-CAG-FLEX-tdTomato બેકબોન (એડજીન સંદર્ભ નંબર 28306) માં સબક્લોન કરવામાં આવ્યું હતું જેથી pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 અને pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 વેક્ટર જનરેટ થાય. નિયંત્રણ વેક્ટર pAAV-CAG-FLEX-mCherry જનરેટ કરવા માટે સમાન વ્યૂહરચનાનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. AAV-shPCx કન્સ્ટ્રક્ટ જનરેટ કરવા માટે, પ્લાઝમિડ AAV વેક્ટર (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) જરૂરી છે, જેમાં shRNA ટાર્ગેટિંગ માઉસ PCx (5′CTTTCGCTTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) ને એન્કોડ કરતો DNA ક્રમ હોય છે. U6 પ્રમોટરના નિયંત્રણ હેઠળ, mCherryનો ઉપયોગ CMV પ્રમોટરના નિયંત્રણ હેઠળ થાય છે. સહાયક AAV વેક્ટરનું ઉત્પાદન ઉત્પાદકની સૂચનાઓ (સેલ બાયોલેબ્સ) અનુસાર હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, 293AAV કોષો-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) અથવા Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) કોડિંગ જનીનનું ક્ષણિક ટ્રાન્સફેક્શન, તેમજ AAV1 કેપ્સિડ પ્રોટીન અને સહાયક પ્રોટીન પેકેજિંગ પ્લાઝમિડ પ્લાઝમિડ, કેલ્શિયમ ફોસ્ફેટ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને, પ્લાઝમિડ પ્લાઝમિડ પેકેજિંગ દ્વારા, કેલ્શિયમ ફોસ્ફેટ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) વહન કરતા ટ્રાન્સફર પ્લાઝમિડનો ઉપયોગ કરો. ક્રૂડ વાયરસ સુપરનેટન્ટ ડ્રાય આઈસ/ઇથેનોલ બાથમાં ફ્રીઝ-થો સાયકલ દ્વારા મેળવવામાં આવ્યો હતો અને ફોસ્ફેટ બફર સલાઇન (PBS) માં કોષોને લાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા. AAV વેક્ટરને ડિસ્કન્ટિન્યુઅસ આયોડિક્સાનોલ ગ્રેડિયન્ટ અલ્ટ્રાસેન્ટ્રિફ્યુગેશન (32,000 rpm અને 4°C પર 24 કલાક) દ્વારા શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું અને એમિકોન અલ્ટ્રા-15 સેન્ટ્રિફ્યુગલ ફિલ્ટરનો ઉપયોગ કરીને કેન્દ્રિત કરવામાં આવ્યું હતું. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 જીનોમ કોપી (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX નું જીનોમ ટાઇટર અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ (54) હતું, જે રીઅલ-ટાઇમ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) અને AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) દ્વારા માપવામાં આવ્યું હતું.
પ્રાથમિક ચેતાકોષોને બરફ-ઠંડા 1x PBS માં સ્ક્રેપ કરવામાં આવ્યા હતા, પેલેટ કરવામાં આવ્યા હતા, અને પછી ફોસ્ફેટેઝ અને પ્રોટીઝ ઇન્હિબિટર (રોશે) ધરાવતા 0.5% ટ્રાઇટોન X-100 / 0.5% સોડિયમ ડિઓક્સિકોલેટ/PBS લિસિસ બફરમાં એકરૂપ કરવામાં આવ્યા હતા. બાયસિન્કોનિનિક એસિડ એસે (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) નો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીન ક્વોન્ટિફિકેશન કરવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ પ્રોટીનને SDS-પોલિયાક્રિલામાઇડ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યા હતા, અને પછી પોલીવિનાઇલિડેન ફ્લોરાઇડ મેમ્બ્રેન (GE હેલ્થકેર) પર બ્લોટ કરવામાં આવ્યા હતા. બિન-વિશિષ્ટ સ્થળોને અવરોધિત કરો અને TBST (ટ્વીન સાથે ટ્રિસ-બફર્ડ સલાઈન), વોશિંગ સ્ટેપ્સ અને TBST ઇન્ક્યુબેટમાં ગૌણ એન્ટિબોડીમાં 5% દૂધમાં પ્રાથમિક એન્ટિબોડી (વિગતો માટે કોષ્ટક S1 જુઓ) સાથે ઇન્ક્યુબેટ કરો. +4°C પર રાતોરાત પ્રાથમિક એન્ટિબોડી સાથે ઇન્ક્યુબેટ કરો. ધોવા પછી, ઓરડાના તાપમાને 2 કલાક માટે ગૌણ એન્ટિબોડી લાગુ કરો. ત્યારબાદ, એન્ટિ-β-એક્ટિન એન્ટિબોડી સાથે સમાન બ્લોટને ઇન્ક્યુબેટ કરીને, સમાન લોડિંગની પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી. કેમિલ્યુમિનેસેન્સમાં રૂપાંતરિત કરીને અને કેમિલ્યુમિનેસેન્સ (GE હેલ્થકેર) વધારીને શોધ.
કાચના કવરસ્લિપ્સ પર અગાઉ સીડ કરાયેલા ચેતાકોષોને 4% પેરાફોર્માલ્ડિહાઇડ (PFA)/PBS સાથે ઓરડાના તાપમાને 10 મિનિટ માટે નિર્દિષ્ટ સમયે ઠીક કરવામાં આવ્યા હતા. કવરસ્લિપ્સને પહેલા 0.1% ટ્રાઇટોન X-100/PBS સાથે ઓરડાના તાપમાને 5 મિનિટ માટે અને પછી બ્લોકિંગ બફર [3% બોવાઇન સીરમ આલ્બ્યુમિન (BSA)/PBS] માં પ્રવેશવામાં આવ્યા હતા. બીજા દિવસે, કવરસ્લિપ્સને બ્લોકિંગ બફરથી ધોવામાં આવ્યા હતા અને યોગ્ય ફ્લોરોફોર-કન્જુગેટેડ સેકન્ડરી એન્ટિબોડી સાથે ઓરડાના તાપમાને 2 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા; અંતે, નમૂનાઓને 4′,6-ડાયમિડિનો-2 સાથે PBS માં સારી રીતે ધોવામાં આવ્યા હતા -ફેનીલિંડોલ (DAPI) કાઉન્ટરસ્ટેઇન કરવામાં આવે છે અને પછી એક્વા-પોલી/માઉન્ટ સાથે માઇક્રોસ્કોપ સ્લાઇડ પર ઠીક કરવામાં આવે છે.
ઉંદરો (નર અને માદા) ને કેટામાઇન (130 મિલિગ્રામ/કિલો) અને ઝાયલાઝિન (10 મિલિગ્રામ/કિલો) ના ઇન્ટ્રાપેરીટોનિયલ ઇન્જેક્શન દ્વારા એનેસ્થેટાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા અને કાર્પ્રોફેન એનાલજેસિક (5 મિલિગ્રામ/કિલો) સાથે સબક્યુટેનીયસ રીતે આપવામાં આવ્યા હતા, અને ગરમ પેડથી સજ્જ સ્ટીરિયોટેક્ટિક સાધન (કોપ્ફ) માં મૂકવામાં આવ્યા હતા. ખોપરીને ખુલ્લી કરો અને મિસ બોનને અનુરૂપ સેરેબેલર કોર્ટેક્સના ભાગને પાતળો કરવા માટે ડેન્ટલ ડ્રિલનો ઉપયોગ કરો (લેમ્બડામાંથી: પૂંછડી 1.8, બાજુ 1, લોબ્યુલ્સ IV અને V ને અનુરૂપ). નીચે વેસ્ક્યુલેચરને વિક્ષેપિત ન થાય તે માટે ખોપરીમાં કાળજીપૂર્વક એક નાનું છિદ્ર બનાવવા માટે વક્ર સિરીંજ સોયનો ઉપયોગ કરો. પછી પાતળા દોરેલા કાચની રુધિરકેશિકાને ધીમે ધીમે માઇક્રો-હોલમાં દાખલ કરવામાં આવે છે (ડ્યુરા મેટરની વેન્ટ્રલ બાજુ પર -1.3 થી -1 સુધી), અને 200 થી 300 nl AAV ને મેન્યુઅલ સિરીંજ (નારીશીગે) વડે માઇક્રો-ઇન્જેક્ટર (નારીશીગે) માં 10 થી 20 મિનિટની વિંડોમાં ઓછા દબાણે ઘણી વખત ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવે છે. ઇન્ફ્યુઝન પછી, વાયરસ સંપૂર્ણપણે ફેલાય તે માટે કેશિલરી બીજી 10 મિનિટ માટે મૂકો. રુધિરકેશિકાઓ પાછી ખેંચી લીધા પછી, ઘાની બળતરા ઓછી કરવા અને પ્રાણીને સ્વસ્થ થવા દેવા માટે ત્વચાને કાળજીપૂર્વક સીવવામાં આવે છે. ઓપરેશન પછી ઘણા દિવસો સુધી પ્રાણીઓને પીડાનાશક દવાઓ (કેસ્પોફેન) સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી, જે સમય દરમિયાન તેમની શારીરિક સ્થિતિનું કાળજીપૂર્વક નિરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું અને પછી તેમને જણાવેલ સમય બિંદુ પર યુથેનાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા. બધી પ્રક્રિયાઓ યુરોપિયન, રાષ્ટ્રીય અને સંસ્થાકીય માર્ગદર્શિકા અનુસાર હાથ ધરવામાં આવી હતી અને જર્મનીના નોર્થ રાઈન-વેસ્ટફેલિયાના ઉમવેલ્ટ અને વર્બ્રોચરશુટ્ઝના લેન્ડેસમટફુરનાતુર દ્વારા મંજૂર કરવામાં આવી હતી.
પ્રાણીઓને કેટામાઇન (100 મિલિગ્રામ/કિલો) અને ઝાયલાઝિન (10 મિલિગ્રામ/કિલો) વડે એનેસ્થેટાઇઝ કરવામાં આવ્યું, અને હૃદયને પહેલા 0.1 M PBS અને પછી PBS માં 4% PFA સાથે પરફ્યુઝ કરવામાં આવ્યું. પેશીને કાપીને 4% PFA/PBS માં રાતોરાત 4°C પર ફિક્સ કરવામાં આવી. PBS માં ફિક્સ્ડ મગજમાંથી સેજિટલ સેક્શન (50 μm જાડા) તૈયાર કરવા માટે વાઇબ્રેટિંગ છરી (લેઇકા માઇક્રોસિસ્ટમ્સ GmbH, વિયેના, ઑસ્ટ્રિયા) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો. જ્યાં સુધી અન્યથા ઉલ્લેખ ન કરવામાં આવે ત્યાં સુધી, ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ (13) ઓરડાના તાપમાને ફ્રી-ફ્લોટિંગ સેક્શનનું સ્ટેનિંગ કરવામાં આવ્યું અને હલાવવામાં આવ્યું. ટૂંકમાં, પ્રથમ, મેળવેલા સ્લાઇસેસને ઓરડાના તાપમાને 15 મિનિટ માટે 0.5% ટ્રાઇટોન X-100/PBS સાથે પારગમ્ય કરવામાં આવ્યા; કેટલાક એપિટોપ્સ (Pcx અને Shmt2) માટે, 80°C (PH 9) પર ટ્રિસ-EDTA બફર દ્વારા આ પગલાને બદલે 25 મિનિટ માટે સ્લાઇસેસને ગરમ કરો. આગળ, વિભાગોને પ્રાથમિક એન્ટિબોડી (કોષ્ટક S1 જુઓ) સાથે બ્લોકિંગ બફર (3% BSA/PBS) માં 4°C તાપમાને રાતોરાત હલાવતા ઉકાળવામાં આવ્યા. બીજા દિવસે, વિભાગોને બ્લોકિંગ બફરથી ધોવામાં આવ્યા અને યોગ્ય ફ્લોરોફોર-કન્જુગેટેડ સેકન્ડરી એન્ટિબોડી સાથે ઓરડાના તાપમાને 2 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવ્યા; અંતે, વિભાગોને PBS માં સારી રીતે ધોવામાં આવ્યા, DAPI સાથે કાઉન્ટર-સ્ટેન કરવામાં આવ્યા, અને પછી માઇક્રોસ્કોપ સ્લાઇડ પર એક્વાપોલિમાઉન્ટ સાથે ઠીક કરવામાં આવ્યા.
નમૂનાની છબી બનાવવા માટે સફેદ પ્રકાશ લેસર અને 405 ડાયોડ અલ્ટ્રાવાયોલેટ લેસરથી સજ્જ લેસર સ્કેનીંગ કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપ (TCS SP8-X અથવા TCS ડિજિટલ લાઇટ શીટ, Leica માઇક્રોસિસ્ટમ્સ) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. ફ્લોરોફોરને ઉત્તેજિત કરીને અને હાઇબ્રિડ ડિટેક્ટર (HyDs) સાથે સિગ્નલ એકત્રિત કરીને, LAS-X સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ ક્રમિક મોડમાં Nyquist સેમ્પલિંગને અનુરૂપ સ્ટેક્ડ છબીઓ એકત્રિત કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો: બિન-માત્રાત્મક પેનલ્સ માટે, તે ખૂબ ગતિશીલ સિગ્નલો છે (ઉદાહરણ તરીકે, સોમેટિક કોષો અને ડેંડ્રાઇટ્સમાં) mtYFP) BrightR મોડમાં PN ની સંખ્યા શોધવા માટે HyD નો ઉપયોગ કરો). પૃષ્ઠભૂમિ ઘટાડવા માટે 0.3 થી 6 ns સુધી ગેટિંગ લાગુ કરવામાં આવે છે.
સૉર્ટ કરેલા કોષોનું રીઅલ-ટાઇમ ઇમેજિંગ. 1% B27 સપ્લિમેન્ટ અને 0.5 mM ગ્લુટામેક્સ ધરાવતા ન્યુરોબેસલ-A માધ્યમમાં સૉર્ટ કર્યા પછી, કોષોને તરત જ પોલી-એલ-લાયસિન-કોટેડ ગ્લાસ સ્લાઇડ્સ (μ-સ્લાઇડ8 વેલ, ઇબિડી, કેટલોગ નંબર 80826) પર સીડ કરવામાં આવ્યા હતા, અને પછી કોષોને સ્થિર થવા દેવા માટે તેને 1 કલાક માટે 37°C અને 5% CO2 પર રાખો. રીઅલ-ટાઇમ ઇમેજિંગ સફેદ લેસર, HyD, 63×[1.4 ન્યુમેરિકલ એપરચર (NA)] ઓઇલ ઓબ્જેક્ટિવ લેન્સ અને હીટિંગ સ્ટેજથી સજ્જ Leica SP8 લેસર સ્કેનીંગ કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપ પર કરવામાં આવ્યું હતું.
ઉંદરને ઝડપથી કાર્બન ડાયોક્સાઇડથી એનેસ્થેટાઇઝ કરવામાં આવ્યું અને તેનું માથું કાપી નાખવામાં આવ્યું, મગજને ખોપરીમાંથી ઝડપથી દૂર કરવામાં આવ્યું, અને 200μm જાડા (13C લેબલિંગ પ્રયોગ માટે) અથવા 275μm જાડા (બે ફોટોન પ્રયોગો માટે) સેજિટલ વિભાગમાં કાપી નાખવામાં આવ્યો. નીચેના પદાર્થોથી ભરેલો આઇસક્રીમ (HM-650 V, થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, વોલ્ડોર્ફ, જર્મની) નીચેના પદાર્થોથી ભરેલો છે: 125 mM બરફ-ઠંડુ, કાર્બન-સંતૃપ્ત (95% O2 અને 5% CO2) ઓછું Ca2 + કૃત્રિમ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM સોડિયમ ફોસ્ફેટ બફર, 25 mM NaHCO3, 25 mM ગ્લુકોઝ, 0.5 mM CaCl2 અને 3.5 mM MgCl2 (310 થી 330 mmol ઓસ્મોટિક દબાણ). મેળવેલા મગજના ટુકડાઓને ઉચ્ચ Ca2 + ACSF (૧૨૫.૦ mM NaCl, ૨.૫ mM KCl, ૧.૨૫ mM સોડિયમ ફોસ્ફેટ બફર, ૨૫.૦ mM NaHCO3, ૨૫.૦ mM d-ગ્લુકોઝ, ૧.૦ mM CaCl2 અને ૨.૦ mM MgCl2 (મધ્યમ) pH ૭.૪ અને ૩૧૦ થી ૩૨૦ mmol) ધરાવતા પ્રી-ઇન્ક્યુબેશન ચેમ્બરમાં સ્થાનાંતરિત કરો.
ઇમેજિંગ પ્રક્રિયા દરમિયાન, સ્લાઇસેસને એક સમર્પિત ઇમેજિંગ રૂમમાં ખસેડવામાં આવ્યા હતા, અને પ્રયોગ 32° થી 33°C ના સતત તાપમાને સતત ACSF પરફ્યુઝન હેઠળ કરવામાં આવ્યો હતો. સ્લાઇસ ઇમેજિંગ માટે Leica 25x ઓબ્જેક્ટિવ લેન્સ (NA 0.95, પાણી), Ti: સેફાયર લેસર (Chameleon Vision II, Coherent) થી સજ્જ મલ્ટિફોટોન લેસર સ્કેનીંગ માઇક્રોસ્કોપ (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. FLIM મોડ્યુલ (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2 નું FLIM. PNs ની સાયટોપ્લાઝમિક રેડોક્સ સ્થિતિમાં ફેરફારોને સેજિટલ મગજના ટુકડાઓમાં બે-ફોટોન FLIM દ્વારા માપવામાં આવ્યા હતા, જ્યાં Grx1-roGFP2 બાયોસેન્સરે PNs ને લક્ષ્ય બનાવ્યું હતું. PN સ્તરમાં, સ્લાઇસ સપાટીથી લગભગ 50 થી 80 μm નીચે સંપાદન ક્ષેત્ર પસંદ કરવામાં આવે છે જેથી ખાતરી થાય કે ત્યાં એક સક્ષમ PN (એટલે ​​કે, ડેંડ્રાઇટ્સ સાથે મણકાવાળી રચના અથવા ન્યુરોનલ મોર્ફોલોજિકલ ફેરફારોનો અભાવ) અને ડબલ પોઝિટિવ roGFP2 સેન્સર અને AAV એન્કોડિંગ shRNA PCx અથવા તેના નિયંત્રણ ક્રમ (દરેક સહ-અભિવ્યક્ત mCherry) છે. 2x ડિજિટલ ઝૂમ સાથે સિંગલ-સ્ટેક છબીઓ એકત્રિત કરો [ઉત્તેજના તરંગલંબાઇ: 890 nm; 512 nm 512 પિક્સેલ્સ]. શોધ: આંતરિક HyD, ફ્લોરોસીન આઇસોથિઓસાયનેટ (FITC) ફિલ્ટર જૂથ] અને 2 થી 3 મિનિટની અંદર છબી સરેરાશનો ઉપયોગ વળાંક ફિટિંગ માટે પૂરતા ફોટોન એકત્રિત થાય છે (કુલ 1000 ફોટોન). Grx1-roGFP2 પ્રોબની સંવેદનશીલતા અને FLIM સ્થિતિઓની ચકાસણી roGFP2 ના આયુષ્ય મૂલ્યનું નિરીક્ષણ કરીને કરવામાં આવી હતી જ્યારે પરફ્યુઝન ACSF માં બાહ્ય 10 mM H2O2 ઉમેરીને (ઓક્સિડેશન મહત્તમ કરવા માટે, પરિણામે આયુષ્ય વધે છે), અને પછી 2 mM ડિથિઓથ્રેઇટોલ ઉમેરીને (ઘટાડાની ડિગ્રી ઘટાડે છે, જેના પરિણામે આયુષ્યમાં ઘટાડો થાય છે) (આકૃતિ S8, D થી G). પ્રાપ્ત પરિણામોનું વિશ્લેષણ કરવા માટે FLIMfit 5.1.1 સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરો, સમગ્ર છબીના સિંગલ એક્સપોનેન્શિયલ ડિકે કર્વને માપેલા IRF (ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ રિસ્પોન્સ ફંક્શન) માં ફિટ કરો, અને χ2 લગભગ 1 છે. એક જ PN ના આયુષ્યની ગણતરી કરવા માટે, ચેતા શરીરની આસપાસનો માસ્ક મેન્યુઅલી દોરવામાં આવ્યો હતો, અને દરેક માસ્કમાં સરેરાશ આયુષ્યનો ઉપયોગ જથ્થાત્મકતા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.
મિટોકોન્ડ્રીયલ પોટેન્શિયલ વિશ્લેષણ. તીવ્ર વિભાગને 100 nM TMRM સાથે 30 મિનિટ માટે પરફ્યુઝ્ડ ACSF માં સીધા ઉમેરવામાં આવ્યા પછી, PN ના મિટોકોન્ડ્રીયલ પોટેન્શિયલ ફેરફારોને બે-ફોટોન માઇક્રોસ્કોપ દ્વારા માપવામાં આવ્યા. TMRM ઇમેજિંગ 920 nm પર પ્રોબને ઉત્તેજિત કરીને અને આંતરિક HyD (ટેટ્રામેથાઈલરોડામાઈન આઇસોથિઓસાયનેટ: 585/40 nm) નો ઉપયોગ કરીને સિગ્નલો એકત્રિત કરીને કરવામાં આવ્યું હતું; સમાન ઉત્તેજના તરંગલંબાઇનો ઉપયોગ કરીને પરંતુ mtYFP ની છબી બનાવવા માટે અલગ આંતરિક HyD (FITC :525/50) નો ઉપયોગ કરીને. સિંગલ સેલ સ્તરે મિટોકોન્ડ્રીયલ પોટેન્શિયલનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે ImageJ ના ઇમેજ કેલ્ક્યુલેટર પ્લગ-ઇનનો ઉપયોગ કરો. ટૂંકમાં, પ્લગ-ઇન સમીકરણ: સિગ્નલ = મિનિટ (mtYFP, TMRM) નો ઉપયોગ મિટોકોન્ડ્રીયલ પ્રદેશને ઓળખવા માટે થાય છે જે સંબંધિત ચેનલની સિંગલ-સ્ટેક કોન્ફોકલ છબીમાં પુર્કિન્જે સોમાલીમાં TMRM સિગ્નલ દર્શાવે છે. પછી પરિણામી માસ્કમાં પિક્સેલ ક્ષેત્રનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવે છે, અને પછી મિટોકોન્ડ્રીયલ સંભવિતતા દર્શાવતો મિટોકોન્ડ્રીયલ અપૂર્ણાંક મેળવવા માટે mtYFP ચેનલના અનુરૂપ થ્રેશોલ્ડ સિંગલ-સ્ટેક ઇમેજ પર સામાન્ય કરવામાં આવે છે.
છબીને હ્યુજેન્સ પ્રો (સાયન્ટિફિક વોલ્યુમ ઇમેજિંગ) સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને ડીકોન્વોલ્યુટ કરવામાં આવી હતી. ટાઇલ્સના સ્કેન કરેલા ચિત્રો માટે, LAS-X સોફ્ટવેર દ્વારા પૂરા પાડવામાં આવેલ ઓટોમેટિક સ્ટીચિંગ અલ્ગોરિધમનો ઉપયોગ કરીને સિંગલ ટાઇલનું મોન્ટેજ બનાવવામાં આવે છે. છબી કેલિબ્રેશન પછી, છબીને વધુ પ્રક્રિયા કરવા અને તેજ અને કોન્ટ્રાસ્ટને સમાન રીતે સમાયોજિત કરવા માટે ImageJ અને Adobe Photoshop નો ઉપયોગ કરો. ગ્રાફિક તૈયારી માટે Adobe Illustrator નો ઉપયોગ કરો.
mtDNA ફોકસ વિશ્લેષણ. કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપ દ્વારા DNA સામે એન્ટિબોડીઝ સાથે લેબલ કરાયેલા સેરેબેલર વિભાગો પર mtDNA જખમની સંખ્યાનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું. દરેક લક્ષ્ય ક્ષેત્ર કોષ શરીર અને દરેક કોષના ન્યુક્લિયસ માટે બનાવવામાં આવ્યું હતું, અને સંબંધિત ક્ષેત્રની ગણતરી મલ્ટી મેઝર પ્લગ-ઇન (ImageJ સોફ્ટવેર) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી. સાયટોપ્લાઝમિક ક્ષેત્ર મેળવવા માટે કોષ શરીર ક્ષેત્રમાંથી ન્યુક્લિયર ક્ષેત્ર બાદ કરો. અંતે, થ્રેશોલ્ડ ઇમેજ પર mtDNA દર્શાવતા સાયટોપ્લાઝમિક DNA બિંદુઓને આપમેળે માપવા માટે એનાલિસિસ પાર્ટિકલ્સ પ્લગ-ઇન (ImageJ સોફ્ટવેર) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, અને પ્રાપ્ત પરિણામો CTRL ઉંદરના PN સરેરાશ સુધી સામાન્ય કરવામાં આવ્યા હતા. પરિણામો પ્રતિ કોષ ન્યુક્લિયોસાઇડ્સની સરેરાશ સંખ્યા તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યા છે.
પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ. સિંગલ સેલ સ્તરે PN માં પ્રોટીન અભિવ્યક્તિનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે ImageJ ના ઇમેજ કેલ્ક્યુલેટર પ્લગ-ઇનનો ઉપયોગ કરો. ટૂંકમાં, સંબંધિત ચેનલની સિંગલ-લેયર કોન્ફોકલ છબીમાં, સમીકરણ દ્વારા: સિગ્નલ = મિનિટ (mtYFP, એન્ટિબોડી), પુર્કીનામાં ચોક્કસ એન્ટિબોડીને રોગપ્રતિકારક શક્તિ દર્શાવતો માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રદેશ ઓળખવામાં આવે છે. પછી પરિણામી માસ્કમાં પિક્સેલ ક્ષેત્રનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવે છે, અને પછી પ્રદર્શિત પ્રોટીનના માઇટોકોન્ડ્રીયલ અપૂર્ણાંક મેળવવા માટે mtYFP ચેનલના અનુરૂપ થ્રેશોલ્ડ સિંગલ-સ્ટેક છબીમાં સામાન્ય કરવામાં આવે છે.
પુર્કિન્જે કોષ ઘનતા વિશ્લેષણ. ImageJ ના સેલ કાઉન્ટર પ્લગ-ઇનનો ઉપયોગ પુર્કિન્જે કોષની સંખ્યાને ગણતરી કરેલ કોષો દ્વારા કબજે કરેલા સેરેબેલર રિંગની લંબાઈ દ્વારા વિભાજીત કરીને પુર્કિન્જે ઘનતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.
નમૂનાની તૈયારી અને સંગ્રહ. નિયંત્રણ જૂથ અને Mfn2cKO ઉંદરોના મગજને 0.1 M ફોસ્ફેટ બફર (PB) માં 2% PFA/2.5% ગ્લુટારાલ્ડીહાઇડમાં ફિક્સ કરવામાં આવ્યા હતા, અને પછી કોરોનલ સેક્શન સિલિએટ્સ (લેઇકા માઇક્રોસિસ્ટમ GmbH, વિયેના, ઑસ્ટ્રિયા) (જાડાઈ 50 થી 60 μm) નો ઉપયોગ કરીને તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા. પછી ઓરડાના તાપમાને 1% os ટેટ્રાઓક્સાઇડ અને 1.5% પોટેશિયમ ફેરોસાયનાઇડમાં PB બફરમાં 1 કલાક માટે ફિક્સ કરવામાં આવ્યા હતા. આ સેક્શનને ત્રણ વખત નિસ્યંદિત પાણીથી ધોવામાં આવ્યા હતા, અને પછી 20 મિનિટ માટે 1% યુરેનાઇલ એસિટેટ ધરાવતા 70% ઇથેનોલથી રંગવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ આ સેક્શનને ગ્રેડેડ આલ્કોહોલમાં ડિહાઇડ્રેટ કરવામાં આવ્યા હતા અને સિલિકોન-કોટેડ ગ્લાસ સ્લાઇડ્સ વચ્ચે ડર્કુપન ACM (એરાલ્ડાઇટ કાસ્ટિંગ રેઝિન M) ઇપોક્સી રેઝિન (ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી સાયન્સ, કેટલોગ નંબર 14040) માં એમ્બેડ કરવામાં આવ્યા હતા, અને અંતે 60°C પર 48 કલાક માટે ઓવનમાં પોલિમરાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા. સેરેબેલર કોર્ટેક્સ વિસ્તાર પસંદ કરવામાં આવ્યો હતો અને લેઇકા અલ્ટ્રાકટ (લેઇકા માઇક્રોસિસ્ટમ GmbH, વિયેના, ઑસ્ટ્રિયા) પર 50 nm અલ્ટ્રાથિન વિભાગો કાપવામાં આવ્યા હતા અને પોલિસ્ટરીન ફિલ્મથી કોટેડ 2×1 mm કોપર સ્લિટ ગ્રીડ પર પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા. આ વિભાગોને H2O માં 4% યુરેનાઇલ એસિટેટના દ્રાવણથી 10 મિનિટ માટે રંગવામાં આવ્યા હતા, H2O થી ઘણી વખત ધોવામાં આવ્યા હતા, પછી 10 મિનિટ માટે H2O માં રેનોલ્ડ્સ લીડ સાઇટ્રેટ સાથે, અને પછી H2O થી ઘણી વખત ધોવામાં આવ્યા હતા. TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 ડિજિટલ કેમેરા (TVIPS GmbH, Gauting, USA) નો ઉપયોગ કરીને ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપ ફિલિપ્સ CM100 (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, વોલ્થમ, MA, USA) સાથે માઇક્રોગ્રાફ લેવામાં આવ્યા હતા. જર્મની).
AAV થી સંક્રમિત ઉંદરો માટે, મગજને અલગ કરીને 1 મીમી જાડા સેજિટલ વિભાગમાં કાપવામાં આવ્યું હતું, અને AAV-સંક્રમિત રિંગ (એટલે ​​\u200b\u200bકે, mCherry એક્સપ્રેસિંગ) ઓળખવા માટે ફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ કરીને સેરેબેલમની તપાસ કરવામાં આવી હતી. ફક્ત એવા પ્રયોગોનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે જેમાં AAV ઇન્જેક્શન ઓછામાં ઓછા બે સળંગ સેરેબેલર રિંગ્સમાં પુર્કિન્જે કોષ સ્તર (એટલે ​​કે લગભગ સમગ્ર સ્તર) ની ખૂબ ઊંચી ટ્રાન્સડક્શન કાર્યક્ષમતામાં પરિણમે છે. AAV-ટ્રાન્સડ્યુસ્ડ લૂપને રાતોરાત પોસ્ટ-ફિક્સેશન (0.1 M કોકોટ બફરમાં 4% PFA અને 2.5% ગ્લુટારાલ્ડીહાઇડ) માટે માઇક્રોડિસેક્ટ કરવામાં આવ્યો હતો અને વધુ પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી. EPON એમ્બેડિંગ માટે, ફિક્સ્ડ ટીશ્યુને 0.1 M સોડિયમ કોકોટ બફર (એપ્લિકેમ) થી 2% OsO4 (os, સાયન્સ સર્વિસીસ; Caco) સાથે 0.1 M સોડિયમ કોકોટ બફર (એપ્લિકેમ) માં 4 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું હતું, પછી 2 કલાક માટે ધોવામાં આવ્યું હતું. 0.1 M કોકામાઇડ બફર સાથે 3 વખત પુનરાવર્તન કરો. ત્યારબાદ, ઇથેનોલની ચઢતી શ્રેણીનો ઉપયોગ દરેક ઇથેનોલ દ્રાવણને 4°C પર 15 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો જેથી પેશીઓને ડિહાઇડ્રેટ કરી શકાય. પેશીઓને પ્રોપીલીન ઓક્સાઇડમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવી અને EPON (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) માં 4°C પર રાતોરાત ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવી. પેશીઓને તાજા EPON માં 2 કલાક માટે ઓરડાના તાપમાને મૂકો, અને પછી તેને 62°C પર 72 કલાક માટે એમ્બેડ કરો. 70 nm અલ્ટ્રાથિન વિભાગો કાપવા માટે અલ્ટ્રામાઇક્રોટોમ (લેઇકા માઇક્રોસિસ્ટમ્સ, UC6) અને ડાયમંડ છરી (ડાયાટોમ, બાયલ, સ્વિટ્ઝર્લૅન્ડ) નો ઉપયોગ કરો, અને 37°C પર 15 મિનિટ માટે 1.5% યુરેનાઇલ એસિટેટથી સ્ટેન કરો, અને 4 મિનિટ માટે લીડ સાઇટ્રેટ સોલ્યુશનથી સ્ટેન કરો. કેમેરા વનવ્યૂ 4K 16-બીટ (ગેટન) અને ડિજિટલમાઇક્રોગ્રાફ સોફ્ટવેર (ગેટન) થી સજ્જ JEM-2100 પ્લસ ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપ (JEOL) નો ઉપયોગ કરીને ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોગ્રાફ લેવામાં આવ્યા હતા. વિશ્લેષણ માટે, 5000× અથવા 10,000× ડિજિટલ ઝૂમ સાથે ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોગ્રાફ્સ મેળવવામાં આવ્યા હતા.
મિટોકોન્ડ્રિયાનું મોર્ફોલોજિકલ વિશ્લેષણ. બધા વિશ્લેષણ માટે, ImageJ સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને ડિજિટલ છબીઓમાં વ્યક્તિગત મિટોકોન્ડ્રિયાના રૂપરેખા મેન્યુઅલી દર્શાવેલ હતા. વિવિધ મોર્ફોલોજિકલ પરિમાણોનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે. મિટોકોન્ડ્રિયાલ ઘનતા દરેક કોષના કુલ મિટોકોન્ડ્રિયાલ વિસ્તારને સાયટોપ્લાઝમ વિસ્તાર (સાયટોપ્લાઝમ વિસ્તાર = કોષ વિસ્તાર-કોષ ન્યુક્લિયસ વિસ્તાર) × 100 દ્વારા વિભાજીત કરીને મેળવેલ ટકાવારી તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવે છે. મિટોકોન્ડ્રિયાની ગોળાકારતા સૂત્ર [4π∙(ક્ષેત્ર/પરિમિતિ 2)] દ્વારા ગણવામાં આવે છે. મિટોકોન્ડ્રિયાના ઇસ્ટા મોર્ફોલોજીનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું અને તેમના મુખ્ય આકાર અનુસાર બે શ્રેણીઓ ("ટ્યુબ્યુલર" અને "ફોલ્લા") માં વિભાજિત કરવામાં આવ્યું હતું.
ઓટોફેગોસોમ/લાઇસોસોમ સંખ્યા અને ઘનતા વિશ્લેષણ. ડિજિટલ છબીમાં દરેક ઓટોફેગોસોમ/લાઇસોસોમના રૂપરેખાને મેન્યુઅલી રૂપરેખા આપવા માટે ImageJ સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરો. ઓટોફેગોસોમ/લાઇસોસોમ ક્ષેત્રને ટકાવારી તરીકે દર્શાવવામાં આવે છે જે દરેક કોષના કુલ ઓટોફેગોસોમ/લાઇસોસોમ રચના ક્ષેત્રને સાયટોપ્લાઝમ ક્ષેત્ર (સાયટોપ્લાઝમ ક્ષેત્ર = કોષ ક્ષેત્ર-ન્યુક્લિયસ ક્ષેત્ર) × 100 દ્વારા વિભાજીત કરીને ગણતરી કરવામાં આવે છે. ઓટોફેગોસોમ/લાઇસોસોમની ઘનતા કુલ સંખ્યાને કોષ દીઠ ઓટોફેગોસોમ/લાઇસોસોમ રચનાઓની સંખ્યા (સાયટોપ્લાઝમિક ક્ષેત્રની દ્રષ્ટિએ) (સાયટોપ્લાઝમિક ક્ષેત્ર = કોષ ક્ષેત્ર-ન્યુક્લિયર ક્ષેત્ર) દ્વારા વિભાજીત કરીને ગણવામાં આવે છે.
તીવ્ર વિભાગીકરણ અને નમૂના તૈયારી માટે લેબલિંગ. ગ્લુકોઝ લેબલિંગની જરૂર હોય તેવા પ્રયોગો માટે, તીવ્ર મગજના ટુકડાઓને પ્રી-ઇન્ક્યુબેશન ચેમ્બરમાં સ્થાનાંતરિત કરો, જેમાં સંતૃપ્ત કાર્બન (95% O2 અને 5% CO2), ઉચ્ચ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM સોડિયમ ફોસ્ફેટ બફર, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ગ્લુકોઝ, 1.0 mM CaCl2 અને 2.0 mM MgCl2, pH 7.4 અને 310 થી 320 mOsm સુધી સમાયોજિત થાય છે), જેમાં ગ્લુકોઝ 13 C 6- ગ્લુકોઝ રિપ્લેસમેન્ટ (યુરીસોટોપ, કેટલોગ નંબર CLM-1396) હોય છે. પાયરુવેટ લેબલિંગની જરૂર હોય તેવા પ્રયોગો માટે, તીવ્ર મગજના ટુકડાઓને ઉચ્ચ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM સોડિયમ ફોસ્ફેટ બફર, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ગ્લુકોઝ, 1.0 mM CaCl2) માં સ્થાનાંતરિત કરો અને 2.0 mM MgCl2 ઉમેરો, pH 7.4 અને 310 થી 320mOsm સુધી સમાયોજિત કરો, અને 1 mM 1-[1-13C] પાયરુવેટ (યુરીસોટોપ, કેટલોગ નંબર CLM-1082) ઉમેરો. વિભાગોને 37°C પર 90 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટ કરો. પ્રયોગના અંતે, વિભાગોને 75 mM એમોનિયમ કાર્બોનેટ ધરાવતા જલીય દ્રાવણ (pH 7.4) થી ઝડપથી ધોવામાં આવ્યા, અને પછી 40:40:20 (v:v:v) એસિટોનાઇટ્રાઇલ (ACN): મિથેનોલ: પાણીમાં એકરૂપ કરવામાં આવ્યા. વિભાગોને 30 મિનિટ માટે બરફ પર ઉકાળ્યા પછી, નમૂનાઓને 4°C પર 10 મિનિટ માટે 21,000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા, અને સ્પષ્ટ સુપરનેટન્ટને સ્પીડવેક કોન્સન્ટ્રેટરમાં સૂકવવામાં આવ્યું. પરિણામી સૂકા મેટાબોલાઇટ પેલેટને વિશ્લેષણ સુધી -80°C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું.
૧૩ સી-લેબલવાળા એમિનો એસિડનું લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી-માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી વિશ્લેષણ. લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી-માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (LC-MS) વિશ્લેષણ માટે, મેટાબોલિટ પેલેટને 75μl LC-MS ગ્રેડ પાણી (હનીવેલ) માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યું હતું. 4°C પર 5 મિનિટ માટે 21,000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પછી, એમિનો એસિડ ફ્લક્સ વિશ્લેષણ માટે 20 μl સ્પષ્ટ સુપરનેટન્ટનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, જ્યારે બાકીના અર્કનો ઉપયોગ તરત જ આયન વિશ્લેષણ માટે કરવામાં આવ્યો હતો (નીચે જુઓ). એમિનો એસિડ વિશ્લેષણ અગાઉ વર્ણવેલ બેન્ઝોયલ ક્લોરાઇડ ડેરિવેટાઇઝેશન પ્રોટોકોલ (55, 56) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. પ્રથમ પગલામાં, 100 mM સોડિયમ કાર્બોનેટ (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) નું 10μl મેટાબોલિટ અર્કના 20μl માં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું, અને પછી 2% બેન્ઝોયલ ક્લોરાઇડ (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) નું 10μl LC ગ્રેડ ACN માં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. નમૂનાને થોડા સમય માટે વમળમાં ફેરવવામાં આવ્યો અને પછી 20°C પર 5 મિનિટ માટે 21,000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું. ક્લીયર કરેલ સુપરનેટન્ટને શંકુ કાચના ઇન્સર્ટ (200 μl વોલ્યુમ) સાથે 2 મિલી ઓટોસેમ્પલર શીશીમાં સ્થાનાંતરિત કરો. Q-Exactive (QE)-HF (અલ્ટ્રા હાઇ ફીલ્ડ ઓર્બિટ્રેપ) હાઇ-રિઝોલ્યુશન પ્રિસિઝન માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) સાથે જોડાયેલ Acquity iClass અલ્ટ્રા-હાઇ પરફોર્મન્સ LC સિસ્ટમ (વોટર્સ) નો ઉપયોગ કરીને નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. વિશ્લેષણ માટે, ડેરિવેટાઇઝ્ડ નમૂનાના 2μl ને 1.8μm કણો ધરાવતા 100×1.0 mm હાઇ-સ્ટ્રેન્થ સિલિકા T3 કોલમ (વોટર્સ) માં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યું. પ્રવાહ દર 100μl/મિનિટ છે, અને બફર સિસ્ટમમાં બફર A (10 mM એમોનિયમ ફોર્મેટ અને પાણીમાં 0.15% ફોર્મિક એસિડ) અને બફર B (ACN) હોય છે. ગ્રેડિયન્ટ નીચે મુજબ છે: 0 મિનિટ પર 0%B; 0%B. 0 થી 0.1 મિનિટ પર 0 થી 15% B; 0.1 થી 0.5 મિનિટ પર 15 થી 17% B; 0.5 થી 14 મિનિટ પર 17 થી 55% B; 14 થી 14.5 મિનિટ પર 55 થી 70% B; 14 થી 14.5 મિનિટ પર 14.5 થી 70 થી 100% B; 18 થી 19 મિનિટ પર 100% B; 19 થી 19.1 મિનિટ પર 100 થી 0% B; 19.1 થી 28 મિનિટ પર 0% B (55, 56). QE-HF માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર 50 થી 750 ની m/z (માસ/ચાર્જ રેશિયો) ની માસ રેન્જ સાથે પોઝિટિવ આયનાઇઝેશન મોડમાં કાર્ય કરે છે. લાગુ રિઝોલ્યુશન 60,000 છે, અને મેળવેલ ગેઇન કંટ્રોલ (AGC) આયન લક્ષ્ય 3×106 છે, અને મહત્તમ આયન સમય 100 મિલિસેકન્ડ છે. ગરમ ઇલેક્ટ્રોસ્પ્રે આયનાઇઝેશન (ESI) સ્ત્રોત 3.5 kV ના સ્પ્રે વોલ્ટેજ, 250°C ના કેશિલરી તાપમાન, 60 AU (મનસ્વી એકમો) ના આવરણ એરફ્લો અને 20 AU. 250°C ના સહાયક એરફ્લો પર કાર્ય કરે છે. S લેન્સ 60 AU પર સેટ છે.
13C લેબલવાળા ઓર્ગેનિક એસિડનું એનિઓન ક્રોમેટોગ્રાફી-MS વિશ્લેષણ. બાકીના મેટાબોલિટ અવક્ષેપ (55μl) નું વિશ્લેષણ ડાયોનેક્સ આયન ક્રોમેટોગ્રાફી સિસ્ટમ (ICS 5000+, થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું જે QE-HF માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) સાથે જોડાયેલ છે. ટૂંકમાં, 5μl મેટાબોલિટ અર્કને HPLC (2 mm×250 mm, કણ કદ 4μm, થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) થી સજ્જ ડાયોનેક્સ આયનપેક AS11-HC કોલમમાં 1 ના ફિલિંગ રેશિયો સાથે પુશ-ઇન આંશિક લૂપ મોડમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યું હતું. ) ડાયોનેક્સ આયનપેક AG11-HC ગાર્ડ કોલમ (2 mm x 50 mm, 4μm, થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક). કોલમનું તાપમાન 30°C પર જાળવવામાં આવે છે, અને ઓટોસેમ્પલર 6°C પર સેટ છે. એલ્યુએન્ટ જનરેટર દ્વારા પોટેશિયમ હાઇડ્રોક્સાઇડ ગ્રેડિયન્ટ જનરેટ કરવા માટે ડીયોનાઇઝ્ડ પાણી સાથે પૂરા પાડવામાં આવેલ પોટેશિયમ હાઇડ્રોક્સાઇડ કારતૂસનો ઉપયોગ કરો. ૩૮૦μl/મિનિટના પ્રવાહ દરે ચયાપચયનું વિભાજન, નીચેના ગ્રેડિયન્ટનો ઉપયોગ કરીને: ૦ થી ૩ મિનિટ, ૧૦ mM KOH; ૩ થી ૧૨ મિનિટ, ૧૦ થી ૫૦ mM KOH; ૧૨ થી ૧૯ મિનિટ, ૫૦ થી ૧૦૦ mM KOH; ૧૯ થી ૨૧ મિનિટ, ૧૦૦ mM KOH; ૨૧ થી ૨૧.૫ મિનિટ, ૧૦૦ થી ૧૦ mM KOH. સ્તંભને ૧૦ mM KOH હેઠળ ૮.૫ મિનિટ માટે ફરીથી સંતુલિત કરવામાં આવ્યો.
કોલમ પછી એલ્યુટેડ મેટાબોલાઇટ્સને 150μl/મિનિટ આઇસોપ્રોપેનોલ સપ્લિમેન્ટ સ્ટ્રીમ સાથે જોડવામાં આવે છે અને પછી નકારાત્મક આયનીકરણ મોડમાં કાર્યરત ઉચ્ચ-રિઝોલ્યુશન માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર તરફ નિર્દેશિત કરવામાં આવે છે. MS 60,000 ના રિઝોલ્યુશન સાથે m/z 50 થી 750 સુધીના માસ રેન્જનું નિરીક્ષણ કરી રહ્યું છે. AGC 1×106 પર સેટ છે, અને મહત્તમ આયન સમય 100 ms પર રાખવામાં આવ્યો છે. ગરમ ESI સ્ત્રોત 3.5 kV ના સ્પ્રે વોલ્ટેજ પર સંચાલિત કરવામાં આવ્યો હતો. આયન સ્ત્રોતની અન્ય સેટિંગ્સ નીચે મુજબ છે: કેશિકા તાપમાન 275°C; આવરણ ગેસ પ્રવાહ, 60 AU; સહાયક ગેસ પ્રવાહ, 300°C પર 20 AU, અને S લેન્સ 60 AU પર સેટિંગ.
13C લેબલવાળા મેટાબોલાઇટ્સનું ડેટા વિશ્લેષણ. આઇસોટોપ રેશિયોના ડેટા વિશ્લેષણ માટે ટ્રેસફાઇન્ડર સોફ્ટવેર (સંસ્કરણ 4.2, થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) નો ઉપયોગ કરો. દરેક સંયોજનની ઓળખ વિશ્વસનીય સંદર્ભ સંયોજન દ્વારા ચકાસવામાં આવી હતી અને સ્વતંત્ર રીતે વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. આઇસોટોપ સંવર્ધન વિશ્લેષણ કરવા માટે, દરેક 13C આઇસોટોપ (Mn) ના કાઢવામાં આવેલા આયન ક્રોમેટોગ્રામ (XIC) નો વિસ્તાર [M + H] + માંથી કાઢવામાં આવ્યો હતો, જ્યાં n એ લક્ષ્ય સંયોજનનો કાર્બન નંબર છે, જેનો ઉપયોગ એમિનો એસિડનું વિશ્લેષણ કરવા માટે થાય છે અથવા [MH] + નો ઉપયોગ આયનોનું વિશ્લેષણ કરવા માટે થાય છે. XIC ની માસ ચોકસાઈ પ્રતિ મિલિયન પાંચ ભાગો કરતાં ઓછી છે, અને RT ની ચોકસાઈ 0.05 મિનિટ છે. સંવર્ધન વિશ્લેષણ દરેક શોધાયેલ આઇસોટોપના ગુણોત્તરને અનુરૂપ સંયોજનના તમામ આઇસોટોપના સરવાળા સાથે ગણતરી કરીને કરવામાં આવે છે. આ ગુણોત્તર દરેક આઇસોટોપ માટે ટકાવારી મૂલ્યો તરીકે આપવામાં આવે છે, અને પરિણામો દાઢ ટકા સંવર્ધન (MPE) તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવે છે, જેમ કે અગાઉ વર્ણવેલ છે (42).
ફ્રોઝન ન્યુરોન પેલેટને બરફ-ઠંડા 80% મિથેનોલ (v/v) માં એકરૂપ કરવામાં આવ્યું હતું, વમળમાં ફેરવવામાં આવ્યું હતું અને -20°C પર 30 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું. નમૂનાને ફરીથી વમળમાં ફેરવો અને +4°C પર 30 મિનિટ માટે હલાવો. નમૂનાને 4°C પર 5 મિનિટ માટે 21,000 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું, અને પછી પરિણામી સુપરનેટન્ટને 25°C પર સ્પીડવેક કોન્સન્ટ્રેટરનો ઉપયોગ કરીને અનુગામી વિશ્લેષણ માટે એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું અને સૂકવવામાં આવ્યું હતું. ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ, સૉર્ટ કરેલા કોષોના એમિનો એસિડ પર LC-MS વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ટ્રેસફાઇન્ડર (સંસ્કરણ 4.2, થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) નો ઉપયોગ કરીને, દરેક સંયોજનના મોનોઇસોટોપિક માસનો ઉપયોગ કરીને ડેટા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. પ્રીપ્રોસેસકોર સોફ્ટવેર પેકેજ (57) નો ઉપયોગ કરીને મેટાબોલિટ ડેટાનું ક્વોન્ટાઇલ નોર્મલાઇઝેશન કરવામાં આવ્યું હતું.
સ્લાઇસ તૈયારી. ઉંદરને કાર્બન ડાયોક્સાઇડથી ઝડપથી એનેસ્થેટાઇઝ કરવામાં આવ્યો અને તેનું માથું કાપી નાખવામાં આવ્યું, મગજને ખોપરીમાંથી ઝડપથી દૂર કરવામાં આવ્યું, અને બરફથી ભરેલી વાઇબ્રેટિંગ છરી (HM-650 V, થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, વોલ્ડોર્ફ, જર્મની) નો ઉપયોગ કરીને તેને 300 થી 375 μm સેગિટલ વિભાગોમાં કાપવામાં આવ્યો. કોલ્ડ કાર્બન ગેસિફિકેશન (95% O2 અને 5% CO2) લો Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM સોડિયમ ફોસ્ફેટ બફર, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ગ્લુકોઝ, 1.0 mM CaCl2 અને 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 અને 310 થી 330 mOsm સુધી સમાયોજિત કરો). મેળવેલા મગજના ટુકડાઓને એવા ચેમ્બરમાં સ્થાનાંતરિત કરો જેમાં Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM સોડિયમ ફોસ્ફેટ બફર, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ગ્લુકોઝ, 4.0 mM CaCl2 અને mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 અને 310 થી 320 mOsm હોય. સ્લાઇસેસને 20 થી 30 મિનિટ માટે સંગ્રહિત કરો જેથી રેકોર્ડિંગ પહેલાં તેને પુનઃસ્થાપિત કરી શકાય.
રેકોર્ડિંગ. બધા રેકોર્ડિંગ માટે ફિક્સ્ડ રેકોર્ડિંગ ચેમ્બર અને 20x વોટર ઇમરસન ઓબ્જેક્ટિવ લેન્સ (સાયન્ટિફિકા) થી સજ્જ માઇક્રોસ્કોપ સ્ટેજનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. પુક્ટેટિવ ​​પુર્કિન્જે કોષોને (i) શરીરના કદ, (ii) સેરેબેલમનું એનાટોમિકલ સ્થાન અને (iii) ફ્લોરોસન્ટ mtYFP રિપોર્ટર જનીનની અભિવ્યક્તિ દ્વારા ઓળખવામાં આવ્યા હતા. 5 થી 11 મેગોહમ્સના ટિપ રેઝિસ્ટન્સવાળા પેચ પિપેટને બોરોસિલિકેટ ગ્લાસ કેશિકા (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, સાયન્સ પ્રોડક્ટ્સ, હોફેઇમ, જર્મની) અને આડી પિપેટ ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ્સ (P-1000, સટર), નોવાટો, CA) દ્વારા બહાર કાઢવામાં આવે છે. બધા રેકોર્ડિંગ ELC-03XS npi પેચ ક્લેમ્પ એમ્પ્લીફાયર (npi ઇલેક્ટ્રોનિક GmbH, Tam, જર્મની) દ્વારા કરવામાં આવ્યા હતા, જે સોફ્ટવેર સિગ્નલ (સંસ્કરણ 6.0, કેમ્બ્રિજ ઇલેક્ટ્રોનિક, કેમ્બ્રિજ, યુકે) દ્વારા નિયંત્રિત હતું. પ્રયોગ 12.5 kHz ના નમૂના દરે રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યો હતો. સિગ્નલને અનુક્રમે 1.3 અને 10 kHz ની કટઓફ ફ્રીક્વન્સીવાળા બે શોર્ટ-પાસ બેસેલ ફિલ્ટર્સ દ્વારા ફિલ્ટર કરવામાં આવે છે. એમ્પ્લીફાયરનો ઉપયોગ કરીને વળતર સર્કિટ દ્વારા પટલ અને પીપેટની કેપેસિટેન્સની ભરપાઈ કરવામાં આવે છે. બધા પ્રયોગો ઓર્કા-ફ્લેશ 4.0 કેમેરા (હમામાત્સુ, ગેર્ડેન, જર્મની) ના નિયંત્રણ હેઠળ કરવામાં આવ્યા હતા, જે હોકાવો સોફ્ટવેર (સંસ્કરણ 2.8, હમામાત્સુ, ગેર્ડેન, જર્મની) દ્વારા નિયંત્રિત હતું.
નિયમિત આખા કોષનું રૂપરેખાંકન અને વિશ્લેષણ. રેકોર્ડિંગ પહેલાં તરત જ, નીચેના પદાર્થો ધરાવતા આંતરિક દ્રાવણથી પીપેટ ભરો: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM પોટેશિયમ ગ્લુકોનેટ, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) અને 10.0 mM ક્રિએટિનાઇન ફોસ્ફેટને pH 7.25 માં સમાયોજિત કરવામાં આવ્યા હતા, અને ઓસ્મોટિક દબાણ 290 mOsm (સુક્રોઝ) હતું. પટલને ફાટવા માટે 0 pA નું બળ લાગુ કર્યા પછી તરત જ, વિશ્રામી પટલ સંભવિત માપવામાં આવ્યું હતું. ઇનપુટ પ્રતિકાર -40, -30, -20, અને -10 pA ના હાઇપરપોલરાઇઝ્ડ કરંટ લાગુ કરીને માપવામાં આવે છે. વોલ્ટેજ પ્રતિભાવની તીવ્રતા માપો અને ઇનપુટ પ્રતિકારની ગણતરી કરવા માટે ઓહ્મના નિયમનો ઉપયોગ કરો. વોલ્ટેજ ક્લેમ્પમાં 5 મિનિટ માટે સ્વયંભૂ પ્રવૃત્તિ રેકોર્ડ કરવામાં આવી હતી, અને sPSC ને Igor Pro (સંસ્કરણ 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) માં અર્ધ-સ્વચાલિત ઓળખ સ્ક્રિપ્ટનો ઉપયોગ કરીને ઓળખવામાં આવ્યું હતું અને માપવામાં આવ્યું હતું. IV વળાંક અને સ્થિર-સ્થિતિ પ્રવાહ બેટરીને વિવિધ પોટેન્શિયલ (-110 mV થી શરૂ કરીને) પર ક્લેમ્પ કરીને અને 5 mV પગલાંમાં વોલ્ટેજ વધારીને માપવામાં આવે છે. AP ના ઉત્પાદનનું પરીક્ષણ વિધ્રુવીકરણ પ્રવાહ લાગુ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. વિધ્રુવીકરણ પ્રવાહ પલ્સ લાગુ કરતી વખતે કોષને -70 mV પર ક્લેમ્પ કરો. દરેક રેકોર્ડિંગ યુનિટના સ્ટેપ કદને અલગથી ગોઠવો (10 થી 60 pA). સૌથી વધુ AP આવર્તનનું કારણ બને છે તે પલ્સ સ્પાઇક્સની મેન્યુઅલી ગણતરી કરીને મહત્તમ AP આવર્તનની ગણતરી કરો. AP થ્રેશોલ્ડનું વિશ્લેષણ વિધ્રુવીકરણ પલ્સના બીજા વ્યુત્પન્નનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવે છે જે પહેલા એક અથવા વધુ AP ને ટ્રિગર કરે છે.
છિદ્રિત પેચ રૂપરેખાંકન અને વિશ્લેષણ. પ્રમાણભૂત પ્રોટોકોલનો ઉપયોગ કરીને છિદ્રિત પેચ રેકોર્ડિંગ કરો. ATP- અને GTP-મુક્ત પીપેટનો ઉપયોગ કરો જેમાં નીચેના ઘટકો ન હોય: 128 mM ગ્લુકોનેટ K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA અને 2 mM MgCl2, અને pH 7.2 (KOH નો ઉપયોગ કરીને) માં સમાયોજિત કરો. કોષ પટલની અનિયંત્રિત અભેદ્યતાને રોકવા માટે ATP અને GTP ને અંતઃકોશિક દ્રાવણમાંથી બાકાત રાખવામાં આવે છે. પંચ્ડ પેચ રેકોર્ડ મેળવવા માટે પેચ પીપેટ એમ્ફોટેરિસિન ધરાવતા આંતરિક દ્રાવણ (આશરે 200 થી 250μg/ml; G4888, સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) થી ભરવામાં આવે છે. એમ્ફોટેરિસિનને ડાયમિથાઇલ સલ્ફોક્સાઇડમાં ઓગળવામાં આવ્યું હતું (અંતિમ સાંદ્રતા: 0.1 થી 0.3%; DMSO; D8418, સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ). ઉપયોગમાં લેવાતા DMSO ની સાંદ્રતાનો અભ્યાસ કરાયેલ ચેતાકોષો પર કોઈ નોંધપાત્ર અસર પડી ન હતી. પંચિંગ પ્રક્રિયા દરમિયાન, ચેનલ પ્રતિકાર (Ra) નું સતત નિરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું, અને Ra અને AP ના કંપનવિસ્તાર સ્થિર થયા પછી (20-40 મિનિટ) પ્રયોગ શરૂ કરવામાં આવ્યો હતો. સ્વયંસ્ફુરિત પ્રવૃત્તિને 2 થી 5 મિનિટ માટે વોલ્ટેજ અને/અથવા વર્તમાન ક્લેમ્પમાં માપવામાં આવે છે. Igor Pro (સંસ્કરણ 7.05.2, વેવમેટ્રિક્સ, યુએસએ), એક્સેલ (સંસ્કરણ 2010, માઇક્રોસોફ્ટ કોર્પોરેશન, રેડમંડ, યુએસએ) અને ગ્રાફપેડ પ્રિઝમ (સંસ્કરણ 8.1.2, ગ્રાફપેડ સોફ્ટવેર ઇન્ક., લા જોલા, સીએ). યુનાઇટેડ સ્ટેટ્સનો ઉપયોગ કરીને ડેટા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. સ્વયંસ્ફુરિત APs ને ઓળખવા માટે, IgorPro ના ન્યુરોમેટિક v3.0c પ્લગ-ઇનનો ઉપયોગ થાય છે. આપેલ થ્રેશોલ્ડનો ઉપયોગ કરીને APs ને આપમેળે ઓળખો, જે દરેક રેકોર્ડ માટે વ્યક્તિગત રીતે ગોઠવવામાં આવે છે. સ્પાઇક અંતરાલનો ઉપયોગ કરીને, મહત્તમ તાત્કાલિક સ્પાઇક આવર્તન અને સરેરાશ સ્પાઇક આવર્તન સાથે સ્પાઇક આવર્તન નક્કી કરો.
PN આઇસોલેશન. અગાઉ પ્રકાશિત પ્રોટોકોલને અનુરૂપ, PN ને ચોક્કસ તબક્કે માઉસ સેરેબેલમમાંથી શુદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા (58). ટૂંકમાં, સેરેબેલમને બરફ-ઠંડા ડિસોસિએશન માધ્યમમાં [HBSS Ca2+ અને Mg2+ વિના, 20 mM ગ્લુકોઝ, પેનિસિલિન (50 U/ml) અને સ્ટ્રેપ્ટોમાસીન (0.05 mg/ml) સાથે પૂરક] કાપીને ઝીણું કરવામાં આવ્યું હતું, અને પછી માધ્યમને પેપેઇન [HBSS, 1-સિસ્ટીન·HCl (1 mg/ml), પેપેઇન (16 U/ml) અને ડીઓક્સીરીબોન્યુક્લીઝ I (DNase I; 0.1 mg/ml) સાથે પૂરક] માં પચાવીને 30°C પર 30 મિનિટ માટે સારવાર કરો. સૌપ્રથમ ઇંડાના મ્યુકસ (૧૦ મિલિગ્રામ/મિલી), બીએસએ (૧૦ મિલિગ્રામ/મિલી) અને ડીનેઝ (૦.૧ મિલિગ્રામ/મિલી) ધરાવતા HBSS માધ્યમમાં ઓરડાના તાપમાને પેશીઓને ધોઈ લો જેથી એન્ઝાઇમેટિક પાચન અટકાવી શકાય, અને પછી ૨૦ મિલિગ્રામ ગ્લુકોઝ ધરાવતા HBSS માધ્યમમાં HBSS માં હળવેથી પીસીને, પેનિસિલિન (૫૦ યુ/મિલી), સ્ટ્રેપ્ટોમાસીન (૦.૦૫ મિલિગ્રામ/મિલી) અને ડીનેઝ (૦.૧ મિલિગ્રામ/મિલી) એકલ કોષો મુક્ત કરે છે. પરિણામી કોષ સસ્પેન્શનને ૭૦μm સેલ સ્ટ્રેનર દ્વારા ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યું હતું, પછી કોષોને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન (૧૧૧૦ આરપીએમ, ૫ મિનિટ, ૪° સે) દ્વારા પેલેટ કરવામાં આવ્યા હતા અને સોર્ટિંગ માધ્યમમાં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા [HBSS, ૨૦ મિલિગ્રામ ગ્લુકોઝ, ૨૦% ગર્ભ બોવાઇન) સીરમ, પેનિસિલિન (૫૦ યુ/મિલી) અને સ્ટ્રેપ્ટોમાસીન (૦.૦૫ મિલિગ્રામ/મિલી)]; પ્રોપિડિયમ આયોડાઇડ સાથે કોષની સધ્ધરતાનું મૂલ્યાંકન કરો અને કોષની ઘનતાને ૧×૧૦૬ થી ૨×૧૦૬ કોષો/મિલી સુધી ગોઠવો. ફ્લો સાયટોમેટ્રી પહેલાં, સસ્પેન્શનને 50 μm સેલ સ્ટ્રેનર દ્વારા ફિલ્ટર કરવામાં આવતું હતું.
ફ્લો સાયટોમીટર. FACSAria III મશીન (BD બાયોસાયન્સિસ) અને FACSDiva સોફ્ટવેર (BD બાયોસાયન્સિસ, સંસ્કરણ 8.0.1) નો ઉપયોગ કરીને 4°C પર કોષ સૉર્ટિંગ કરવામાં આવ્યું હતું. સેલ સસ્પેન્શનને 100 μm નોઝલનો ઉપયોગ કરીને 20 psi ના દબાણ હેઠળ ~2800 ઇવેન્ટ્સ/સેકન્ડના દરે સૉર્ટ કરવામાં આવ્યું હતું. પરંપરાગત ગેટિંગ માપદંડ (કોષનું કદ, બાયમોડલ ભેદભાવ અને સ્કેટરિંગ લાક્ષણિકતાઓ) અન્ય કોષ પ્રકારોથી PN ના યોગ્ય અલગતાને સુનિશ્ચિત કરી શકતા નથી, તેથી ગેટિંગ વ્યૂહરચના mitoYFP+ ​​અને નિયંત્રણ mitoYFP - ઉંદરમાં YFP તીવ્રતા અને ઓટોફ્લોરોસેન્સની સીધી સરખામણીના આધારે સેટ કરવામાં આવે છે. YFP 488 nm લેસર લાઇન સાથે નમૂનાને ઇરેડિયેટ કરીને ઉત્તેજિત થાય છે, અને 530/30 nm બેન્ડ પાસ ફિલ્ટરનો ઉપયોગ કરીને સિગ્નલ શોધી કાઢવામાં આવે છે. mitoYFP+ ​​ઉંદરમાં, Rosa26-mitoYFP રિપોર્ટર જનીનની સંબંધિત શક્તિનો ઉપયોગ ન્યુરોનલ બોડી અને ચેતાક્ષ ટુકડાઓને અલગ કરવા માટે પણ થાય છે. 7-AAD ને 561 nm પીળા લેસરથી ઉત્તેજિત કરવામાં આવે છે અને મૃત કોષોને બાકાત રાખવા માટે 675/20 nm બેન્ડપાસ ફિલ્ટરથી શોધી કાઢવામાં આવે છે. તે જ સમયે એસ્ટ્રોસાઇટ્સને અલગ કરવા માટે, સેલ સસ્પેન્શનને ACSA-2-APC થી રંગવામાં આવ્યું હતું, પછી નમૂનાને 640 nm લેસર લાઇનથી ઇરેડિયેટ કરવામાં આવ્યું હતું, અને સિગ્નલ શોધવા માટે 660/20 nm બેન્ડપાસ ફિલ્ટરનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.
એકત્રિત કોષોને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન (૧૧૧૦ આરપીએમ, ૫ મિનિટ, ૪° સે) દ્વારા પેલેટ કરવામાં આવ્યા હતા અને ઉપયોગ થાય ત્યાં સુધી -૮૦° સેલ્સિયસ પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા. પ્રક્રિયાગત પરિવર્તનશીલતા ઘટાડવા માટે Mfn2cKO ઉંદર અને તેમના કચરાના બચ્ચાંને એક જ દિવસે વર્ગીકૃત કરવામાં આવે છે. FACS ડેટા પ્રેઝન્ટેશન અને વિશ્લેષણ ફ્લોજો સોફ્ટવેર (ફ્લોજો એલએલસી, એશલેન્ડ, ઓરેગોન, યુએસએ) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.
ઉપર જણાવ્યા મુજબ (59), રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆરનો ઉપયોગ અનુગામી mtDNA ક્વોન્ટિફિકેશન માટે સૉર્ટ કરેલા ચેતાકોષોમાંથી ડીએનએને અલગ કરવા માટે થાય છે. શરૂઆતમાં વિવિધ સંખ્યામાં કોષો પર qPCR ચલાવીને રેખીયતા અને થ્રેશોલ્ડ સંવેદનશીલતાનું પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 અને પ્રોટીનેઝ K (200 ng/ml) ધરાવતા લિસિસ બફરમાં 300 PN એકત્રિત કરો અને 55°C 120 મિનિટ પર ઇન્ક્યુબેટ કરો. પ્રોટીનેઝ K ના સંપૂર્ણ નિષ્ક્રિયકરણની ખાતરી કરવા માટે કોષોને 10 મિનિટ માટે 95°C પર વધુ ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા હતા. mt-Nd1 માટે વિશિષ્ટ TaqMan પ્રોબ (થર્મો ફિશર) નો ઉપયોગ કરીને, mtDNA ને 7900HT રીઅલ-ટાઇમ PCR સિસ્ટમ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) માં અર્ધ-માત્રાત્મક PCR દ્વારા માપવામાં આવ્યું હતું. વિજ્ઞાન, કેટલોગ નંબર Mm04225274_s1), mt-Nd6 (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, કેટલોગ નંબર AIVI3E8) અને 18S (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, કેટલોગ નંબર Hs99999901_s1) જનીનો.
પ્રોટીઓમ નમૂનાની તૈયારી. દ્રાવણને 95°C પર 10 મિનિટ માટે ગરમ કરીને અને સોનિકેટ કરીને, લિસિસ બફરમાં [6 M ગ્વાનિડાઇન ક્લોરાઇડ, 10 mM ટ્રિસ(2-કાર્બોક્સિથાઇલ) ફોસ્ફાઇન હાઇડ્રોક્લોરાઇડ, 10 mM ક્લોરોએસેટામાઇડ અને 100 mM ટ્રિસ- HCl માં લાયસ ફ્રોઝન ન્યુરોન પેલેટ્સ]. બાયોરુપ્ટર (ડાયજેનોડ) પર 10 મિનિટ માટે (30 સેકન્ડ પલ્સ / 30 સેકન્ડ પોઝ પીરિયડ). નમૂનાને 20 mM ટ્રિસ-HCl (pH 8.0) માં 1:10 પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું, 300 ng ટ્રિપ્સિન ગોલ્ડ (પ્રોમેગા) સાથે ભેળવવામાં આવ્યું હતું, અને સંપૂર્ણ પાચન પ્રાપ્ત કરવા માટે 37°C પર રાતોરાત ઉકાળવામાં આવ્યું હતું. બીજા દિવસે, નમૂનાને 20,000 ગ્રામ પર 20 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું. સુપરનેટન્ટને 0.1% ફોર્મિક એસિડથી પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું, અને દ્રાવણને સ્વ-નિર્મિત સ્ટેજટિપ્સથી ડિસોલ્ટ કરવામાં આવ્યું હતું. નમૂનાને સ્પીડવેક ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ (એપેન્ડોર્ફ કોન્સન્ટ્રેટર પ્લસ 5305) માં 45°C તાપમાને સૂકવવામાં આવ્યો હતો, અને પછી પેપ્ટાઇડને 0.1% ફોર્મિક એસિડમાં સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યું હતું. બધા નમૂનાઓ એક જ વ્યક્તિ દ્વારા એકસાથે તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા. એસ્ટ્રોસાઇટ નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ કરવા માટે, 4 μg ડિસેલ્ટેડ પેપ્ટાઇડ્સને ટેન્ડમ માસ ટેગ (TMT10plex, કેટલોગ નંબર 90110, થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) સાથે લેબલ કરવામાં આવ્યા હતા જેમાં પેપ્ટાઇડથી TMT રીએજન્ટ ગુણોત્તર 1:20 હતો. TMT લેબલિંગ માટે, 0.8 મિલિગ્રામ TMT રીએજન્ટને 70 μl નિર્જળ ACN માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યું હતું, અને સૂકા પેપ્ટાઇડને 0.1 M TEAB (ટ્રાઇથિલેમોનિયમ બાયકાર્બોનેટ) ના 9 μl માં ફરીથી ગોઠવવામાં આવ્યું હતું, જેમાં ACN માં 7 μl TMT રીએજન્ટ ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. સાંદ્રતા 43.75% હતી. 60 મિનિટના ઇન્ક્યુબેશન પછી, પ્રતિક્રિયા 5% હાઇડ્રોક્સિલામાઇનના 2 μl સાથે શાંત કરવામાં આવી હતી. લેબલવાળા પેપ્ટાઇડ્સને 0.1% ફોર્મિક એસિડ (FA) ના 200μl માં એકત્રિત કરવામાં આવ્યા, સૂકવવામાં આવ્યા, ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા, બે ભાગમાં વિભાજીત કરવામાં આવ્યા, અને પછી સ્વ-નિર્મિત સ્ટેજટિપ્સનો ઉપયોગ કરીને ડિસોલ્ટ કરવામાં આવ્યા. અલ્ટીમેટ 3000 અલ્ટ્રા હાઇ પર્ફોર્મન્સ લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફ (અલ્ટીમેટ 3000 અલ્ટ્રા હાઇ પર્ફોર્મન્સ લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફ) નો ઉપયોગ કરીને, બે ભાગોમાંથી એકને 130Å1.7μm C18 કણોથી ભરેલા 1mm x 150mm એક્વિટી ક્રોમેટોગ્રાફિક કોલમ પર ફ્રેક્શન કરવામાં આવ્યો (વોટર્સ, કેટલોગ નં. SKU: 186006935). થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક). 30μl/મિનિટના પ્રવાહ દરે પેપ્ટાઇડ્સને અલગ કરો, 1% થી 50% બફર B થી 85 મિનિટ માટે 96 મિનિટના સ્ટેપવાઇઝ ગ્રેડિયન્ટ સાથે અલગ કરો, 50% થી 95% બફર B થી 3 મિનિટ માટે, પછી 95% બફર B માટે 8 મિનિટ; બફર A 5% ACN અને 10 mM એમોનિયમ બાયકાર્બોનેટ (ABC) છે, અને બફર B 80% ACN અને 10 mM ABC છે. દર 3 મિનિટે અપૂર્ણાંક એકત્રિત કરો અને તેમને બે જૂથોમાં (1 + 17, 2 + 18, વગેરે) જોડો અને તેમને વેક્યુમ સેન્ટ્રીફ્યુજમાં સૂકવો.
LC-MS/MS વિશ્લેષણ. માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી માટે, પેપ્ટાઇડ્સ (નંબર r119.aq) ને 25 સેમી, 75 μm આંતરિક વ્યાસવાળા PicoFrit વિશ્લેષણાત્મક સ્તંભ (નવો ઉદ્દેશ્ય લેન્સ, ભાગ નંબર PF7508250) પર અલગ કરવામાં આવ્યા હતા જે 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ માધ્યમ (ડૉ. મૈશ, મેટ), Use EASY-nLC 1200 (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, જર્મની) થી સજ્જ હતા. સ્તંભને 50°C પર જાળવવામાં આવ્યો હતો. બફર્સ A અને B અનુક્રમે પાણીમાં 0.1% ફોર્મિક એસિડ અને 80% ACN માં 0.1% ફોર્મિક એસિડ છે. પેપ્ટાઇડ્સને 65 મિનિટ માટે 6% થી 31% બફર B થી 65 મિનિટ માટે અને 31% થી 50% બફર B થી 5 મિનિટ માટે 200 nl/મિનિટના ગ્રેડિયન્ટ સાથે અલગ કરવામાં આવ્યા હતા. ઓર્બિટ્રેપ ફ્યુઝન માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) પર એલ્યુટેડ પેપ્ટાઇડ્સનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. પેપ્ટાઇડ પ્રિકર્સર m/z માપન 350 થી 1500 m/z ની રેન્જમાં 120,000 ના રિઝોલ્યુશન સાથે કરવામાં આવે છે. 27% નોર્મલાઇઝ્ડ કોલિઝન એનર્જીનો ઉપયોગ કરીને, 2 થી 6 ની ચાર્જ સ્ટેટ સાથે સૌથી મજબૂત પ્રિકર્સર હાઇ એનર્જી C ટ્રેપ ડિસોસિએશન (HCD) ક્લીવેજ માટે પસંદ કરવામાં આવે છે. ચક્ર સમય 1 સેકન્ડ પર સેટ છે. પેપ્ટાઇડ ફ્રેગમેન્ટનું m/z મૂલ્ય 5×104 ના સૌથી નાના AGC લક્ષ્ય અને 86 ms ના મહત્તમ ઇન્જેક્શન સમયનો ઉપયોગ કરીને આયન ટ્રેપમાં માપવામાં આવ્યું હતું. ફ્રેગમેન્ટેશન પછી, પ્રિકર્સરને 45 સેકન્ડ માટે ગતિશીલ બાકાત યાદીમાં મૂકવામાં આવ્યું હતું. TMT-લેબલવાળા પેપ્ટાઇડ્સને 50 સે.મી., 75 μm એક્લેમ પેપમેપ કોલમ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, કેટલોગ નંબર 164942) પર અલગ કરવામાં આવ્યા હતા, અને હાઇ-ફિલ્ડ એસિમેટ્રિક વેવફોર્મ આયનો (FAIMS) સાધનો (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) થી સજ્જ ઓર્બિટ્રેપ લુમોસ ટ્રિબ્રિડ માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) પર માઇગ્રેશન સ્પેક્ટ્રાનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. તે −50 અને −70 V ના બે વળતર વોલ્ટેજ પર કાર્ય કરે છે. સિંક્રનાઇઝેશન પ્રિકર્સરના આધારે પસંદ કરાયેલ MS3 TMT રિપોર્ટ આયન સિગ્નલ માપન માટે વપરાય છે. પેપ્ટાઇડ અલગીકરણ EASY-nLC 1200 પર હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું, જેમાં 90% રેખીય ગ્રેડિયન્ટ એલ્યુશનનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, જેમાં 6% થી 31% બફર સાંદ્રતા હતી; બફર A 0.1% FA હતું, અને બફર B 0.1% FA અને 80% ACN હતું. વિશ્લેષણાત્મક કોલમ 50°C પર સંચાલિત થાય છે. FAIMS વળતર વોલ્ટેજ અનુસાર મૂળ ફાઇલને વિભાજીત કરવા માટે ફ્રીસ્ટાઇલ (સંસ્કરણ 1.6, થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) નો ઉપયોગ કરો.
પ્રોટીન ઓળખ અને જથ્થાત્મકતા. સંકલિત એન્ડ્રોમેડા સર્ચ એન્જિનનો ઉપયોગ કરીને, મૂળ ડેટાનું વિશ્લેષણ MaxQuant સંસ્કરણ 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. Aequorea victoria માંથી મેળવેલા Cre recombinase અને YFP સિક્વન્સ ઉપરાંત, માઉસ સંદર્ભ પ્રોટીઓમ (પ્રોટીઓમ ID UP000000589, મે 2017 માં UniProt પરથી ડાઉનલોડ કરેલ) ના કેનોનિકલ સિક્વન્સ અને આઇસોફોર્મ સિક્વન્સ માટે પેપ્ટાઇડ ફ્રેગમેન્ટ સ્પેક્ટ્રા શોધવામાં આવ્યો હતો. મેથિઓનાઇન ઓક્સિડેશન અને પ્રોટીન N-ટર્મિનલ એસિટિલેશનને ચલ ફેરફારો તરીકે સેટ કરવામાં આવ્યા હતા; સિસ્ટીન કાર્બામોઇલ મેથિલેશનને નિશ્ચિત ફેરફારો તરીકે સેટ કરવામાં આવ્યું હતું. પાચન પરિમાણો "વિશિષ્ટતા" અને "ટ્રિપ્સિન/P" પર સેટ કરવામાં આવ્યા છે. પ્રોટીન ઓળખ માટે ઉપયોગમાં લેવાતા પેપ્ટાઇડ્સ અને રેઝર પેપ્ટાઇડ્સની ન્યૂનતમ સંખ્યા 1 છે; અનન્ય પેપ્ટાઇડ્સની ન્યૂનતમ સંખ્યા 0 છે. પેપ્ટાઇડ નકશા મેચિંગની શરતો હેઠળ, પ્રોટીન ઓળખ દર 0.01 હતો. "બીજો પેપ્ટાઇડ" વિકલ્પ સક્ષમ છે. વિવિધ મૂળ ફાઇલો વચ્ચે સફળ ઓળખાણ સ્થાનાંતરિત કરવા માટે "મેચ વચ્ચે રન" વિકલ્પનો ઉપયોગ કરો. લેબલ-ફ્રી ક્વોન્ટિફિકેશન (LFQ) (60) માટે LFQ ન્યૂનતમ ગુણોત્તર ગણતરી 1 નો ઉપયોગ કરો. દરેક સમય બિંદુ પર ઓછામાં ઓછા એક જીનોટાઇપ જૂથમાં ઓછામાં ઓછા બે માન્ય મૂલ્યો માટે LFQ તીવ્રતા ફિલ્ટર કરવામાં આવે છે, અને 0.3 ની પહોળાઈ સાથે સામાન્ય વિતરણમાંથી એક્સ્ટ્રાપોલેટ કરવામાં આવે છે અને 1.8 નીચે ખસેડાય છે. LFQ પરિણામોનું વિશ્લેષણ કરવા માટે પર્સિયસ કમ્પ્યુટિંગ પ્લેટફોર્મ (https://maxquant.net/perseus/) અને R (https://r-project.org/) નો ઉપયોગ કરો. વિભેદક અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ (61) માટે લિમ્મા સોફ્ટવેર પેકેજમાંથી બે-માર્ગી મધ્યમ t પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally અને phetmap નો ઉપયોગ કરીને શોધખોળ ડેટા વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે. TMT-આધારિત પ્રોટીઓમિક્સ ડેટાનું વિશ્લેષણ MaxQuant સંસ્કરણ 1.6.10.43 નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. સપ્ટેમ્બર 2018 માં ડાઉનલોડ કરાયેલ યુનિપ્રોટના માનવ પ્રોટીઓમિક્સ ડેટાબેઝમાંથી કાચો પ્રોટીઓમિક્સ ડેટા શોધો. વિશ્લેષણમાં ઉત્પાદક દ્વારા પ્રદાન કરાયેલ આઇસોટોપ શુદ્ધતા સુધારણા પરિબળ શામેલ છે. વિભેદક અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ માટે R માં લિમ્માનો ઉપયોગ કરો. મૂળ ડેટા, ડેટાબેઝ શોધ પરિણામો અને ડેટા વિશ્લેષણ વર્કફ્લો અને પરિણામો બધા ડેટા સેટ ઓળખકર્તા PXD019690 સાથે PRIDE ભાગીદાર ભંડાર દ્વારા પ્રોટીઓમએક્સચેન્જ જોડાણમાં સંગ્રહિત થાય છે.
કાર્યાત્મક ટીકાઓ વિશ્લેષણને સમૃદ્ધ બનાવે છે. 8 અઠવાડિયા (આકૃતિ 1) પર ડેટા સેટના કાર્યાત્મક ટીકા શબ્દોની સમૃદ્ધિ નક્કી કરવા માટે ઇન્જેન્યુટી પાથવે વિશ્લેષણ (QIAGEN) ટૂલનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. ટૂંકમાં, LC-MS/MS (ટેન્ડમ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી) ડેટા વિશ્લેષણમાંથી મેળવેલ જથ્થાત્મક પ્રોટીન સૂચિનો ઉપયોગ નીચેના ફિલ્ટર માપદંડો સાથે કરવામાં આવે છે: મસ મસ્ક્યુલસને પ્રજાતિ અને પૃષ્ઠભૂમિ તરીકે પસંદ કરવામાં આવે છે, અને શ્રેણી દર્શાવે છે કે બેન્જામિનીએ 0.05 અથવા તેનાથી ઓછા સંવર્ધન માટે સમાયોજિત P મૂલ્યને નોંધપાત્ર ગણવામાં આવે છે. આ ગ્રાફ માટે, સમાયોજિત P મૂલ્યના આધારે દરેક ક્લસ્ટરમાં ટોચની પાંચ વધારાની શ્રેણીઓ બતાવવામાં આવી છે. બહુવિધ ટી-ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને, બેન્જામિન, ક્રિગર અને યેકુટીએલીના બે-તબક્કાના રેખીય બુસ્ટ પ્રોગ્રામ (Q = 5%) નો ઉપયોગ કરીને, દરેક શ્રેણીમાં ઓળખાતા મહત્વપૂર્ણ ઉમેદવારો પર સમય-કોર્સ પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે, અને દરેક પંક્તિનું અલગથી વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે. સુસંગત SD અપનાવવાની કોઈ જરૂર નથી.
આ અભ્યાસના પરિણામોની તુલના પ્રકાશિત ડેટાબેઝ સાથે કરવા અને આકૃતિ 1 માં વેન ડાયાગ્રામ જનરેટ કરવા માટે, અમે માત્રાત્મક પ્રોટીન સૂચિને MitoCarta 2.0 એનોટેશન (24) સાથે જોડી. આકૃતિ જનરેટ કરવા માટે ઓનલાઈન ટૂલ ડ્રો વેન ડાયાગ્રામ (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) નો ઉપયોગ કરો.
પ્રોટીઓમિક્સ વિશ્લેષણ માટે ઉપયોગમાં લેવાતી આંકડાકીય પ્રક્રિયાઓ વિશે વિગતવાર માહિતી માટે, કૃપા કરીને સામગ્રી અને પદ્ધતિઓના સંબંધિત વિભાગનો સંદર્ભ લો. અન્ય તમામ પ્રયોગો માટે, વિગતવાર માહિતી સંબંધિત દંતકથામાં મળી શકે છે. જ્યાં સુધી અન્યથા ઉલ્લેખિત ન હોય, બધા ડેટા સરેરાશ ± SEM તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવે છે, અને બધા આંકડાકીય વિશ્લેષણ ગ્રાફપેડ પ્રિઝમ 8.1.2 સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યા હતા.
આ લેખ માટે પૂરક સામગ્રી માટે, કૃપા કરીને http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 જુઓ.
આ એક ઓપન એક્સેસ લેખ છે જે ક્રિએટિવ કોમન્સ એટ્રિબ્યુશન-નોન-કોમર્શિયલ લાઇસન્સની શરતો હેઠળ વિતરિત કરવામાં આવે છે, જે કોઈપણ માધ્યમમાં ઉપયોગ, વિતરણ અને પુનઃઉત્પાદનની મંજૂરી આપે છે, જ્યાં સુધી અંતિમ ઉપયોગ વ્યાપારી લાભ માટે ન હોય અને આધાર એ હોય કે મૂળ કાર્ય સાચું છે. સંદર્ભ.
નોંધ: અમે તમને ફક્ત તમારું ઇમેઇલ સરનામું આપવાનું કહીએ છીએ જેથી તમે જે વ્યક્તિને પેજ પર ભલામણ કરો છો તે જાણે કે તમે ઇચ્છો છો કે તે ઇમેઇલ જુએ અને તે સ્પામ ન હોય. અમે કોઈપણ ઇમેઇલ સરનામાં કેપ્ચર કરીશું નહીં.
આ પ્રશ્નનો ઉપયોગ તમે મુલાકાતી છો કે નહીં તે ચકાસવા અને આપમેળે સ્પામ સબમિશન અટકાવવા માટે થાય છે.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. દ્વારા લાર્સન
નિષ્ક્રિય ચેતાકોષોના પ્રોટીઓમિક્સ વિશ્લેષણથી જાણવા મળ્યું કે મેટાબોલિક પ્રોગ્રામ્સ ન્યુરોડિજનરેશનનો સામનો કરવા માટે સક્રિય થાય છે.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. દ્વારા લાર્સન
નિષ્ક્રિય ચેતાકોષોના પ્રોટીઓમિક્સ વિશ્લેષણથી જાણવા મળ્યું કે મેટાબોલિક પ્રોગ્રામ્સ ન્યુરોડિજનરેશનનો સામનો કરવા માટે સક્રિય થાય છે.
©2020 અમેરિકન એસોસિયેશન ફોર ધ એડવાન્સમેન્ટ ઓફ સાયન્સ. તમામ અધિકારો સુરક્ષિત છે. AAAS એ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef અને COUNTER ના ભાગીદાર છે. સાયન્સ એડવાન્સ ISSN 2375-2548.