હાલ†હાલનું સરનામું: OX11 0DE, UK, ડાયમંડ બિલ્ડીંગ, હાર્વેલ સાયન્સ એન્ડ ઇનોવેશન પાર્ક, ડાયટકોટ, ઓક્સફોર્ડશાયર, UK, ડાયમંડ લાઇટ સોર્સ કંપની લિમિટેડ, ઇલેક્ટ્રોનિક બાયોલોજિકલ ઇમેજિંગ સેન્ટર.
પ્રતિક્રિયા કેન્દ્ર પ્રકાશ-હાર્વેસ્ટિંગ કોમ્પ્લેક્સ 1 (RC-LH1) એ જાંબલી ફોટોટ્રોફિક બેક્ટેરિયાનો મુખ્ય પ્રકાશસંશ્લેષણ ઘટક છે. અમે રોડોપસ્યુડોમોનાસ પેલુસ્ટ્રિસમાંથી RC-LH1 કોમ્પ્લેક્સના બે ક્રાયો-ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી સ્ટ્રક્ચર્સ રજૂ કર્યા. RC-LH114-W કોમ્પ્લેક્સના 2.65-Å રિઝોલ્યુશન સ્ટ્રક્ચરમાં RC ની આસપાસ 14 સબ્યુનિટ LH1 લૂપ્સ હોય છે, જે પ્રોટીન W દ્વારા વિક્ષેપિત થાય છે, જ્યારે પ્રોટીન-W વગરનું કોમ્પ્લેક્સ સંપૂર્ણપણે RC થી ઘેરાયેલું RC કમ્પોઝિશન છે. બંધ 16 સબ્યુનિટ LH1 લૂપ. આ સ્ટ્રક્ચર્સની સરખામણી RC-LH1 કોમ્પ્લેક્સમાં ક્વિનોનની ગતિશીલતામાં આંતરદૃષ્ટિ પ્રદાન કરે છે, જેમાં RC QB સાઇટ પર ક્વિનોનને બાંધતી વખતે અગાઉ અનિશ્ચિત કન્ફોર્મેશનલ ફેરફારોનો સમાવેશ થાય છે, તેમજ સહાયક ક્વિનોન બંધનકર્તા સાઇટ્સનું સ્થાન, જે તેમને RC માં પસાર કરવામાં મદદ કરે છે. W પ્રોટીનની અનન્ય રચના LH1 લૂપને બંધ થવાથી અટકાવે છે, જેનાથી ક્વિનોન/ક્વિનોલોન વિનિમયને વેગ આપવા માટે એક ચેનલ બને છે.
પ્રકાશસંશ્લેષણ દ્વારા પૂરી પાડવામાં આવતી ઉર્જા પૃથ્વી પરના લગભગ બધા જીવનને ટકાવી શકે છે, અને તેમાં સૌર બાયોટેકનોલોજી માટે મોટી સંભાવના છે. વૈશ્વિક પ્રકાશસંશ્લેષણને પ્રોત્સાહન આપતી વખતે, જાંબલી ફોટોટ્રોફિક બેક્ટેરિયા વિવિધ ઉર્જા સ્થિતિઓ અને ચયાપચય ક્ષમતાઓ પણ પ્રદર્શિત કરે છે. તેઓ પ્રકાશસંશ્લેષણને ટાળી શકે છે અને અંધારામાં હેટરોટ્રોફિક બેક્ટેરિયા તરીકે વિકાસ કરી શકે છે, નાઇટ્રોજન અને કાર્બન ડાયોક્સાઇડને ઠીક કરી શકે છે, હાઇડ્રોજન ઉત્પન્ન કરી શકે છે અને સુગંધિત સંયોજનોને ઘટાડી શકે છે (1-3). આ પ્રક્રિયાઓ માટે ઉર્જા પૂરી પાડવા માટે, પ્રકાશને ઝડપથી અને કાર્યક્ષમ રીતે રાસાયણિક ઉર્જામાં રૂપાંતરિત કરવું આવશ્યક છે. આ પ્રક્રિયા ત્યારે શરૂ થાય છે જ્યારે પ્રકાશ-ટ્રેપિંગ એન્ટેના સંકુલ પ્રકાશને શોષી લે છે અને ફસાયેલી ઉર્જાને પ્રતિક્રિયા કેન્દ્ર (RC) માં સ્થાનાંતરિત કરે છે, જેનાથી ચાર્જ અલગ થવાનું શરૂ થાય છે (4 - 7). જાંબલી ફોટોટ્રોફિક બેક્ટેરિયામાં પ્રકાશસંશ્લેષણનું મૂળભૂત એકમ પ્રકાર 2 RC થી બનેલું છે, જે પ્રકાશ-હાર્વેસ્ટિંગ સંકુલ 1 (LH1) થી ઘેરાયેલું છે, જે RC-LH1 કોર સંકુલ બનાવે છે. LH1 વક્ર αβ હેટરોડાઇમર્સની શ્રેણી દ્વારા રચાય છે, જેમાંથી દરેક બે બેક્ટેરિયલ ક્લોરોફિલ (BChl) અણુઓ અને એક કે બે કેરોટીનોઇડ્સ (8-12) ને જોડે છે. સૌથી સરળ LH1 એન્ટેનામાં 16 અથવા 17 αβ હેટરોડાયમર્સ હોય છે જે RC (9-13) ને બંધ લૂપમાં ઘેરી લે છે, પરંતુ અન્ય મુખ્ય સંકુલમાં, ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન પેપ્ટાઇડ્સ આસપાસના LH1 ની સાતત્યમાં વિક્ષેપ પાડે છે, જેનાથી RC અને સાયટોક્રોમ bc1 સંકુલ (11, 13-15) વચ્ચે ક્વિનોલ/ક્વિનોન પ્રસરણને પ્રોત્સાહન મળે છે. જાંબલી ફોટોટ્રોફિક પ્લાન્ટ રોડોપસ્યુડોમોનાસ (Rps.) એક મોડેલ સજીવ છે જે પ્રકાશસંશ્લેષણને ટેકો આપતી ઊર્જા અને ઇલેક્ટ્રોન ટ્રાન્સફરને સમજી શકે છે. Rps નું પ્રથમ સ્ફટિક માળખું. પેલુસ્ટ્રિસ RC-LH1 સંકુલનું મોડેલ RC છે, જે 15 હેટરોડાયમેરિક LH1 લૂપ્સથી ઘેરાયેલું છે, જે "પ્રોટીન W" (14) નામના અજાણ્યા પ્રોટીન દ્વારા વિક્ષેપિત થાય છે. પ્રોટીન-W ને ત્યારબાદ RPA4402 તરીકે ઓળખવામાં આવ્યું, જે ત્રણ અનુમાનિત ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન હેલિક્સ (TMH) (16) સાથેનું એક અપ્રાકૃતિક 10.5kDa પ્રોટીન છે. અમે RPA4402 જનીન એન્કોડિંગ પ્રોટીન W નું નામ બદલીને pufW કરવાનો પ્રસ્તાવ મૂકીએ છીએ જેથી તે RC-L, M (pufL, pufM) અને LH1α, β (pufA, pufB) સબયુનિટ્સને એન્કોડ કરતા જનીનો માટે ઉપયોગમાં લેવાતા નામકરણ સાથે સુસંગત રહે. રસપ્રદ વાત એ છે કે, પ્રોટીન-W ફક્ત RC-LH1 ના લગભગ 10% માં હાજર છે, જે દર્શાવે છે કે Rps. પેલુસ્ટ્રીસ બે અલગ અલગ RC-LH1 સંકુલ ઉત્પન્ન કરે છે. અહીં, અમે બે કોર સંકુલના ઉચ્ચ-રિઝોલ્યુશન ક્રાયો-EM (ક્રાયો-EM) માળખાંની જાણ કરીએ છીએ, એક પ્રોટીન W અને 14 αβ હેટરોડાઇમર સાથે, બીજો પ્રોટીન W વગર અને બંધ 16 હેટરોડાઇમર LH1 લૂપ સાથે. અમારી રચના Rps. પેલુસ્ટ્રીસના RC-LH1 સંકુલની સમજમાં એક પગલું પરિવર્તન રજૂ કરે છે, કારણ કે અમે દરેક પ્રકારનું સજાતીય વસ્તીનું વિશ્લેષણ કર્યું છે અને દરેક પેપ્ટાઇડ અને બંધ રંગદ્રવ્યો અને સંબંધિત લિપિડ્સ અને ક્વિનોન્સને સ્પષ્ટ રીતે સોંપવા માટે પૂરતું રિઝોલ્યુશન છે. આ રચનાઓની સરખામણી દર્શાવે છે કે ત્રણ TMH પ્રોટીન-W જે અત્યાર સુધી અન્ય કોઈપણ RC-LH1 સંકુલમાં જોવા મળ્યા નથી, તે ક્વિનોન/ક્વિનોલોન વિનિમયને વેગ આપવા માટે ક્વિનોન ચેનલ ઉત્પન્ન કરે છે. સંખ્યાબંધ સંરક્ષિત લિપિડ અને ક્વિનોન બંધનકર્તા સ્થળો ઓળખવામાં આવ્યા છે, અને અમે ક્વિનોન અને RC ના સંયોજન પછી એક નવો રચનાત્મક ફેરફાર જાહેર કર્યો છે, જે ઓક્સિજનયુક્ત ફોટોટ્રોફિક સજીવોના ફોટોસિસ્ટમ II (PSII) RC માટે યોગ્ય હોઈ શકે છે. અમારા તારણો જાંબલી ફોટોટ્રોફિક બેક્ટેરિયાના RC-LH1 કોર સંકુલમાં ક્વિનોન/ક્વિનોલોન બંધન અને વિનિમયના ગતિશાસ્ત્રમાં નવી આંતરદૃષ્ટિ પ્રદાન કરે છે.
Rps. palustris માં જોવા મળતા બે સંકુલનો વિગતવાર અભ્યાસ કરવા માટે, અમે બાયોકેમિકલ પદ્ધતિઓ દ્વારા દરેક RC-LH1 ને અલગ કરીએ છીએ. પ્રોટીન W-ઉણપ સંકુલ (ત્યારબાદ ΔpufW તરીકે ઓળખવામાં આવે છે) ને pufW જનીન (16) ના અભાવવાળા સ્ટ્રેનથી શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું, અને ફક્ત એક RC-LH1 સંકુલ ઉત્પન્ન કરી શકાય છે. પ્રોટીન W-સમાવતી સંકુલ એક સ્ટ્રેન દ્વારા ઉત્પન્ન થાય છે. આ સ્ટ્રેનના પ્રોટીન W ને તેના C-ટર્મિનસ પર 10x His ટેગ સાથે સંશોધિત કરવામાં આવે છે, જેથી પ્રોટીન W-સમાવતી સંકુલને ધાતુને સ્થિર કરીને મોટાભાગના અભાવવાળા પ્રોટીન W સાથે અસરકારક રીતે જોડી શકાય. આ સંકુલને અસરકારક રીતે અલગ કરવામાં આવે છે (16) એફિનિટી ક્રોમેટોગ્રાફી (IMAC).
આકૃતિ 1 માં બતાવ્યા પ્રમાણે, બંને સંકુલમાં ત્રણ સબ-યુનિટ RC (RC-L, RC-M અને RC-H) છે જે LH1 એન્ટેનાથી ઘેરાયેલા છે. પ્રોટીન-W ના અભાવવાળા સંકુલનું 2.80-A માળખું 16 αβ હેટરોડાઇમર દર્શાવે છે, જે RC ને સંપૂર્ણપણે ઘેરી લેતું બંધ LH1 લૂપ બનાવે છે, જેને હવે પછી RC-LH116 સંકુલ તરીકે ઓળખવામાં આવશે. પ્રોટીન-W ધરાવતા સંકુલના 2.65Å માળખામાં પ્રોટીન-W દ્વારા વિક્ષેપિત 14-હેટરોડાઇમર LH1 છે, જેને હવે પછી RC-LH114-W તરીકે ઓળખવામાં આવશે.
(A અને B) સંયોજનનું સપાટી પ્રતિનિધિત્વ. (C અને D) સળિયામાં વ્યક્ત કરાયેલા બંધાયેલા રંગદ્રવ્યો. (E અને F) સાયટોપ્લાઝમિક સપાટી પરથી અવલોકન કરાયેલા સંકુલમાં કાર્ટૂનમાં દર્શાવવામાં આવેલા પેપ્ટાઇડ્સ અને LH1 સબયુનિટ્સ હોય છે, અને પ્રોટીન-W ગેપ [Rba નંબરિંગ સાથે સુસંગત. સ્ફેરોઇડ્સ કોમ્પ્લેક્સ (13)] થી ઘડિયાળની દિશામાં ક્રમાંકિત હોય છે. LH1-α માટે, પ્રોટીન સબયુનિટનો રંગ પીળો છે; LH1-β માટે, પ્રોટીન સબયુનિટનો રંગ વાદળી છે; પ્રોટીન-W માટે, પ્રોટીન લાલ છે; RC-H માટે, તે વાદળી છે; RC-L માટે, તે નારંગી છે; RC-M માટે, મેજેન્ટા. સહ-પરિબળોને સળિયા દ્વારા દર્શાવવામાં આવે છે, લીલો BChl અને BPh a અણુઓનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, જાંબલી કેરોટીનોઇડ્સનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, અને પીળો UQ10 અણુઓનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. (G અને H) RC-LH114-W સંકુલ (G) અને RC-LH116 સંકુલ (H) ના સમકક્ષ ક્ષેત્રમાં પ્રોટીન-W ગેપનું વિસ્તૃત દૃશ્ય. કોફેક્ટર્સ સ્પેસ ફિલિંગના સ્વરૂપમાં પ્રદર્શિત થાય છે, ચેલેટેડ ક્વિનોન વાદળી રંગમાં પ્રદર્શિત થાય છે. પ્રોટીન-W ગેપ (G) માં વાદળી ડેશવાળી રેખા દ્વારા પ્રકાશિત થાય છે, અને નાના છિદ્રો જ્યાં ક્વિનોન/ક્વિનોલોલ LH116 રિંગ પર ફેલાય છે તે (H) માં કાળા ડેશવાળી રેખા દ્વારા પ્રકાશિત થાય છે.
આકૃતિ 1 (A અને B) LH1αβ હેટરોડાઇમર્સના ખુલ્લા અથવા બંધ એરેથી ઘેરાયેલ RC દર્શાવે છે, જેમાંથી દરેક બે BChl અને એક કેરોટીનોઇડને જોડે છે (આકૃતિ 1, C અને D). અગાઉના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે Rps એ LH1 સંકુલ છે. સ્પિરુલિના ઝેન્થિનના જૈવસંશ્લેષણ માર્ગમાં, આ પ્રજાતિઓમાં કેરોટીનોઇડ્સની મિશ્ર વસ્તી હોય છે (17). જો કે, સ્પિરોપીરોક્સાન્થિન પ્રબળ કેરોટીનોઇડ છે અને તેની ઘનતા સંતોષકારક છે. તેથી, અમે બધા LH1 બંધનકર્તા સ્થળો પર સ્પિરોક્સાન્થિનનું મોડેલ બનાવવાનું પસંદ કર્યું. આલ્ફા અને બીટા પોલીપેપ્ટાઇડ્સ ટૂંકા પટલ બાહ્ય પ્રદેશો સાથે એકલ TMH છે (આકૃતિ 1, A, B, E, અને F). જોકે C-ટર્મિનસ પર 17 અવશેષોની ઘનતા જોવા મળી ન હતી, આલ્ફા પોલીપેપ્ટાઇડ બંને સંકુલમાં Met1 થી Ala46 સુધી વિભાજીત થઈ ગયું હતું. RC-LH116 માં Gly4 થી Tyr52 અને RC-LH114-W માં Ser5 થી Tyr52 માં β પોલીપેપ્ટાઇડ ઘટાડવામાં આવ્યું હતું. 3 અથવા 4 N-ટર્મિનલ અથવા 13 C-ટર્મિનલ અવશેષોની ઘનતા જોવા મળી ન હતી (આકૃતિ S1). જંગલી પ્રકારના સ્ટ્રેનમાંથી તૈયાર કરાયેલ મિશ્ર RC-LH1 સંકુલના માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે ગુમ થયેલ પ્રદેશ આ પેપ્ટાઇડ્સના હેટરોલોગસ ક્લીવેજનું પરિણામ હતું (આકૃતિ S1 અને S2). α-Met1 નું N-ટર્મિનલ ફોર્મિલેશન પણ જોવા મળ્યું હતું (f). વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે α-પેપ્ટાઇડમાં fMet1 થી Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 સુધીના અવશેષો હોય છે, અને β-પેપ્ટાઇડમાં Ser2 થી Ala53 સુધીના અવશેષો હોય છે, જે નીચા-તાપમાન EM ઘનતા નકશા સાથે સારા કરારમાં છે.
α-His29 અને β-His36 નું સંકલન BChls ને સામસામે બનાવે છે; દરેક αβ હેટરોડાઇમર તેના પડોશીઓ સાથે ભેગા થાય છે જેથી RC ની આસપાસ એક ઓપન લૂપ (RC-LH114-W) અથવા બંધ લૂપ (RC-LH116) બને. એક્સિટન કપ્લ્ડ પિગમેન્ટ એરે (આકૃતિ 1, C અને D). RC-LH114-W ના 877 nm બેન્ડની તુલનામાં, RC-LH116 નું 880 nm શોષણ રેડ શિફ્ટ 3 nm (આકૃતિ 2A) છે. જો કે, ગોળાકાર ડાયક્રોઇઝમ સ્પેક્ટ્રમ લગભગ સમાન છે (આકૃતિ 2B), જે દર્શાવે છે કે ખુલ્લા અને બંધ લૂપ્સ વચ્ચે સ્પષ્ટ તફાવત હોવા છતાં, BChls નું સ્થાનિક વાતાવરણ ખૂબ સમાન છે. શોષણ રેડશિફ્ટ બંધ લૂપ પર ઓછી થર્મલ ગતિ અને વધેલી સ્થિરતાનું પરિણામ હોઈ શકે છે (18, 19), બંધ લૂપ (20, 21) ને કારણે રંગદ્રવ્ય જોડાણમાં ફેરફાર, અથવા આ બે અસરોના સંયોજન (11).
(A) અલ્ટ્રાવાયોલેટ/દૃશ્યમાન/નજીક-ઇન્ફ્રારેડ શોષણ સ્પેક્ટ્રમ, જેની ટોચ તેમના અનુરૂપ રંગદ્રવ્યો સાથે ચિહ્નિત થયેલ છે અને 775 nm પર BPh ટોચ પર સામાન્ય થયેલ છે. (B) 805 nm પર BChl શોષણ માટે સામાન્ય થયેલ ગોળાકાર દ્વિધ્રુવીય સ્પેક્ટ્રમ. (C અને D) RC-LH114-W સંકુલ (C) અને RC-LH116 સંકુલ (D) ના સમય-નિરાકરણ શોષણ સ્પેક્ટ્રામાંથી પસંદ કરેલ ΔA સ્પેક્ટ્રા. વધુ સારી તુલનાત્મકતા માટે, બધા સ્પેક્ટ્રાને 0.2 ps પર ∆A ના ∆A પર સામાન્ય કરવામાં આવે છે. (E) UQ2 ની વિવિધ સાંદ્રતાની હાજરીમાં ઇરેડિયેશન પછી સાયટોક્રોમ c2 ઓક્સિડેશનનો દર (કાચા ડેટા માટે આકૃતિ S8 જુઓ). (F) ઓછી, મધ્યમ અથવા ઉચ્ચ તીવ્રતાવાળા પ્રકાશ (અનુક્રમે 10, 30 અથવા 300μMm-2 s-1) હેઠળ ઉગાડવામાં આવેલા કોષોમાં, પ્રોટીન W અને RC-L શુદ્ધ સંકુલ અને અલગ પટલ ગુણોત્તરમાં સબયુનિટ્સ છે. SDS-પોલીએક્રીલામાઇડ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ અને ઇમ્યુનોસે દ્વારા પ્રોટીન સ્તર નક્કી કરો (કાચા ડેટા માટે આકૃતિ S9 જુઓ). શુદ્ધ RC-LH114-W સંકુલના સંબંધમાં ગુણોત્તર નક્કી કરો. સંકુલના પ્રોટીન-W થી RC-L નો સ્ટોઇકિયોમેટ્રિક ગુણોત્તર 1:1 છે.
RC-LH114-W (આકૃતિ 1, A, C, અને E) ના વિકૃત αβ14 લૂપમાં સ્થાન 1 પરના BChls, RC-LH116 (આકૃતિ 1, B, D, અને F, અને આકૃતિ S3) માં સમકક્ષ BChls કરતાં RC પ્રાથમિક દાતા (P) ની 6.8Å નજીક છે; જોકે, બે સંકુલના ક્ષણિક શોષણ ગતિશાસ્ત્ર દર્શાવે છે કે RC-LH114-W અને RC-LH116 માટે, LH1 થી RC સુધીના ઉત્તેજના ઊર્જા ટ્રાન્સફર સમય સ્થિરાંકો 40 ±4 અને 44±3 ps છે (આકૃતિ 2). , C અને D, આકૃતિ S4 અને કોષ્ટક S2). RC ની અંદર ઇલેક્ટ્રોનિક ટ્રાન્સફરમાં પણ કોઈ નોંધપાત્ર તફાવત નથી (આકૃતિ S5 અને સંબંધિત પૂરક ટેક્સ્ટ). અમને શંકા છે કે LH1 અને RC-P વચ્ચે ઊર્જા ટ્રાન્સફર સમયનો નજીકનો પત્રવ્યવહાર બે LH1 લૂપમાં મોટાભાગના BChl ના સમાન અંતર, કોણ અને સંભવિત ઊર્જાને કારણે છે. એવું લાગે છે કે લઘુત્તમ અંતર સુધી પહોંચવા માટે LH1 ઉર્જા પેટર્નનું અન્વેષણ કરવું એ સબઓપ્ટિમલ સાઇટ્સથી RC સુધી સીધા ઉર્જા ટ્રાન્સફર કરતાં ઝડપી નથી. RC-LH114-W માં ઓપન-લૂપ LH1 લૂપ માળખાકીય વિશ્લેષણ માટે નીચા તાપમાનની સ્થિતિમાં પણ નજીવી થર્મલ ગતિમાંથી પસાર થઈ શકે છે, અને RC 1 ની સ્થિતિ પર βBChls ના પિગમેન્ટેશન અંતરથી ઓરડાના તાપમાને લાંબી αβ14 રિંગ કન્ફોર્મેશન હોય છે.
RC-LH116 સંકુલમાં 32 BChls અને 16 કેરોટીનોઇડ્સ છે, અને તેની એકંદર ગોઠવણી થર્મોક્રોમેટિયમ (Tch.) પિડપિડમ [પ્રોટીન ડેટા બેંક (PDB) ID 5Y5S] (9), થિઓરહોડોવિબ્રિઓ (Trv.) 970 સ્ટ્રેન (PDB ID 7C9R) (12) અને લીલી શેવાળ (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) માંથી મેળવેલી ગોઠવણી જેવી જ છે. ગોઠવણી પછી, αβ હેટરોડાઇમર્સની સ્થિતિમાં માત્ર નાના વિચલનો જોવા મળ્યા, ખાસ કરીને 1-5, 15 અને 16 (આકૃતિ S6). પ્રોટીન-W ની હાજરી LH1 ની રચના પર નોંધપાત્ર અસર કરે છે. તેના ત્રણ TMH ટૂંકા લૂપ્સ દ્વારા જોડાયેલા છે, જેમાં N-ટર્મિનલ કોમ્પ્લેક્સની લ્યુમેન બાજુ પર છે અને C-ટર્મિનલ સાયટોપ્લાઝમિક બાજુ પર છે (આકૃતિ 1A અને 3, A થી D). પ્રોટીન-W મોટાભાગે હાઇડ્રોફોબિક છે (આકૃતિ 3B), અને TMH2 અને TMH3 LH1αβ-14 સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરીને ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન સપાટી બનાવે છે (આકૃતિ 3, B અને E થી G). ઇન્ટરફેસ મુખ્યત્વે ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન ક્ષેત્રમાં Phe, Leu અને Val અવશેષોથી બનેલું છે. આ અવશેષો હાઇડ્રોફોબિક એમિનો એસિડ અને αβ-14 રંગદ્રવ્યોથી ભરેલા છે. કેટલાક ધ્રુવીય અવશેષો પણ ક્રિયાપ્રતિક્રિયામાં ફાળો આપે છે, જેમાં જટિલ પોલાણની સપાટી પર W-Thr68 અને β-Trp42 વચ્ચેના હાઇડ્રોજન બોન્ડનો સમાવેશ થાય છે (આકૃતિ 3, F અને G). સાયટોપ્લાઝમની સપાટી પર, Gln34 αβ-14 કેરોટીનોઇડ્સના કીટો જૂથની બાજુમાં છે. વધુમાં, n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) પરમાણુનું નિરાકરણ કરવામાં આવ્યું હતું, અને તેની હાઇડ્રોફોબિક પૂંછડી પ્રોટીન-W અને αβ-14 વચ્ચેના ઇન્ટરફેસ સુધી વિસ્તરેલી હતી, અને લિપિડ પૂંછડી શરીરમાં સ્થિત હોઈ શકે છે. અમે એ પણ જોયું કે પ્રોટીન W અને RCH ના C-ટર્મિનલ રિઝોલ્યુશન ક્ષેત્રો ખૂબ નજીક છે, પરંતુ ચોક્કસ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ બનાવવાના અવકાશમાં નથી (આકૃતિ 1, A અને E). જો કે, આ બે પ્રોટીનના વણઉકેલાયેલા C-ટર્મિનલ એમિનો એસિડમાં ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ હોઈ શકે છે, જે RC-LH114-W સંકુલના એસેમ્બલી દરમિયાન પ્રોટીન-W ની ભરતી માટે એક પદ્ધતિ પ્રદાન કરી શકે છે.
(A) પ્રોટીન-W, જે કાર્ટૂન સ્વરૂપમાં LH1αβ14 સાથે ઇન્ટરફેસનો સામનો કરે છે, તેમાં સળિયા આકારની સાઇડ ચેઇન (લાલ) છે, જે ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક પોટેન્શિયલ ડાયાગ્રામના એક ભાગમાં પ્રદર્શિત થાય છે (0.13 ના કોન્ટૂર સ્તર સાથે પારદર્શક રાખોડી સપાટી). (B) પ્રોટીન-W હાઇડ્રોફોબિક રંગીન સપાટી દ્વારા રજૂ થાય છે. ધ્રુવીય અને ચાર્જ થયેલ વિસ્તારો વાદળી રંગમાં પ્રદર્શિત થાય છે, હાઇડ્રોફોબિક વિસ્તારો સફેદ રંગમાં પ્રદર્શિત થાય છે, અને મજબૂત હાઇડ્રોફોબિક વિસ્તારો નારંગી રંગમાં પ્રદર્શિત થાય છે. (C અને D) કાર્ટૂનમાં રજૂ કરાયેલ પ્રોટીન-W, તેનું ઓરિએન્ટેશન (A) (C) જેવું જ છે, અને 180° (D) દ્વારા ફેરવાય છે. ક્રમમાં સ્થિતિ અનુસાર, અલગ પાડી શકાય તેવા અવશેષો મેઘધનુષ્ય રંગ યોજના અપનાવે છે, જ્યાં N-ટર્મિનલ વાદળી છે અને C-ટર્મિનલ લાલ છે. (E) પ્રોટીન-W (A) માં સમાન દૃશ્યમાં, અને પ્રોટીન-W:LH1 ના ઇન્ટરફેસ પરના અવશેષો જોડાયેલ ચિહ્નો સાથે સળિયા દ્વારા દર્શાવવામાં આવે છે. (F) કાર્ટૂન રજૂઆતમાં પ્રોટીન-W ને (E) અને LH1αβ14 ની સાપેક્ષમાં 90° ફેરવવામાં આવે છે, અને બાર રજૂઆતમાં ઇન્ટરફેસ અવશેષોની સાપેક્ષમાં. બીટા પોલીપેપ્ટાઇડમાંથી ઓવરહેંગિંગ અવશેષોને લેબલ કરવામાં આવે છે. કોફેક્ટરને આકૃતિ 1 ના રંગ સાથે મેળ ખાતા બાર તરીકે દર્શાવવામાં આવે છે, વિઘટિત β-DDM ગ્રે રંગમાં બતાવવામાં આવે છે, અને ઓક્સિજન લાલ રંગમાં બતાવવામાં આવે છે. (G) (F) માં દૃશ્ય 180° ફેરવવામાં આવે છે, જેમાં લેબલવાળા આલ્ફા પોલીપેપ્ટાઇડના મુખ્ય અવશેષો છે.
પ્રોટીન-W એક αβ હેટરોડાઈમર (આકૃતિ 1F માં 15મો) ને બદલે છે, જેનાથી લૂપ બંધ થવાનું અને પહેલા ત્રણ αβ હેટરોડાઈમરને નમવું અટકાવે છે. એવું જોવા મળ્યું હતું કે ફિલ્મ નોર્મલની તુલનામાં પહેલા αβ-1 હેટરોડાઈમરનો મહત્તમ ઝોક કોણ 25° થી 29° (આકૃતિ 1, A અને E) હતો, જે RC A શાર્પ કોન્ટ્રાસ્ટ-LH116 (આકૃતિ 1, B અને F) માં αβ-1 ના 2° થી 8° ઝોક દ્વારા રચાયો હતો. બીજા અને ત્રીજા હેટરોડાઈમર અનુક્રમે 12° થી 22° અને 5° થી 10° પર ઝોક ધરાવે છે. RC ના સ્ટીરિક અવરોધને કારણે, αβ-1 ના ઝોકમાં αβ ની બીજી જોડીનો સમાવેશ થતો નથી (જે આકૃતિ 1F માં 16મા αβ ને અનુરૂપ છે), આમ LH1 રિંગ (આકૃતિ 1, A અને E) માં સ્પષ્ટ ગેપ બનાવે છે. બે αβ હેટરોડાઇમરના અભાવને કારણે, ચાર BChl અને બે કેરોટીનોઇડ્સના નુકશાન સાથે, કોઈપણ કેરોટીનોઇડ ટ્વિસ્ટેડ αβ-1 સબ્યુનિટ સાથે જોડાતું નથી, જેના પરિણામે LH114-W રિંગ બને છે જેમાં 13 કેરોટીનોઇડ્સ શાકાહારી અને 28 BChls હોય છે. αβ1 થી 7 પ્રદેશોમાં બે સંકુલના સ્થાનિક રિઝોલ્યુશન અંદાજ બાકીના LH1 લૂપ કરતા ઓછા છે, જે RC QB સાઇટ (આકૃતિ 4) ને અડીને આવેલા LH1 સબ્યુનિટની સહજ પ્લાસ્ટિસિટીને પ્રતિબિંબિત કરી શકે છે.
RC-LH114-W (A અને B) અને RC-LH116 (C અને D) ના ચિત્રો આકૃતિ 1. (B અને D) માં સમાન ટોચના દૃશ્ય/બાજુના દૃશ્ય (A અને B) (A અને C) અને પોલાણ સપાટી પરથી બતાવવામાં આવ્યા છે. રંગીન ચાવીઓ જમણી બાજુએ બતાવવામાં આવી છે.
1:14 ના સ્ટોઇકિયોમેટ્રિક ગુણોત્તર સાથેનો એકમાત્ર અન્ય લાક્ષણિક કોર કોમ્પ્લેક્સ રોડોકોકસ સ્ફેરોઇડ્સ (Rba.) RC-LH1-PufX ડાયમર (13) છે. જો કે, પ્રોટીન W અને PufX ની કોઈ સ્પષ્ટ સમાનતા નથી, અને તેઓ તેમના સંબંધિત LH1 માળખા પર નોંધપાત્ર અસર કરે છે. PufX એ N-ટર્મિનલ સાયટોપ્લાઝમિક ડોમેન સાથેનું એક સિંગલ TMH છે જે Rps. palustris LH116αβ-16 ને અનુરૂપ સ્થાન પર RC-H સબ્યુનિટ (13) ની સાયટોપ્લાઝમિક બાજુ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે. PufX RC-LH1 અને સાયટોક્રોમ bcl કોમ્પ્લેક્સ વચ્ચે ક્વિનોન/ક્વિનોલોન વિનિમય માટે એક ચેનલ બનાવે છે અને તે બધા Rba. sphaeroides કોર કોમ્પ્લેક્સ (13) માં હાજર છે. જોકે મોનોમર-મોનોમર ઇન્ટરફેસ Rba માં છે. સ્ફેરોઇડ્સ RC-LH1-PufX ડાયમર RC-LH114-W માં પ્રોટીન W ની બંધનકર્તા સ્થિતિમાં સ્થિત છે, અને PufX અને પ્રોટીન-W દ્વારા પ્રેરિત ગેપ સમકક્ષ સ્થાને છે (આકૃતિ S7A). RC-LH114-W માં ગેપ સ્યુડોમોનાસ રોઝા LH1 ના કાલ્પનિક ક્વિનોન ચેનલ (8) સાથે પણ ગોઠવાયેલ છે, જે પ્રોટીન W અથવા PufX (આકૃતિ S7B) સાથે સંબંધિત ન હોય તેવા પેપ્ટાઇડ્સ દ્વારા રચાય છે. વધુમાં, Blc માં ક્વિનોન ચેનલ. એક γ સબ્યુનિટ (7) ને બાકાત રાખીને રચાયેલ નીલમણિ લીલો LH1 સમાન સ્થિતિમાં સ્થિત છે (આકૃતિ S7C). વિવિધ પ્રોટીન દ્વારા મધ્યસ્થી હોવા છતાં, RC-LH1 સંકુલમાં સામાન્ય સ્થિતિમાં આ ક્વિનોન/ક્વિનોલોલ ચેનલોનો દેખાવ કન્વર્જન્ટ ઉત્ક્રાંતિનું ઉદાહરણ લાગે છે, જે દર્શાવે છે કે પ્રોટીન W દ્વારા બનાવેલ ગેપ ક્વિનોન ચેનલ તરીકે કાર્ય કરી શકે છે.
LH114-W લૂપમાં ગેપ RC-LH114-W કોમ્પ્લેક્સ અને બલ્ક મેમ્બ્રેન (આકૃતિ 1G) ની આંતરિક જગ્યા વચ્ચે સતત મેમ્બ્રેન ક્ષેત્રની રચનાને મંજૂરી આપે છે, પ્રોટીનની જેમ પ્રોટીન છિદ્ર દ્વારા બે ડોમેનને જોડવાને બદલે. RC-LH116 કોમ્પ્લેક્સ બંધ Tch. સોય જેવા કોમ્પ્લેક્સ (22) (આકૃતિ 1H) જેવું જ છે. પટલ દ્વારા ક્વિનોનનું પ્રસરણ સાંકડી પ્રોટીન ચેનલ દ્વારા પ્રસરણ કરતાં ઝડપી હોવાથી, ખુલ્લું LH114-W લૂપ બંધ LH116 લૂપ કરતાં ઝડપી RC ટર્નઓવરને મંજૂરી આપી શકે છે, અને RC માં ક્વિનોનનું પ્રસરણ વધુ પ્રતિબંધિત હોઈ શકે છે. પ્રોટીન W RC દ્વારા ક્વિનોન્સના રૂપાંતરને અસર કરે છે કે કેમ તે ચકાસવા માટે, અમે ubiquinone 2 (UQ2) (ટૂંકી આઇસોપ્રીન પૂંછડી સાથે કુદરતી UQ10 નું એનાલોગ) (આકૃતિ 2E) ની ચોક્કસ સાંદ્રતા પર સાયટોક્રોમ ઓક્સિડેશન પરીક્ષણ કર્યું. જોકે ચેલેટેડ ક્વિનોનની હાજરી સ્પષ્ટ માઇકલિસ કોન્સ્ટન્ટ (RC-LH114-W અને RC-LH116 અનુક્રમે 0.2±0.1μM અને 0.5±0.2μM માટે યોગ્ય છે) ના ચોક્કસ નિર્ધારણને અવરોધે છે, RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) નો મહત્તમ દર RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) કરતા 28±5% મોટો છે.
શરૂઆતમાં અમે અંદાજ લગાવ્યો હતો કે પ્રોટીન-W કોર કોમ્પ્લેક્સના લગભગ 10% માં હાજર છે (16); અહીં, ઓછા પ્રકાશ, મધ્યમ પ્રકાશ અને ઉચ્ચ પ્રકાશ વૃદ્ધિ કોષોનો કબજો દર અનુક્રમે 15±0.6%, 11±1% અને 0.9±0.5 છે (આકૃતિ 2F). માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રીની માત્રાત્મક સરખામણી દર્શાવે છે કે હિસ્ટીડાઇન ટેગના ઉમેરાથી વાઇલ્ડ-ટાઇપ સ્ટ્રેન્સ (P = 0.59) ની તુલનામાં પ્રોટીન-W ની સંબંધિત વિપુલતામાં ઘટાડો થયો નથી, તેથી આ સ્તરો સંશોધિત પ્રોટીન-W (આકૃતિ S10) નું આર્ટિફેક્ટ નથી. જો કે, RC-LH1 સંકુલમાં પ્રોટીન-W ની આ ઓછી કબજો કેટલાક RC ને ઝડપી દરે ફ્લિપ કરવાની મંજૂરી આપી શકે છે, જેનાથી RC-LH116 સંકુલમાં ધીમા ક્વિનોન/ક્વિનોલોન વિનિમયને ઘટાડી શકાય છે. અમે જોયું કે ઉચ્ચ પ્રકાશ કબજો દર તાજેતરના ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ ડેટા સાથે અસંગત છે, જે દર્શાવે છે કે મજબૂત પ્રકાશ હેઠળ pufW જનીન અભિવ્યક્તિ વધે છે (આકૃતિ S11) (23). RC-LH1 સંકુલમાં pufW ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને પ્રોટીન-W ના સમાવેશ વચ્ચેનો તફાવત ગૂંચવણભર્યો છે અને પ્રોટીનના જટિલ નિયમનને પ્રતિબિંબિત કરી શકે છે.
RC-LH114-W માં, 6 કાર્ડિયોલિપિન (CDL), 7 ફોસ્ફેટિડિલ્કોલાઇન (POPC), 1 ફોસ્ફેટિડિગ્લિસરોલ (POPG) અને 29 β-DDM પરમાણુઓ ફાળવવામાં આવ્યા છે અને તેમાં 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs અને 12 βDDMs નું મોડેલિંગ કરવામાં આવ્યું છે. RC-LH116 (આકૃતિ 5, A અને B). આ બે રચનાઓમાં, CDL લગભગ સંકુલની સાયટોપ્લાઝમિક બાજુ પર સ્થિત છે, જ્યારે POPC, POPG અને β-DDM મોટે ભાગે લ્યુમિનલ બાજુ પર સ્થિત છે. RC-LH114-W સંકુલ (આકૃતિ 5A) ના αβ-1 થી αβ-6 પ્રદેશમાં બે લિપિડ અને ડિટર્જન્ટ પરમાણુઓને અલગ કરવામાં આવ્યા હતા, અને પાંચને RC-LH116 (આકૃતિ 5B) ના સમકક્ષ પ્રદેશમાં અલગ કરવામાં આવ્યા હતા. સંકુલની બીજી બાજુએ વધુ લિપિડ્સ મળી આવ્યા, મુખ્યત્વે CDL, જે RC અને αβ-7 થી αβ-13 (આકૃતિ 5, A અને B) વચ્ચે સંચિત હતા. અન્ય માળખાકીય રીતે ઉકેલાયેલા લિપિડ્સ અને ડિટર્જન્ટ્સ LH1 રિંગની બહાર સ્થિત છે, અને સારી રીતે ઉકેલાયેલા એસીલ સાંકળો LH1 સબ્યુનિટ્સ વચ્ચે વિસ્તરે છે, જે RC-LH114-W માં β-DDM તરીકે નિયુક્ત કરવામાં આવ્યા છે, અને RC માં β-DDM તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવ્યા છે. β-DDM અને POPC-LH116 નું મિશ્રણ. અમારી રચનામાં ચેલેટીંગ લિપિડ્સ અને ડિટર્જન્ટ્સની સમાન સ્થિતિ સૂચવે છે કે તેઓ શારીરિક રીતે સંબંધિત બંધનકર્તા સ્થળો છે (આકૃતિ S12A). Tch માં સમકક્ષ અણુઓની સ્થિતિ પણ સારી સુસંગતતા ધરાવે છે. સૌમ્ય અને Trv. સ્ટ્રેન 970 RC-LH1s (આકૃતિ S12, B થી E) (9, 12) અને લિપિડ હેડ ગ્રુપના હાઇડ્રોજન-બોન્ડિંગ અવશેષોએ ક્રમ સંરેખણ (આકૃતિ S13) માં એકદમ સારું સંરક્ષણ દર્શાવ્યું હતું, જે દર્શાવે છે કે RC (24) સાથે જોડાતા સંરક્ષિત CDL, આ સ્થળો RC-LH1 સંકુલમાં સંરક્ષિત થઈ શકે છે.
(A અને B) RC-LH114-W (A) અને RC-LH116 (B) પેપ્ટાઇડ્સને કાર્ટૂન દ્વારા દર્શાવવામાં આવ્યા છે, અને રંગદ્રવ્યો સળિયા દ્વારા દર્શાવવામાં આવ્યા છે, આકૃતિ 1 માં રંગ યોજનાનો ઉપયોગ કરીને. લિપિડ્સ લાલ રંગમાં દર્શાવવામાં આવ્યા છે, અને ડિટર્જન્ટ્સ ગ્રે રંગમાં દર્શાવવામાં આવ્યા છે. RC QA અને QB સાઇટ્સ સાથે બંધાયેલ UQ પીળો છે, જ્યારે અલગ UQ વાદળી છે. (C અને D) લિપિડ્સને બાદ કરતાં (A) અને (B) જેવા જ દૃશ્યો. (E થી G) RC-LH116 માંથી Q1(E), Q2(F) અને Q3(G) નું વિસ્તૃત દૃશ્ય, એકબીજાને પ્રભાવિત કરતી બાજુની સાંકળો સાથે. હાઇડ્રોજન બોન્ડ્સ કાળા ડેશવાળી રેખાઓ તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યા છે.
RC-LH116 માં, ચાર્જ વિભાજન પ્રક્રિયામાં ઇલેક્ટ્રોન ટ્રાન્સફરમાં ભાગ લેતા RC QA અને QB UQ બંને તેમના બંધનકર્તા સ્થળોએ વિઘટિત થાય છે. જો કે, RC-LH114-W માં, QB ક્વિનોનનું નિરાકરણ થયું નથી અને નીચે વિગતવાર ચર્ચા કરવામાં આવશે. QA અને QB ક્વિનોન ઉપરાંત, બે ચેલેટેડ UQ અણુઓ (RC અને LH1 રિંગ્સ વચ્ચે સ્થિત) તેમના સારી રીતે નિરાકરણ કરાયેલ હેડ જૂથો (અનુક્રમે Q1 અને Q2 માં સ્થિત) અનુસાર RC-LH114-W માળખામાં ફાળવવામાં આવ્યા છે. જગ્યા). આકૃતિ 5C). Q1 ને બે આઇસોપ્રીન એકમો સોંપવામાં આવ્યા છે, અને ઘનતા નકશો Q2 ના સંપૂર્ણ 10 આઇસોપ્રીન પૂંછડીઓનું નિરાકરણ કરે છે. RC-LH116 ની રચનામાં, ત્રણ ચેલેટેડ UQ10 અણુઓ (Q1 થી Q3, આકૃતિ 5D) ઉકેલાયા હતા, અને બધા અણુઓની પૂંછડીમાં સ્પષ્ટ ઘનતા છે (આકૃતિ 5, D થી G). બે રચનાઓમાં, Q1 અને Q2 ના ક્વિનોન હેડ જૂથોની સ્થિતિ ઉત્તમ સુસંગતતા ધરાવે છે (આકૃતિ S12F), અને તેઓ ફક્ત RC સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે. Q1 એ RC-LH114-W (આકૃતિ 1G અને 5, C, D અને E) ના W ગેપના પ્રવેશદ્વાર પર સ્થિત છે, અને Q2 QB બંધનકર્તા સ્થળ (આકૃતિ 5, C, D) અને F ની નજીક સ્થિત છે. સંરક્ષિત L-Trp143 અને L-Trp269 અવશેષો Q1 અને Q2 ની ખૂબ નજીક છે અને સંભવિત π-સ્ટેકીંગ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ પ્રદાન કરે છે (આકૃતિ 5, E અને F, અને આકૃતિ S12). Q1 ના ​​દૂરના ઓક્સિજનમાંથી L-Gln88, 3.0 Å, એક મજબૂત હાઇડ્રોજન બોન્ડ (આકૃતિ 5E) પ્રદાન કરે છે; આ અવશેષ સૌથી દૂરના સંબંધ (આકૃતિ S13) સિવાય તમામ RC માં સંરક્ષિત છે. મોટાભાગના અન્ય RCs (આકૃતિ S13) માં Thr માટે L-Ser91 રૂઢિચુસ્ત રીતે બદલવામાં આવે છે, Q1 ના ​​મિથાઈલ ઓક્સિજનમાંથી 3.8 એંગસ્ટ્રોમ્સ છે, અને નબળા હાઇડ્રોજન બોન્ડ પ્રદાન કરી શકે છે (આકૃતિ 5E). Q3 માં કોઈ ચોક્કસ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા હોય તેવું લાગતું નથી, પરંતુ તે RC-M સબ્યુનિટ અને LH1-α સબ્યુનિટ 5 થી 6 (આકૃતિ 5, D અને G) વચ્ચેના હાઇડ્રોફોબિક પ્રદેશમાં સ્થિત છે. Q1, Q2 અને Q3 અથવા નજીકના ચેલેટેડ ક્વિનોન્સ પણ Tch. Gentle, Trv. Strain 970 અને Blc માં ઉકેલાઈ ગયા છે. આઇરિસ સ્ટ્રક્ચર (9, 10, 12) RC-LH1 કોમ્પ્લેક્સ (આકૃતિ S12G) માં સંરક્ષિત સહાયક ક્વિનોન બંધનકર્તા સ્થળ તરફ નિર્દેશ કરે છે. RC-LH116 માં પાંચ વિઘટિત UQs ઉચ્ચ પ્રદર્શન પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફી (HPLC) દ્વારા નક્કી કરાયેલ દરેક સંકુલના 5.8±0.7 સાથે સારા સંમતિમાં છે, જ્યારે RC-LH114-W માં ત્રણ વિઘટિત UQs 6.2±0.3 (આકૃતિ S14) નું માપેલ મૂલ્ય કરતાં ઓછું છે તે દર્શાવે છે કે રચનામાં વણઉકેલાયેલા UQ પરમાણુઓ છે.
સ્યુડો-સિમેટ્રિક L અને M પોલીપેપ્ટાઇડ્સમાં પાંચ TMH હોય છે અને એક હેટરોડાઇમર બનાવે છે જે એક BChl ડાયમર, બે BChl મોનોમર્સ, બે બેક્ટેરિયોફેજ (BPh) મોનોમર્સ અને એક નોન-હીમ આયર્ન અને એક અથવા બે UQ10 પરમાણુઓને જોડે છે. ટર્મિનલ કીટોન જૂથ પર હાઇડ્રોજન બોન્ડની હાજરી અને Rps માં તેના જાણીતા સંચય દ્વારા, કેરોટીનોઇડ્સ M-સબ્યુનિટમાં સમાવિષ્ટ થાય છે, જેને cis-3,4-dehydroorhodopin નામ આપવામાં આવ્યું છે. પ્રજાતિઓ (25). RC-H નું બાહ્ય પટલ ડોમેન એક TMH દ્વારા પટલ સાથે જોડાયેલું છે. એકંદર RC માળખું સંબંધિત પ્રજાતિઓ (જેમ કે Rba) ના ત્રણ સબ્યુનિટ RC જેવું જ છે. સ્ફેરોઇડ્સ (PDB ID: 3I4D). આ રચનાઓની રિઝોલ્યુશન શ્રેણીમાં BChl અને BPh, કેરોટીનોઇડ બેકબોન અને નોન-હીમ આયર્નના મેક્રોસાયકલ્સ ઓવરલેપ થાય છે, જેમ કે QA સાઇટ પર UQ10 હેડ ગ્રુપ અને RC-LH116 (આકૃતિ S15) પર QB ક્વિનોન.
અલગ અલગ QB સાઇટ ઓક્યુપન્સી રેટ સાથે બે RC સ્ટ્રક્ચર્સની ઉપલબ્ધતા QB ક્વિનોન બંધન સાથે સુસંગત રચનાત્મક ફેરફારોની તપાસ કરવાની નવી તક પૂરી પાડે છે. RC-LH116 સંકુલમાં, QB ક્વિનોન સંપૂર્ણપણે બંધાયેલ "પ્રોક્સિમલ" સ્થિતિમાં સ્થિત છે (26), પરંતુ RC-LH114-W ના વિભાજનમાં QB ક્વિનોન નથી. RC-LH114-W માં કોઈ QB ક્વિનોન નથી, જે આશ્ચર્યજનક છે કારણ કે સંકુલ સક્રિય છે, માળખાકીય રીતે ઉકેલાયેલા QB ક્વિનોન સાથે RC-LH116 સંકુલ કરતાં વધુ. જોકે બે LH1 રિંગ્સ લગભગ છ ક્વિનોનને ચેલેટ કરે છે, પાંચ બંધ RC-LH116 રિંગમાં માળખાકીય રીતે ઉકેલાયેલા છે, જ્યારે ખુલ્લા RC-LH114-W રિંગમાં માળખાકીય રીતે મર્યાદિત છે. આ વધેલી માળખાકીય વિકૃતિ RC-LH114-W QB સાઇટ્સના ઝડપી રિપ્લેસમેન્ટ, સંકુલમાં ઝડપી ક્વિનોન ગતિશાસ્ત્ર અને LH1 લૂપને પાર કરવાની વધેલી સંભાવનાને પ્રતિબિંબિત કરી શકે છે. અમે સૂચવીએ છીએ કે RC-LH114-W ના RC QB સાઇટમાં UQ નો અભાવ વધુ જટિલ અને વધુ સક્રિય સંકુલનું પરિણામ હોઈ શકે છે, અને RC-LH114-W ના QB સાઇટને UQ ટર્નઓવરમાં તાત્કાલિક સ્થિર કરવામાં આવ્યા છે. ચોક્કસ તબક્કો (QB સાઇટનો પ્રવેશદ્વાર બંધ કરવામાં આવ્યો છે) આ પ્રવૃત્તિના બંધારણને પ્રતિબિંબિત કરે છે.
QB વિના, L-Phe217 નું પરિભ્રમણ UQ10 બંધન સાથે અસંગત સ્થિતિમાં, કારણ કે તે પૂંછડીના પ્રથમ આઇસોપ્રીન એકમ સાથે અવકાશી અથડામણનું કારણ બનશે (આકૃતિ 6A). વધુમાં, સ્પષ્ટ મુખ્ય રચનાત્મક ફેરફારો સ્પષ્ટ છે, ખાસ કરીને હેલિક્સ ડી (TMH D અને E વચ્ચેના લૂપમાં ટૂંકા હેલિક્સ) જ્યાં L-Phe217 ને QB બંધન પોકેટમાં ખસેડવામાં આવે છે અને L-Tyr223 નું પરિભ્રમણ (આકૃતિ 6A) M-Asp45 ફ્રેમવર્ક સાથે હાઇડ્રોજન બોન્ડ તોડવા અને QB બંધન સ્થળના પ્રવેશદ્વારને બંધ કરવા માટે (આકૃતિ 6B). હેલિક્સ ડી તેના આધાર પર પિવોટ્સ કરે છે, L-Ser209 નું Cα 0.33Å દ્વારા ખસેડવામાં આવે છે, જ્યારે L-Val221Cα 3.52Å દ્વારા ખસેડવામાં આવે છે. TMH D અને E માં કોઈ અવલોકનક્ષમ ફેરફારો નથી, જે બંને રચનાઓમાં સુપરઇમ્પોઝેબલ છે (આકૃતિ 6A). જ્યાં સુધી આપણે જાણીએ છીએ, કુદરતી RC માં આ પહેલું માળખું છે જે QB સાઇટને બંધ કરે છે. સંપૂર્ણ (QB-બાઉન્ડ) માળખા સાથે સરખામણી દર્શાવે છે કે ક્વિનોન ઘટાડવામાં આવે તે પહેલાં, તેને ક્વિનોનમાં પ્રવેશવા માટે એક રચનાત્મક ફેરફાર જરૂરી છે. L-Phe217 ક્વિનોન હેડ ગ્રુપ સાથે π-સ્ટેકિંગ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા બનાવવા માટે ફરે છે, અને હેલિક્સ બહારની તરફ ખસી જાય છે, જેનાથી L-Gly222 ના હાડપિંજર અને L-Tyr223 ની બાજુની સાંકળ સ્થિર હાઇડ્રોજન બોન્ડ માળખા સાથે હાઇડ્રોજન બોન્ડ નેટવર્ક બનાવે છે (આકૃતિ 6, A અને C).
(A) હોલોગ્રામ (L સાંકળ, નારંગી/M સાંકળ, મેજેન્ટા) અને apo (ગ્રે) માળખાનું ઓવરલેપિંગ કાર્ટૂન, જેમાં મુખ્ય અવશેષો સળિયા જેવા પ્રતિનિધિત્વના સ્વરૂપમાં પ્રદર્શિત થાય છે. UQ10 પીળા બાર દ્વારા રજૂ થાય છે. ડોટેડ રેખા સમગ્ર માળખામાં રચાયેલા હાઇડ્રોજન બોન્ડ સૂચવે છે. (B અને C) એપોલીપોપ્રોટીન અને સમગ્ર રિંગ માળખાનું સપાટી પ્રતિનિધિત્વ, જે અનુક્રમે વાદળી રંગમાં L-Phe217 અને લાલ રંગમાં L-Tyr223 ના સાઇડ ચેઇન ઓક્સિજનને પ્રકાશિત કરે છે. L સબયુનિટ નારંગી છે; M અને H સબયુનિટ રંગીન નથી. (D અને E) એપોલીપોપ્રોટીન (D) અને સમગ્ર (E) RC QB સાઇટ્સ [અનુક્રમે (A) દ્વારા રંગ] અને થર્મોફિલસ થર્મોફિલસ PSII (પ્લાસ્ટિક ક્વિનોન સાથે લીલો, વાદળી; PDB ID: 3WU2) સંરેખિત કરો (58).
અણધારી રીતે, LH1 વગર QB-ઉણપવાળા RCs ની ઘણી રચનાઓ ઉપલબ્ધ હોવા છતાં, આ અભ્યાસમાં જોવા મળેલા રચનાત્મક ફેરફારો અગાઉ નોંધાયા નથી. આમાં Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) અને Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) માંથી QB અવક્ષય માળખું શામેલ છે, જે બધા લગભગ તેમના એકંદર QB માળખા જેવા જ છે. 3PRC ના નજીકથી નિરીક્ષણથી જાણવા મળ્યું કે LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ડિટર્જન્ટ પરમાણુઓ QB સ્થિતિના પ્રવેશદ્વાર પર જોડાય છે, જે બંધ રચનામાં ફરીથી ગોઠવણીને અટકાવી શકે છે. જોકે LDAO 1EYS અથવા 1OGV માં સમાન સ્થિતિમાં વિઘટન કરતું નથી, આ RCs સમાન ડિટર્જન્ટનો ઉપયોગ કરીને તૈયાર કરવામાં આવે છે અને તેથી તે જ અસર ઉત્પન્ન કરી શકે છે. Rba નું સ્ફટિક માળખું. સાયટોક્રોમ c2 (PDB ID: 1L9B) સાથે સહ-સ્ફટિકીકરણ કરાયેલ Sphaeroides RC માં પણ QB સાઇટ બંધ હોય તેવું લાગે છે. જો કે, આ કિસ્સામાં, RC-M પોલીપેપ્ટાઇડનો N-ટર્મિનલ પ્રદેશ (Q હેલિક્સ પર Tyr અવશેષના H બોન્ડ દ્વારા QB બંધનકર્તા સ્થળ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે) એક અકુદરતી રચના અપનાવે છે, અને QB રચનાત્મક પરિવર્તનનો વધુ અભ્યાસ કરવામાં આવતો નથી (30). ખાતરી આપનારી વાત એ છે કે આપણે RC-LH114-W માળખામાં M પોલીપેપ્ટાઇડનું આ પ્રકારનું વિરૂપતા જોયું નથી, જે લગભગ RC-LH116 RC ના N-ટર્મિનલ ક્ષેત્ર જેવું જ છે. એ પણ નોંધવું જોઈએ કે ડિટર્જન્ટ-આધારિત LH1 એન્ટેના નાબૂદ થયા પછી, PDB માં એપોલિપોપ્રોટીન RC ઉકેલાઈ ગયા હતા, જેણે RC અને આસપાસના LH1 રિંગની આંતરિક સપાટી વચ્ચેના અંતરમાં આંતરિક ક્વિનોન પુલ અને લિપિડ્સને દૂર કર્યા હતા (31, 32). RC કાર્યરત રહે છે કારણ કે તે બધા સહ-પરિબળોને જાળવી રાખે છે, સિવાય કે વિઘટનક્ષમ QB ક્વિનોન, જે ઓછું સ્થિર હોય છે અને ઘણીવાર તૈયારી પ્રક્રિયા દરમિયાન ખોવાઈ જાય છે (33). વધુમાં, તે જાણીતું છે કે RC માંથી LH1 અને કુદરતી ચક્રીય લિપિડ્સને દૂર કરવાથી કાર્યો પર અસર પડી શકે છે, જેમ કે ચાર્જ-વિભાજિત P+QB-સ્ટેટનું ટૂંકું જીવનકાળ (31, 34, 35). તેથી, અમે અનુમાન કરીએ છીએ કે RC ની આસપાસના સ્થાનિક LH1 રિંગનું અસ્તિત્વ "બંધ" QB સાઇટ જાળવી શકે છે, જેનાથી QB ની નજીક સ્થાનિક પર્યાવરણ સાચવી શકાય છે.
જોકે એપોલીપોપ્રોટીન (QB ક્વિનોન વિના) અને સંપૂર્ણ માળખું ઘટનાઓની શ્રેણીને બદલે QB સાઇટના ટર્નઓવરના ફક્ત બે સ્નેપશોટ રજૂ કરે છે, એવા સંકેતો છે કે સબસ્ટ્રેટ અવરોધને રોકવા માટે હાઇડ્રોક્વિનોન દ્વારા રિબાઇન્ડિંગ અટકાવવા માટે બંધનકર્તાને ગેટ કરી શકાય છે. એપોલીપોપ્રોટીનનાં QB સાઇટની નજીક ક્વિનોલોલ અને ક્વિનોનની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા અલગ હોઈ શકે છે, જે RC દ્વારા તેના અસ્વીકાર તરફ દોરી જાય છે. લાંબા સમયથી એવું સૂચન કરવામાં આવ્યું છે કે રચનાત્મક ફેરફારો ક્વિનોન્સના બંધન અને ઘટાડામાં ભૂમિકા ભજવે છે. શ્યામ અનુકૂલન પછી ક્વિનોન્સ ઘટાડવા માટે સ્થિર RC ની ક્ષમતા નબળી પડી જાય છે (36); એક્સ-રે સ્ફટિકોગ્રાફી દર્શાવે છે કે આ નુકસાન QB ક્વિનોન્સ સક્રિય પ્રોક્સિમલ સ્થિતિ (26) થી લગભગ 4.5 Å "દૂરના" રચનામાં ફસાયેલા હોવાને કારણે છે, 37). અમે સૂચવીએ છીએ કે આ દૂરવર્તી બંધનકર્તા રચના એપોલીપોપ્રોટીન અને સંપૂર્ણ રિંગ રચના વચ્ચેની મધ્યવર્તી સ્થિતિનો સ્નેપશોટ છે, જે ક્વિનોન સાથે પ્રારંભિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયા અને QB સાઇટના ઉદઘાટનને અનુસરે છે.
ચોક્કસ ફોટોટ્રોફિક બેક્ટેરિયા અને સાયનોબેક્ટેરિયા, શેવાળ અને છોડના PSII સંકુલમાં જોવા મળતો પ્રકાર II RC માળખાકીય અને કાર્યાત્મક સંરક્ષણ ધરાવે છે (38). આકૃતિ 6 (D અને E) માં દર્શાવેલ માળખાકીય ગોઠવણી PSII RCs અને બેક્ટેરિયલ RC સંકુલના QB સ્થળ વચ્ચે સમાનતા પર ભાર મૂકે છે. આ સરખામણી લાંબા સમયથી ક્વિનોન બંધન અને ઘટાડાની નજીકથી સંબંધિત પ્રણાલીઓનો અભ્યાસ કરવા માટે એક મોડેલ રહી છે. અગાઉના પ્રકાશનોએ સૂચવ્યું હતું કે ક્વિનોન્સના PSII ઘટાડા સાથે રચનાત્મક ફેરફારો થાય છે (39, 40). તેથી, RC ના ઉત્ક્રાંતિ સંરક્ષણને ધ્યાનમાં લેતા, આ અગાઉ અવલોકન ન કરાયેલ બંધન પદ્ધતિ ઓક્સિજનયુક્ત ફોટોટ્રોફિક છોડમાં PSII RC ના QB સ્થળ પર પણ લાગુ પડી શકે છે.
Rps ΔpufW (લેબલ વગરનું pufW ડિલીશન) અને PufW-His (C-ટર્મિનલ 10x His-ટેગ્ડ પ્રોટીન-W કુદરતી pufW લોકસમાંથી વ્યક્ત થાય છે) સ્ટ્રેન. પેલુસ્ટ્રિસ CGA009 નું વર્ણન અમારા અગાઉના કાર્ય (16) માં કરવામાં આવ્યું હતું. આ સ્ટ્રેન અને આઇસોજેનિક વાઇલ્ડ-ટાઇપ પેરેન્ટને ફ્રીઝરમાંથી PYE (દરેક 5 ગ્રામ લિટર -1) (-80 °C પર LB માં સંગ્રહિત, જેમાં 50% (w/v) ગ્લિસરોલ) પ્રોટીન, યીસ્ટ અર્ક અને સક્સિનેટ) અગર [1.5% (w/v)] પ્લેટ પર થોડી સંખ્યામાં કોષોને સ્ટ્રીક કરીને મેળવવામાં આવ્યા હતા. પ્લેટને એનારોબિક પરિસ્થિતિઓમાં ઓરડાના તાપમાને અંધારામાં રાતોરાત ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવી હતી, અને પછી OSRAM 116-W હેલોજન બલ્બ (RS Components, UK) દ્વારા પૂરા પાડવામાં આવેલ સફેદ પ્રકાશ (~50 μmolm-2 s-1) થી 3 થી 5 દિવસ સુધી પ્રકાશિત કરવામાં આવી હતી જ્યાં સુધી એક પણ કોલોની દેખાય નહીં. એક જ કોલોનીનો ઉપયોગ 10 મિલી M22+ માધ્યમ (41) ને 0.1% (w/v) કેસામિનો એસિડ (ત્યારબાદ M22 તરીકે ઓળખવામાં આવશે) સાથે પૂરક બનાવવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. આ કલ્ચરને 34°C પર અંધારામાં 180 rpm પર 48 કલાક માટે ધ્રુજારી સાથે ઓછી ઓક્સિજનની સ્થિતિમાં ઉગાડવામાં આવ્યું હતું, અને પછી 70 મિલી કલ્ચરને 24 કલાક માટે સમાન પરિસ્થિતિઓમાં ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવ્યું હતું. 1 મિલીના જથ્થા સાથે અર્ધ-એરોબિક કલ્ચરનો ઉપયોગ 30 મિલી સાર્વત્રિક સ્ક્રુ-ટોપ પારદર્શક કાચની બોટલમાં 30 મિલી M22 માધ્યમને ઇનોક્યુલેટ કરવા માટે થાય છે અને જંતુરહિત ચુંબકીય બળ સ્ટિરિંગ સળિયા દ્વારા 48 કલાક માટે આંદોલન (~50μmolm-2 s-1) સાથે ઇરેડિયેટ કરવામાં આવે છે. પછી 30 મિલી કલ્ચરને તે જ પરિસ્થિતિઓમાં લગભગ 1 લિટર કલ્ચર સાથે ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવ્યું હતું, જેનો ઉપયોગ પછી ~200 μmolm-2 s-1 પર પ્રકાશિત લગભગ 9 લિટર કલ્ચરને 72 કલાક માટે ઇનોક્યુલેટ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. કોષોને 7132 RCF પર 30 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા કાપવામાં આવ્યા હતા, 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ના ~10 ml માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા, અને જરૂર પડે ત્યાં સુધી -20°C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા.
પીગળ્યા પછી, રિસસ્પેન્ડેડ કોષોમાં ડીઓક્સિરીબોન્યુક્લીઝ I (મર્ક, યુકે), લાઇસોઝાઇમ (મર્ક, યુકે) અને બે રોશ હોલોએન્ઝાઇમ પ્રોટીઝ ઇન્હિબિટર ગોળીઓ (મર્ક, યુકે) ના કેટલાક સ્ફટિકો ઉમેરો. 20,000 પીએસઆઇ ફ્રેન્ચ પ્રેશર સેલ (એમિન્કો, યુએસએ) માં, કોષો 8 થી 12 વખત વિક્ષેપિત થયા હતા. 4°C પર 15 મિનિટ માટે 18,500 RCF પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા અખંડ કોષો અને અદ્રાવ્ય કચરાને દૂર કર્યા પછી, પટલને 113,000 RCF પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા પિગમેન્ટેડ લાયસેટમાંથી 43,000°C પર 2 કલાક માટે અવક્ષેપિત કરવામાં આવ્યું હતું. દ્રાવ્ય અપૂર્ણાંક કાઢી નાખો અને રંગીન પટલને 100 થી 200 મિલી 20 mM ટ્રિસ-HCl (pH 8.0) માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરો અને જ્યાં સુધી કોઈ દૃશ્યમાન સમૂહ ન દેખાય ત્યાં સુધી એકરૂપ બનાવો. સસ્પેન્ડેડ મેમ્બ્રેનને 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (એનાટ્રેસ, યુએસએ) માં 2% (w/v) β-DDM ધરાવતા 4°C તાપમાને અંધારામાં 1 કલાક માટે હળવા હલાવતા ઉકાળવામાં આવ્યું હતું. પછી 70°C તાપમાને સેન્ટ્રીફ્યુજ કરીને 150,000 RCF ને 4°C તાપમાને 1 કલાક માટે ઓગાળીને અવશેષ અદ્રાવ્ય પદાર્થો દૂર કરવામાં આવ્યા હતા.
ΔpufW સ્ટ્રેનમાંથી દ્રાવ્ય પટલને 50 મિલી DEAE સેફારોઝ આયન એક્સચેન્જ કોલમ પર લાગુ કરવામાં આવ્યું હતું જેમાં ત્રણ કોલમ વોલ્યુમ (CV) બંધનકર્તા બફર [20 mM tris-HCl (pH 8.0) જેમાં 0.03% (w / v) β-DDM] હતા. બે CV બંધનકર્તા બફરો વડે સ્તંભને ધોઈ લો, અને પછી 50 mM NaCl ધરાવતા બે બંધનકર્તા બફરો વડે સ્તંભને ધોઈ લો. RC-LH116 કોમ્પ્લેક્સને 1.75 CV પર 150 થી 300 mM NaCl (બંધનકર્તા બફરમાં) ના રેખીય ઢાળ સાથે એલ્યુટ કરવામાં આવ્યું હતું, અને બાકીના બંધનકર્તા કોમ્પ્લેક્સને 0.5 CV પર 300 mM NaCl ધરાવતા બંધનકર્તા બફર વડે એલ્યુટ કરવામાં આવ્યું હતું. 250 અને 1000 nm વચ્ચે શોષણ સ્પેક્ટ્રમ એકત્રિત કરો, શોષકતા ગુણોત્તર (A880/A280) વાળા અપૂર્ણાંકને 880 થી 280 nm પર 1 કરતા વધારે રાખો, તેને બંધનકર્તા બફરમાં બે વાર પાતળો કરો, અને DEAE સ્તંભ શુદ્ધિકરણ પર ફરીથી તે જ પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરો. 1.7 કરતા વધારે A880/A280 ગુણોત્તર અને 3.0 કરતા વધારે A880/A805 ગુણોત્તર ધરાવતા અપૂર્ણાંકોને પાતળો કરો, આયન વિનિમયનો ત્રીજો રાઉન્ડ કરો, અને 2.2 કરતા વધારે A880/A280 ગુણોત્તર અને 5.0 કરતા વધારે A880/A805 ગુણોત્તર ધરાવતા અપૂર્ણાંકોને જાળવી રાખો. આંશિક રીતે શુદ્ધ કરાયેલા સંકુલને એમિકોન 100,000 મોલેક્યુલર વેઇટ કટ-ઓફ (MWCO) સેન્ટ્રીફ્યુગલ ફિલ્ટર (મર્ક, યુકે) માં ~2 મિલી સુધી કેન્દ્રિત કરવામાં આવ્યું હતું, અને 200 mM NaCl બફર ધરાવતા સુપરડેક્સ 200 16/600 કદના એક્સક્લુઝન કોલમ (GE હેલ્થકેર, યુએસ) પર લોડ કરવામાં આવ્યું હતું, અને પછી તે જ બફરમાં 1.5 CV પર એલ્યુટ કરવામાં આવ્યું હતું. કદ એક્સક્લુઝન અપૂર્ણાંકના શોષણ સ્પેક્ટ્રા એકત્રિત કરો, અને શોષણ સ્પેક્ટ્રાને 2.4 થી વધુ A880/A280 ગુણોત્તર અને 5.8 થી 100 A880 થી વધુ A880/A805 ગુણોત્તર સાથે કેન્દ્રિત કરો, અને તરત જ તેનો ઉપયોગ ક્રાયો-TEM ગ્રીડ તૈયારી અથવા સંગ્રહ માટે કરો જ્યાં સુધી જરૂર ન પડે ત્યાં સુધી -80°C પર રાખો.
PufW-His સ્ટ્રેનમાંથી દ્રાવ્ય પટલને IMAC બફર (GE હેલ્થકેર) માં 20 મિલી HisPrep FF Ni-NTA Sepharose કોલમ (20 mM tris-HCl (pH 8.0) જેમાં 200 mM NaCl અને 0.03% (w/w)) હોય છે, પર લાગુ કરવામાં આવ્યું હતું. કોલમને IMAC બફરના પાંચ CVs સાથે ધોવામાં આવ્યો હતો, અને પછી 10 mM હિસ્ટીડાઇન ધરાવતા IMAC બફરના પાંચ CVs સાથે. કોર કોમ્પ્લેક્સને 100 mM હિસ્ટીડાઇન ધરાવતા પાંચ IMAC બફર સાથે કોલમમાંથી બહાર કાઢવામાં આવ્યું હતું. RC-LH114-W કોમ્પ્લેક્સ ધરાવતા અપૂર્ણાંકને Amicon 100,000 MWCO ફિલ્ટર (Merck, UK) થી સજ્જ સ્ટ્રાઇડ ટાંકીમાં ~10 ml સુધી કેન્દ્રિત કરવામાં આવે છે, બંધનકર્તા બફર સાથે 20 વખત પાતળું કરવામાં આવે છે, અને પછી 25 ml માં ઉમેરવામાં આવે છે. DEAE Sepharose કોલમમાં, બફર સાથે જોડાયેલા ચાર CVs અગાઉથી ઉપયોગમાં લેવાય છે. ચાર CV બાઈન્ડિંગ બફર્સથી કોલમને ધોઈ લો, પછી 0 થી 100 mM NaCl (બાઈન્ડિંગ બફરમાં) ના રેખીય ગ્રેડિયન્ટ પર આઠ CV પર કોમ્પ્લેક્સને એલ્યુટ કરો, અને બાકીના ચાર CV જેમાં 100 mM બાઈન્ડિંગ બફર હોય. 2.4 કરતા વધારે A880/A280 રેશિયો અને 4.6 કરતા વધારે A880/A805 રેશિયો સાથે સોડિયમ ક્લોરાઇડ પર એલ્યુટ થયેલા શેષ કોમ્પ્લેક્સને Amicon 100,000 MWCO સેન્ટ્રીફ્યુગલ ફિલ્ટરમાં ~2 મિલી સુધી કેન્દ્રિત કરવામાં આવ્યા હતા, અને અગાઉથી 1.5 CV IMAC થી ભરવામાં આવ્યા હતા. બફરને સંતુલિત સુપરડેક્સ 200 16/600 કદના બાકાત સ્તંભમાં, અને પછી 1.5 CV થી વધુ સમાન બફરમાં એલ્યુટ કરવામાં આવ્યા હતા. કદ-બાકાત અપૂર્ણાંકોના શોષણ સ્પેક્ટ્રા એકત્રિત કરો અને શોષણ સ્પેક્ટ્રાને 2.1 થી વધુ A880/A280 ગુણોત્તર અને 4.6 થી 100 A880 થી વધુ A880/A805 ગુણોત્તર સાથે કેન્દ્રિત કરો, જેનો ઉપયોગ તરત જ સ્થિર TEM ગ્રીડ તૈયારી માટે થાય છે અથવા જરૂર પડે ત્યાં સુધી -80°C પર સંગ્રહિત થાય છે.
નીચા તાપમાનવાળા TEM ગ્રીડ તૈયાર કરવા માટે Leica EM GP ઇમર્સન ફ્રીઝરનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. કોમ્પ્લેક્સને IMAC બફરમાં 50 ના A880 પર પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું, અને પછી 5μl ને નવા ગ્લો-ડિસ્ચાર્જ્ડ QUANTIFOIL 1.2/1.3 કાર્બન-કોટેડ કોપર મેશ (Agar Scientific, UK) પર લોડ કરવામાં આવ્યું હતું. ગ્રીડને 20°C અને 60% સંબંધિત ભેજ પર 30 સેકન્ડ માટે ઇન્ક્યુબ કરો, પછી તેને 3 સેકન્ડ માટે સૂકવો, અને પછી તેને -176°C પર પ્રવાહી ઇથેનમાં શાંત કરો.
RC-LH114-W સંકુલનો ડેટા eBIC (ઇલેક્ટ્રોનિક બાયોઇમેજિંગ સેન્ટર) (બ્રિટિશ ડાયમંડ લાઇટ સોર્સ) પર ટાઇટન ક્રિઓસ માઇક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ કરીને રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યો હતો, જે 300kV ના પ્રવેગક વોલ્ટેજ પર કામ કરે છે, જે 130,000× ના ​​નજીવા મેગ્નિફિકેશન અને 20 eV ના ગેપ પસંદ કરો ની ઉર્જા ધરાવે છે. ડેટા એકત્રિત કરવા માટે ગણતરી મોડમાં છબીઓ રેકોર્ડ કરવા માટે K2 પીક ડિટેક્ટર સાથે ગેટન 968 GIF ક્વોન્ટમનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. કેલિબ્રેટેડ પિક્સેલ કદ 1.048Å છે, અને ડોઝ રેટ 3.83 e-Å-2s-1 છે. 11 સેકન્ડમાં મૂવી એકત્રિત કરી અને તેને 40 ભાગોમાં વિભાજીત કરી. માઇક્રોસ્કોપને ફરીથી ફોકસ કરવા માટે કાર્બન-કોટેડ વિસ્તારનો ઉપયોગ કરો, અને પછી દરેક છિદ્રમાં ત્રણ મૂવી એકત્રિત કરો. કુલ, 3130 મૂવી એકત્રિત કરવામાં આવી હતી, જેમાં -1 અને -3μm વચ્ચે ડિફોકસ મૂલ્યો હતા.
RC-LH116 સંકુલ માટેનો ડેટા એસ્ટરબરી બાયોસ્ટ્રક્ચર લેબોરેટરી (યુનિવર્સિટી ઓફ લીડ્સ, યુકે) ખાતે સમાન માઇક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ કરીને એકત્રિત કરવામાં આવ્યો હતો. ડેટા 130 k ના મેગ્નિફિકેશન સાથે ગણતરી મોડમાં એકત્રિત કરવામાં આવ્યો હતો, અને પિક્સેલ કદને 4.6 e-Å-2s-1 ની માત્રા સાથે 1.065 Å પર માપાંકિત કરવામાં આવ્યું હતું. મૂવી 12 સેકન્ડમાં રેકોર્ડ કરવામાં આવી હતી અને 48 ભાગોમાં વિભાજિત કરવામાં આવી હતી. કુલ, 3359 ફિલ્મો એકત્રિત કરવામાં આવી હતી, જેમાં -1 અને -3μm વચ્ચે ડિફોકસ મૂલ્યો હતા.
બધા ડેટા પ્રોસેસિંગ Relion 3.0 પાઇપલાઇન (42) માં કરવામાં આવે છે. ડોઝ વેઇટિંગ દ્વારા બીમ ગતિને સુધારવા માટે Motioncorr 2 (43) નો ઉપયોગ કરો, અને પછી CTF (કોન્ટ્રાસ્ટ ટ્રાન્સફર ફંક્શન) પરિમાણ નક્કી કરવા માટે CTFFIND 4.1 (44) નો ઉપયોગ કરો. આ પ્રારંભિક પ્રક્રિયા તબક્કાઓ પછી લાક્ષણિક ફોટોમાઇક્રોગ્રાફ્સ આકૃતિ 2. S16 માં બતાવવામાં આવ્યા છે. સ્વચાલિત પસંદગી ટેમ્પલેટ 250-પિક્સેલ ફ્રેમમાં 1000 કણોના લગભગ 250 પિક્સેલ્સને મેન્યુઅલી પસંદ કરીને અને કોઈ સંદર્ભ દ્વિ-પરિમાણીય (2D) વર્ગીકરણ વિના જનરેટ થાય છે, જેનાથી તે વર્ગીકરણોને નકારી કાઢવામાં આવે છે જે નમૂના દૂષણને પૂર્ણ કરે છે અથવા કોઈ સ્પષ્ટ લાક્ષણિકતાઓ ધરાવતા નથી. પછી, બધા માઇક્રોફોટોગ્રાફ્સ પર સ્વચાલિત પસંદગી કરવામાં આવી હતી, અને RC-LH114-W 849,359 કણો હતા, અને RC-LH116 સંકુલ 476,547 કણો હતા. બધા પસંદ કરેલા કણો બિન-સંદર્ભ 2D વર્ગીકરણના બે રાઉન્ડમાંથી પસાર થયા છે, અને દરેક રન પછી, કાર્બન ક્ષેત્ર, નમૂના દૂષણ, કોઈ સ્પષ્ટ લક્ષણો અથવા મજબૂત રીતે ઓવરલેપિંગ કણોને પૂર્ણ કરતા કણોને નકારવામાં આવે છે, જેના પરિણામે RC-LH114-W અને RC-LH116 ના 3D વર્ગીકરણ માટે અનુક્રમે 772,033 (90.9%) અને 359,678 (75.5%) કણોનો ઉપયોગ થાય છે. પ્રારંભિક 3D સંદર્ભ મોડેલ સ્ટોકેસ્ટિક ગ્રેડિયન્ટ ડિસેન્ટ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને જનરેટ કરવામાં આવ્યું હતું. પ્રારંભિક મોડેલનો સંદર્ભ તરીકે ઉપયોગ કરીને, પસંદ કરેલા કણોને 3D માં ચાર શ્રેણીઓમાં વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યા છે. સંદર્ભ તરીકે આ શ્રેણીમાં મોડેલનો ઉપયોગ કરીને, સૌથી મોટી શ્રેણીમાં કણો પર 3D રિફાઇનિંગ કરો, પછી દ્રાવક ક્ષેત્રને આવરી લેવા માટે પ્રારંભિક 15Å લો-પાસ ફિલ્ટરનો ઉપયોગ કરો, સોફ્ટ એજના 6 પિક્સેલ્સ ઉમેરો, અને ટોચના ડિટેક્ટરના Gatan K2 પીક મોડ્યુલેશન ટ્રાન્સફર ફંક્શનને સુધારવા માટે પિક્સેલ્સને પોસ્ટ-પ્રોસેસ કરો. RC-LH114-W ડેટાસેટ માટે, આ પ્રારંભિક મોડેલને માસ્કની કિનારીઓ પર મજબૂત ઘનતા દૂર કરીને સંશોધિત કરવામાં આવ્યું હતું (UCSF Chimera માં કોર કોમ્પ્લેક્સ ઘનતાથી ડિસ્કનેક્ટ થયેલ). પરિણામી મોડેલો (RC-LH114-W અને RC-LH116 ના રિઝોલ્યુશન અનુક્રમે 3.91 અને 4.16 Å છે) નો ઉપયોગ 3D વર્ગીકરણના બીજા રાઉન્ડ માટે સંદર્ભ તરીકે થાય છે. ઉપયોગમાં લેવાતા કણોને પ્રારંભિક 3D વર્ગમાં જૂથબદ્ધ કરવામાં આવ્યા છે અને તેમાં પડોશ સાથે મજબૂત સહસંબંધ નથી. ઓવરલેપ અથવા સ્પષ્ટ માળખાકીય સુવિધાઓનો અભાવ. 3D વર્ગીકરણના બીજા રાઉન્ડ પછી, સૌથી વધુ રિઝોલ્યુશન ધરાવતી શ્રેણી પસંદ કરવામાં આવી હતી [RC-LH114-W માટે, એક શ્રેણી 377,703 કણો (44.5%) છે, RC-LH116 માટે, બે શ્રેણીઓ છે, કુલ 260,752 કણો (54.7%) છે, જ્યાં તેઓ ફક્ત ત્યારે જ સમાન હોય છે જ્યારે પ્રારંભિક પરિભ્રમણ પછી નાના તફાવત સાથે ગોઠવાયેલ હોય]. પસંદ કરેલા કણોને 400-પિક્સેલ બોક્સમાં ફરીથી કાઢવામાં આવે છે અને 3D રિફાઇનિંગ દ્વારા રિફાઇન કરવામાં આવે છે. સોલવન્ટ માસ્ક પ્રારંભિક 15Å લો-પાસ ફિલ્ટર, 3 પિક્સેલ મેપ વિસ્તરણ અને 3 પિક્સેલ સોફ્ટ માસ્કનો ઉપયોગ કરીને જનરેટ થાય છે. પરિણામી ટેક્સચરને વધુ રિફાઇન કરવા માટે દરેક પગલા પછી પ્રતિ-કણ CTF રિફાઇનમેન્ટ, પ્રતિ-કણ ગતિ સુધારણા અને પ્રતિ-કણ CTF રિફાઇનમેન્ટનો બીજો રાઉન્ડ, 3D રિફાઇનમેન્ટ, સોલવન્ટ માસ્કિંગ અને પોસ્ટ-પ્રોસેસિંગ કરવામાં આવે છે. 0.143 ના FSC (ફુરિયર શેલ કોરિલેશન કોફિશિયન) કટ-ઓફ મૂલ્યનો ઉપયોગ કરીને, RC-LH114-W અને RC-LH116 ના અંતિમ મોડેલોના રિઝોલ્યુશન અનુક્રમે 2.65 અને 2.80Å છે. અંતિમ મોડેલનો FSC વળાંક આકૃતિ 2. S17 માં બતાવવામાં આવ્યો છે.
બધા પ્રોટીન સિક્વન્સ UniProtKB પરથી ડાઉનલોડ કરવામાં આવ્યા છે: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); પ્રોટીન-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) નો ઉપયોગ RC ના હોમોલોજી મોડેલ બનાવવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો, જેમાં RC-L, RC-M અને RC-H ના પ્રોટીન સિક્વન્સ અને Rba નું સ્ફટિક માળખું શામેલ છે. sphaeroides RC નો ઉપયોગ ટેમ્પલેટ (PDB ID: 5LSE) (46) તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. જનરેટ કરેલા મોડેલને નકશામાં ફિટ કરવા માટે UCSF Chimera માં "ફિટ મેપ" ટૂલનો ઉપયોગ કરો (47), પ્રોટીન માળખું સુધારો, અને કોફેક્ટર [4×BChl a (મોનોમર લાઇબ્રેરી અવશેષ નામ = BCL), 2×BPh a (BPH), એક અથવા બે પ્રકારના UQ10 (U10), એક નોન-હીમ આયર્ન (Fe) અને એક 3,4-ડાયહાઇડ્રોહેક્સાકાર્બોનિલકોલાઇન (QAK)] ઉમેરવા માટે Coot (48) નો ઉપયોગ કરો. મોનોમર લાઇબ્રેરીમાં QAK ઉપલબ્ધ ન હોવાથી, તેને PHENIX (49) માં eLBOW ટૂલનો ઉપયોગ કરીને પેરામીટરાઇઝ કરવામાં આવ્યું હતું.
આગળ, LH1 સબયુનિટ બનાવવામાં આવ્યું. શરૂઆતમાં, PHENIX (49) માં ઓટોમેટિક કન્સ્ટ્રક્શન ટૂલનો ઉપયોગ નકશા અને LH1-α અને LH1-β પ્રોટીન સિક્વન્સનો ઉપયોગ ઇનપુટ તરીકે કરીને LH1 સિક્વન્સનો ભાગ આપમેળે બનાવવા માટે કરવામાં આવતો હતો. સૌથી સંપૂર્ણ LH1 સબયુનિટ પસંદ કરો, તેને બહાર કાઢો અને તેને Coot માં લોડ કરો, તેમાં ખૂટતો ક્રમ મેન્યુઅલી ઉમેરો, અને બે BCls a (BCL) અને સ્પિરિલોક્સાન્થિન (CRT) ઉમેરતા પહેલા સમગ્ર માળખાને મેન્યુઅલી રિફાઇન કરો [સંબંધિત Rps અનુસાર LH1 સંકુલની ઘનતા અને જાણીતી કેરોટીનોઇડ સામગ્રી. પ્રજાતિઓ (17)]. સંપૂર્ણ LH1 સબયુનિટની નકલ કરો, અને UCSF કાઇમરા "ડોકિંગ મેપ ટૂલ" નો ઉપયોગ LH1 ઘનતાના નજીકના નોન-મોડેલ વિસ્તારમાં ડોક કરવા માટે કરો, અને પછી તેને Coot માં રિફાઇન કરો; જ્યાં સુધી બધા LH1 સબયુનિટ્સ મોડેલ ન થાય ત્યાં સુધી પ્રક્રિયાને પુનરાવર્તિત કરો. RC-LH114-W સ્ટ્રક્ચર માટે, Coot માં ફાળવેલ ન હોય તેવી ઘનતા કાઢીને, પ્રોટીનને USCF Chimera નકશામાં બાકીના બિન-પ્રોટીન ઘટકોમાંથી વિભાજિત કરવામાં આવે છે અને ઓટોબિલ્ડ ટૂલનો ઉપયોગ પ્રારંભિક મોડેલ અને બાકીના સબયુનિટ્સ (પ્રોટીન-W) મોડેલિંગ સ્થાપિત કરવા માટે થાય છે. PHENIX (49) માં. Coot (48) માં પરિણામી મોડેલમાં કોઈપણ ખૂટતા સિક્વન્સ ઉમેરો, અને પછી સમગ્ર સબયુનિટને મેન્યુઅલી રિફાઇન કરો. બાકીની ફાળવેલ ન હોય તેવી ઘનતા લિપિડ્સ (CDL = CDL, POPC = 6PL અને POPG = PGT ની PDB મોનોમર લાઇબ્રેરી ID), β-DDM ડિટર્જન્ટ (LMT) અને UQ10 અણુઓ (U10) ના સંયોજનને બંધબેસે છે. મોડેલ આંકડા અને ફિટની દ્રશ્ય ગુણવત્તામાં વધુ સુધારો ન થાય ત્યાં સુધી સંપૂર્ણ પ્રારંભિક મોડેલને પૂર્ણ કરવા માટે Coot (48) માં PHENIX ઑપ્ટિમાઇઝેશન (49) અને મેન્યુઅલ ઑપ્ટિમાઇઝેશનનો ઉપયોગ કરો. છેલ્લે, સ્થાનિક નકશાને શાર્પ કરવા માટે LocScale (50) નો ઉપયોગ કરો, અને પછી ફાળવેલ ન હોય તેવી ઘનતા અને સ્વચાલિત અને મેન્યુઅલ ઑપ્ટિમાઇઝેશનના મોડેલિંગના અન્ય ઘણા ચક્રો કરો.
સંબંધિત પેપ્ટાઇડ્સ, કોફેક્ટર્સ અને અન્ય લિપિડ્સ અને ક્વિનોન્સ તેમની સંબંધિત ઘનતામાં ડોક કરેલા છે. આકૃતિ 1 અને 2 માં દર્શાવેલ છે. S18 થી S23. અંતિમ મોડેલની આંકડાકીય માહિતી કોષ્ટક S1 માં દર્શાવેલ છે.
જ્યાં સુધી અન્યથા ઉલ્લેખિત ન હોય ત્યાં સુધી, UV/Vis/NIR શોષણ સ્પેક્ટ્રા Cary60 સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર (એજિલેન્ટ, યુએસએ) પર 250 nm થી 1000 nm ના 1 nm અંતરાલ અને 0.1s ના એકીકરણ સમય પર એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા.
નમૂનાને ક્વાર્ટઝ ક્યુવેટમાં 2 મીમી પાથ સાથે 1 ના A880 સુધી પાતળું કરો, અને 400 અને 1000 nm વચ્ચે શોષણ સ્પેક્ટ્રમ એકત્રિત કરો. ગોળાકાર ડાયક્રોઇક સ્પેક્ટ્રાને Jasco 810 સ્પેક્ટ્રોપોલેરીમીટર (Jasco, જાપાન) પર 400 nm અને 950 nm વચ્ચે 1 nm અંતરાલ પર 20 nm મિનિટ-1 ના સ્કેન દરે એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા.
મોલર લુપ્તતા ગુણાંક કોર કોમ્પ્લેક્સને આશરે 50 ના A880 સુધી પાતળું કરીને નક્કી કરવામાં આવે છે. 990μl બંધનકર્તા બફર અથવા મિથેનોલમાં 10μl વોલ્યુમને પાતળું કરો, અને BChl અધોગતિ ઘટાડવા માટે તરત જ શોષણ સ્પેક્ટ્રમ એકત્રિત કરો. દરેક મિથેનોલ નમૂનાની BChl સામગ્રીની ગણતરી 54.8 mM-1 cm-1 ના 771 nm પર લુપ્તતા ગુણાંક દ્વારા કરવામાં આવી હતી, અને લુપ્તતા ગુણાંક નક્કી કરવામાં આવ્યો હતો (51). કોર કોમ્પ્લેક્સ સાંદ્રતા નક્કી કરવા માટે માપેલ BChl સાંદ્રતાને 32 (RC-LH114-W) અથવા 36 (RC-LH116) દ્વારા વિભાજીત કરો, જેનો ઉપયોગ પછી બફર લુપ્તતા ગુણાંકમાં એકત્રિત કરેલા સમાન નમૂનાના શોષણ સ્પેક્ટ્રમ નક્કી કરવા માટે થાય છે. સમાંતર. દરેક નમૂના માટે ત્રણ પુનરાવર્તિત માપ લેવામાં આવ્યા હતા, અને ગણતરી માટે BChl Qy મહત્તમ સરેરાશ શોષણનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. 878 nm પર માપવામાં આવેલ RC-LH114-W નો લુપ્તતા ગુણાંક 3280±140 mM-1 cm-1 છે, જ્યારે 880 nm પર માપવામાં આવેલ RC-LH116 નો લુપ્તતા ગુણાંક 3800±30 mM-1 cm-1 છે.
(52) માં આપેલી પદ્ધતિ અનુસાર UQ10 નું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, એજિલેન્ટ 1200 HPLC સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને રિવર્સ ફેઝ HPLC (RP-HPLC) કરવામાં આવ્યું હતું. 0.02% (w/v) ફેરિક ક્લોરાઇડ ધરાવતા 50μl 50:50 મિથેનોલ: ક્લોરોફોર્મમાં RC-LH116 અથવા RC-LH114-W ના લગભગ 0.02 nmol ને ઓગાળો, અને પૂર્વ-સંતુલિત બેકમેન કુલ્ટર અલ્ટ્રાસ્ફિયર ODS 4.6 mm ને 1 ml-1 min-1 માં 40°C પર HPLC દ્રાવક (80:20 મિથેનોલ:2-પ્રોપેનોલ) માં ×25 સેમી કોલમ પર ઇન્જેક્ટ કરો. 275 nm (UQ10), 450 nm (કેરોટીનોઇડ્સ) અને 780 nm (BChl) પર શોષણનું નિરીક્ષણ કરવા માટે HPLC દ્રાવકમાં 1 કલાક માટે આઇસોક્રેટિક એલ્યુશન કરો. ૨૭૫ nm ક્રોમેટોગ્રામમાં ૨૫.૫ મિનિટે ટોચ સંકલિત કરવામાં આવી હતી, જેમાં અન્ય કોઈ શોધી શકાય તેવા સંયોજનો નહોતા. સંકલિત ક્ષેત્રનો ઉપયોગ ૦ થી ૫.૮ nmol (આકૃતિ S14) ના શુદ્ધ ધોરણોના ઇન્જેક્શનથી ગણતરી કરાયેલ કેલિબ્રેશન વળાંકના સંદર્ભમાં કાઢવામાં આવેલા UQ10 ના દાઢ જથ્થાની ગણતરી કરવા માટે થાય છે. દરેક નમૂનાનું ત્રણ પ્રતિકૃતિઓમાં વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું, અને નોંધાયેલ ભૂલ સરેરાશના SD ને અનુરૂપ હતી.
0.1 ના મહત્તમ Qy શોષણ સાથે RC-LH1 સંકુલ ધરાવતું દ્રાવણ 30 μM ઘટાડેલા ઘોડાના હૃદય સાયટોક્રોમ c2 (મર્ક, યુકે) અને 0 થી 50 μMUQ2 (મર્ક, યુકે) સાથે તૈયાર કરવામાં આવ્યું હતું. દરેક UQ2 સાંદ્રતા પર ત્રણ 1-મિલી નમૂનાઓ તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા અને માપન પહેલાં અંધારામાં સંપૂર્ણ અનુકૂલન સુનિશ્ચિત કરવા માટે 4°C પર અંધારામાં રાતોરાત ઉકાળવામાં આવ્યા હતા. દ્રાવણને 300 nm ફ્લેમ/500 લાઇન ગ્રેટિંગ, 1.24 mm ઇનલેટ, 0.12 mm મધ્યમ અને 0.6 mm આઉટલેટ સ્લિટ્સથી સજ્જ OLIS RSM1000 મોડ્યુલર સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટરમાં લોડ કરવામાં આવ્યું હતું. ઉત્તેજના પ્રકાશને બાકાત રાખવા માટે નમૂના ફોટોટ્યુબ અને સંદર્ભ ફોટોમલ્ટિપ્લાયર ટ્યુબના પ્રવેશદ્વાર પર 600 nm લાંબો પાસ ફિલ્ટર મૂકવામાં આવ્યો છે. 0.15 સેકન્ડના એકીકરણ સમય સાથે શોષણનું નિરીક્ષણ 550 nm પર કરવામાં આવ્યું હતું. ઉત્તેજના પ્રકાશ 880 nm M880F2 LED (લાઇટ એમિટિંગ ડાયોડ) (થોરલેબ્સ લિમિટેડ, યુકે) માંથી 90% તીવ્રતા પર ફાઇબર ઓપ્ટિક કેબલ દ્વારા DC2200 કંટ્રોલર (થોરલેબ્સ લિમિટેડ, યુકે) દ્વારા ઉત્સર્જિત થાય છે અને 90° ના ખૂણા પર પ્રકાશ સ્ત્રોતમાં ઉત્સર્જિત થાય છે. માપન બીમ અરીસાની વિરુદ્ધ છે જેથી નમૂના દ્વારા શરૂઆતમાં શોષાયેલ ન હોય તેવા કોઈપણ પ્રકાશને પરત કરી શકાય. 50 સેકન્ડના પ્રકાશ પહેલા 10 સેકન્ડ પહેલાં શોષણનું નિરીક્ષણ કરો. પછી શોષણનું વધુ નિરીક્ષણ અંધારામાં 60 સેકન્ડ માટે કરવામાં આવ્યું જેથી ક્વિનોલોલ સ્વયંભૂ સાયટોક્રોમ c23 + કેટલી હદ સુધી ઘટાડે છે તેનું મૂલ્યાંકન કરી શકાય (કાચા ડેટા માટે આકૃતિ S8 જુઓ).
ડેટાને 0.5 થી 10 સેકન્ડ (UQ2 સાંદ્રતા પર આધાર રાખીને) ની અંદર એક રેખીય પ્રારંભિક દર ફિટ કરીને અને દરેક UQ2 સાંદ્રતા પર ત્રણેય નમૂનાઓના દર સરેરાશ કરીને પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી. સંબંધિત લુપ્તતા ગુણાંક દ્વારા ગણતરી કરાયેલ RC-LH1 સાંદ્રતાનો ઉપયોગ દરને ઉત્પ્રેરક કાર્યક્ષમતામાં રૂપાંતરિત કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો, જે ઓરિજિન પ્રો 2019 (ઓરિજિનલેબ, યુએસએ) માં પ્લોટ કરવામાં આવ્યો હતો, અને સ્પષ્ટ Km અને Kcat મૂલ્યો નક્કી કરવા માટે માઇકલિસ-મેન્ટેન મોડેલમાં ફીટ કરવામાં આવ્યો હતો.
ક્ષણિક શોષણ માપન માટે, RC-LH1 નમૂનાને IMAC બફરમાં ~2μM સુધી પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું જેમાં 50 mM સોડિયમ એસ્કોર્બેટ (મર્ક, યુએસએ) અને 0.4 mM ટર્બ્યુટિન (મર્ક, યુએસએ) હતું. એસ્કોર્બિક એસિડનો ઉપયોગ બલિદાન ઇલેક્ટ્રોન દાતા તરીકે થાય છે, અને માપન પ્રક્રિયા દરમિયાન મુખ્ય RC દાતા ઓછો રહે (એટલે ​​કે, ફોટોઓક્સિડાઇઝ્ડ ન હોય) તેની ખાતરી કરવા માટે tert-butaclofen નો ઉપયોગ QB અવરોધક તરીકે થાય છે. લેસર પાથમાં નમૂનામાં ઉત્તેજના કઠોળ વચ્ચે શ્યામ અનુકૂલન માટે પૂરતો સમય હોય તેની ખાતરી કરવા માટે 2 mm ઓપ્ટિકલ પાથ લંબાઈ સાથે કસ્ટમ રોટેટિંગ સેલ (લગભગ 0.1 મીટર વ્યાસ, 350 RPM) માં આશરે 3 મિલી નમૂના ઉમેરવામાં આવે છે. Ti: સેફાયર લેસર સિસ્ટમ (સ્પેક્ટ્રા ફિઝિક્સ, યુએસએ) ને વિસ્તૃત કરવા માટે ~100-fs લેસર પલ્સનો ઉપયોગ કરો જેથી નમૂનાને 1 kHz (NIR માટે 20 nJ અથવા Vis માટે 100 nJ) ના પુનરાવર્તન દરે 880 nm પર ઉત્તેજિત કરી શકાય. ડેટા એકત્રિત કરતા પહેલા, નમૂનાને લગભગ 30 મિનિટ માટે ઉત્તેજના પ્રકાશમાં મૂકો. એક્સપોઝર QA નિષ્ક્રિયતાનું કારણ બનશે (કદાચ એક કે બે વાર QA ઘટાડશે). પરંતુ કૃપા કરીને નોંધ લો કે આ પ્રક્રિયા ઉલટાવી શકાય તેવી છે કારણ કે લાંબા સમય સુધી શ્યામ અનુકૂલન પછી, RC ધીમે ધીમે QA પ્રવૃત્તિમાં પાછું આવશે. -10 થી 7000 ps ના વિલંબ સમય સાથે ક્ષણિક સ્પેક્ટ્રા માપવા માટે હેલિઓસ સ્પેક્ટ્રોમીટર (અલ્ટ્રાફાસ્ટ સિસ્ટમ્સ, યુએસએ) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. ડેટા સેટ્સને અનગ્રુપ કરવા, પછી મર્જ કરવા અને માનક બનાવવા માટે સરફેસ એક્સપ્લોરર સોફ્ટવેર (અલ્ટ્રાફાસ્ટ સિસ્ટમ્સ, યુએસએ) નો ઉપયોગ કરો. સડો સંબંધિત વિભેદક સ્પેક્ટ્રા મેળવવા માટે સંયુક્ત ડેટા સેટનો ઉપયોગ કરવા માટે કાર્પેટવ્યૂ સોફ્ટવેર પેકેજ (લાઇટ કન્વર્ઝન લિમિટેડ, લિથુઆનિયા) નો ઉપયોગ કરો, અથવા એવા ફંક્શનનો ઉપયોગ કરો જે ઓરિજિન (ઓરિજિનલેબ, યુએસએ) માં સિંગલ-વેવલન્થ સ્પેક્ટ્રલ ઇવોલ્યુશનને ફિટ કરવા માટે ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ પ્રતિભાવ સાથે બહુવિધ ઘાતાંકોને સમાવિષ્ટ કરે છે.
ઉપર જણાવ્યા મુજબ (53), RC અને પેરિફેરલ LH2 એન્ટેના બંનેનો અભાવ ધરાવતી LH1 કોમ્પ્લેક્સ ધરાવતી પ્રકાશસંશ્લેષણ ફિલ્મ તૈયાર કરવામાં આવી હતી. પટલને 20 mM ટ્રિસ (pH 8.0) માં પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું અને પછી 2 mm ઓપ્ટિકલ પાથ સાથે ક્વાર્ટઝ ક્યુવેટમાં લોડ કરવામાં આવ્યું હતું. -10 થી 7000 ps ના વિલંબ સમય સાથે 540 nm પર નમૂનાને ઉત્તેજિત કરવા માટે 30nJ લેસર પલ્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. Rps. pal નમૂના માટે વર્ણવ્યા મુજબ ડેટા સેટ પર પ્રક્રિયા કરો.
આ પટલને 150,000 RCF પર 4°C પર 2 કલાક માટે સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા પેલેટ કરવામાં આવ્યું હતું, અને પછી 880 nm પર તેનું શોષણ 20 mM tris-HCl (pH 8.0) અને 200 mM NaCl માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યું હતું. 4°C પર અંધારામાં 1 કલાક માટે 2% (w/v) β-DDM માં ધીમે ધીમે હલાવીને પટલને ઓગાળો. નમૂનાને 100 mM ટ્રાયઇથિલેમોનિયમ કાર્બોનેટ (pH 8.0) (TEAB; મર્ક, યુકે) માં 2.5 મિલિગ્રામ ml-1 (બાયો-રેડ વિશ્લેષણ) ની પ્રોટીન સાંદ્રતા સુધી પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું. આગળની પ્રક્રિયા અગાઉ પ્રકાશિત પદ્ધતિ (54) થી હાથ ધરવામાં આવી હતી, જેમાં 50 μg પ્રોટીનને 1% (w/v) સોડિયમ લૌરેટ (મર્ક, યુકે) ધરાવતા કુલ 50 μl TEAB માં મંદ કરીને શરૂ કરવામાં આવ્યું હતું. 60 સેકન્ડ માટે સોનિકેશન પછી, તેને 37°C પર 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) સાથે 30 મિનિટ માટે ઘટાડવામાં આવ્યું. S-alkylation માટે, નમૂનાને 10 mM મિથાઈલ S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) સાથે ઇન્ક્યુબેટ કરો અને તેને 200 mM આઇસોપ્રોપેનોલ સ્ટોક સોલ્યુશનમાંથી ઓરડાના તાપમાને 10 મિનિટ માટે ઉમેરો. 2 μg ટ્રિપ્સિન/એન્ડોપ્રોટીનેઝ Lys-C મિશ્રણ (પ્રોમેગા UK) ઉમેરીને પ્રોટીઓલિટીક પાચન હાથ ધરવામાં આવ્યું હતું અને 37°C પર 3 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું હતું. 50 μl ઇથિલ એસિટેટ અને 10 μl 10% (v/v) LC ગ્રેડ ટ્રાઇફ્લોરોએસેટિક એસિડ (TFA; થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, UK) ઉમેરીને અને 60 સેકન્ડ માટે વર્ટેક્સિંગ કરીને લૌરેટ સર્ફેક્ટન્ટ કાઢવામાં આવ્યું હતું. 15,700 RCF પર 5 મિનિટ માટે સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા તબક્કાના વિભાજનને પ્રોત્સાહન આપવામાં આવ્યું હતું. ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ મુજબ, પેપ્ટાઇડ ધરાવતા નીચલા તબક્કાને કાળજીપૂર્વક એસ્પિરેટ અને ડિસોલ્ટ કરવા માટે C18 સ્પિન કોલમ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, યુકે) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. વેક્યુમ સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા સૂકાયા પછી, નમૂનાને 0.5% TFA અને 3% એસિટોનાઇટ્રાઇલમાં ઓગાળવામાં આવ્યો હતો, અને 500 ng નું વિશ્લેષણ નેનોફ્લો RP ક્રોમેટોગ્રાફી દ્વારા કરવામાં આવ્યું હતું, જે અગાઉ વિગતવાર સિસ્ટમ પરિમાણોનો ઉપયોગ કરીને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી સાથે જોડાયેલું હતું.
Rps. palustris proteome ડેટાબેઝ (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) શોધવા માટે પ્રોટીન ઓળખ અને જથ્થાત્મકતા માટે MaxQuant v.1.5.3.30 (56) નો ઉપયોગ કરો. માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી પ્રોટીઓમિક્સ ડેટા PRIDE પાર્ટનર રિપોઝીટરી (http://proteomecentral.proteomexchange.org) દ્વારા ડેટાસેટ ઓળખકર્તા PXD020402 હેઠળ ProteomeXchange એલાયન્સમાં જમા કરવામાં આવ્યો છે.
ઇલેક્ટ્રોસ્પ્રે આયનાઇઝેશન માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી સાથે RPLC દ્વારા વિશ્લેષણ માટે, RC-LH1 સંકુલ જંગલી-પ્રકારના Rps માંથી તૈયાર કરવામાં આવ્યું હતું. અગાઉ પ્રકાશિત પદ્ધતિ (16) નો ઉપયોગ કરીને, પેલુસ્ટ્રિસ કોષોમાં ઉત્પાદિત પ્રોટીન સાંદ્રતા 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl અને 0.03% (w/v) β- (બાયો-રેડ વિશ્લેષણ)) DDM માં 2 mg ml-1 હતી. ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ મુજબ, વરસાદ પદ્ધતિ દ્વારા 10 μg પ્રોટીન કાઢવા માટે 2D શુદ્ધિકરણ કીટ (GE હેલ્થકેર, USA) નો ઉપયોગ કરો, અને વરસાદને 20 μl 60% (v / v) ફોર્મિક એસિડ (FA), 20% (v / v) એસેટોનાઇટ્રાઇલ અને 20% (v / v) પાણીમાં ઓગાળો. RPLC (ડાયોનેક્સ RSLC) દ્વારા માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (મેક્સિસ UHR-TOF, બ્રુકર) સાથે મળીને પાંચ માઇક્રોલિટરનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું. 90%(v/v) એસીટોનિટ્રાઇલ TFA માં 85%(v/v) દ્રાવક A [0.1%(v/v) FA અને 0.02%(V/v) જલીય દ્રાવણ] થી 85%(v/v) દ્રાવક B [0.1%(v/v) FA અને 0.02%(v/v) ના ગ્રેડિયન્ટ સાથે 60°C અને 100μlmin -1 પર અલગ કરવા માટે MabPac 1.2×100 mm કોલમ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, યુકે) નો ઉપયોગ કરો. પ્રમાણભૂત ઇલેક્ટ્રોસ્પ્રે આયનીકરણ સ્ત્રોત અને ડિફોલ્ટ પરિમાણોનો ઉપયોગ 60 મિનિટથી વધુ સમય માટે કરો. માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર 100 થી 2750 m/z (માસ-ટુ-ચાર્જ રેશિયો) મેળવે છે. ExPASy બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ રિસોર્સ પોર્ટલ FindPept ટૂલ (https://web.expasy.org/findpept/) ની મદદથી, કોમ્પ્લેક્સના સબયુનિટ્સ સાથે માસ સ્પેક્ટ્રમનો નકશો બનાવો.
કોષોને 100 મિલી NF-લો (10μMm-2 s-1), મધ્યમ (30μMm-2 s-1) અથવા ઉચ્ચ (300μMm-2 s-1) પ્રકાશમાં 72 કલાક સુધી ઉગાડવામાં આવ્યા હતા. 100 મિલી સ્ક્રુ-ટોપ બોટલ (23) માં M22 મધ્યમ (M22 માધ્યમ જેમાં એમોનિયમ સલ્ફેટ છોડી દેવામાં આવે છે અને સોડિયમ સક્સિનેટને સોડિયમ એસિટેટ દ્વારા બદલવામાં આવે છે). પાંચ 30-સેકન્ડ ચક્રમાં, કોષોને લીઝ કરવા માટે 1:1 ના વોલ્યુમ રેશિયો પર 0.1 માઇક્રોન ગ્લાસ મણકાને મણકા આપવામાં આવ્યા હતા અને 5 મિનિટ માટે બરફ પર ઠંડા કરવામાં આવ્યા હતા. બેન્ચટોપ માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજમાં 16,000 RCF પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા અદ્રાવ્ય પદાર્થ, અતૂટ કોષો અને ગ્લાસ મણકાને દૂર કરવામાં આવ્યા હતા. આ પટલને Ti 70.1 રોટરમાં 100,000 RCF સાથે 20 mM tris-HCl (pH 8.0) માં 40/15% (w/w) સુક્રોઝ ગ્રેડિયન્ટ સાથે 10 કલાક માટે અલગ કરવામાં આવ્યું હતું.
અમારા અગાઉના કાર્યમાં વર્ણવ્યા મુજબ, PufW (16) પર His ટેગનું ઇમ્યુનોડિટેક્શન. ટૂંકમાં, 2x SDS લોડિંગ બફર (મર્ક, યુકે) માં શુદ્ધ કોર કોમ્પ્લેક્સ (11.8 nM) અથવા RC ની સમાન સાંદ્રતા ધરાવતી પટલ (ઓક્સિડેશન દ્વારા નક્કી કરવામાં આવે છે જે ઘટાડેલા તફાવત સ્પેક્ટ્રમને બાદ કરીને અને સ્ટેઇન્ડ જેલ પરના ભારને મેચ કરીને) બે વાર પાતળી કરવામાં આવે છે. પ્રોટીનને પ્રતિકૃતિ 12% બિસ-ટ્રિસ ન્યુપેજ જેલ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, યુકે) પર અલગ કરવામાં આવ્યા હતા. RC-L સબ્યુનિટ લોડ કરવા અને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવા માટે કૂમાસી બ્રિલિયન્ટ બ્લુ (બાયો-રેડ, યુકે) સાથે જેલને સ્ટેન કરવામાં આવી હતી. બીજા જેલ પરના પ્રોટીનને ઇમ્યુનોસે માટે મિથેનોલ-સક્રિય પોલીવિનાઇલિડેન ફ્લોરાઇડ (PVDF) પટલ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, યુકે) માં ટ્રાન્સફર કરવામાં આવ્યું હતું. PVDF મેમ્બ્રેનને 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) ટ્વીન-20 અને 5% (w / v) સ્કિમ્ડ મિલ્ક પાવડરમાં બ્લોક કરવામાં આવ્યું હતું, અને પછી એન્ટિ-હિસ પ્રાથમિક એન્ટિબોડી (ડાયલ્યુટ ધ એન્ટિબોડી બફર [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl અને 0.05% (v / v) ટ્વીન-20] માં 1:1000 A190-114A, બેથાઇલ લેબોરેટરીઝ, યુએસએ) માં 4 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટેડ કરવામાં આવ્યું હતું. એન્ટિબોડી બફરમાં 5 મિનિટ સુધી 3 વખત ધોવા પછી, પટલને હોર્સરાડિશ પેરોક્સિડેઝ (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ, યુકે) એન્ટિ-માઉસ સેકન્ડરી એન્ટિબોડી (એન્ટિબોડી બફરમાં 1:10,000 પાતળું) સાથે જોડવામાં આવ્યું હતું. WESTAR ETA C 2.0 કેમિલ્યુમિનેસેન્સ સબસ્ટ્રેટ (સાયનાજેન, ઇટાલી) અને એમરશામ ઇમેજર 600 (GE હેલ્થકેર, યુકે) નો ઉપયોગ કરીને શોધ (એન્ટિબોડી બફરમાં 3 ધોવા પછી 5 મિનિટ) માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યું હતું.
ImageJ (57) માં, દરેક સ્ટેઇન્ડ જેલ અથવા ઇમ્યુનોસે લેનનું તીવ્રતા વિતરણ દોરીને, ટોચ હેઠળના ક્ષેત્રને એકીકૃત કરીને અને RC-L (સ્ટેઇન્ડ જેલ) અને પ્રોટીન-W (ઇમ્યુનોસે) ના તીવ્રતા ગુણોત્તરની ગણતરી કરીને, છબીની પ્રક્રિયા કરો. શુદ્ધ RC-LH114-W નમૂનામાં RC-L અને પ્રોટીન-W નો ગુણોત્તર 1:1 હોવાનું ધારીને અને તે મુજબ સમગ્ર ડેટા સેટને સામાન્ય બનાવીને આ ગુણોત્તરને મોલર રેશિયોમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા.
આ લેખ માટે પૂરક સામગ્રી માટે, કૃપા કરીને http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 જુઓ.
આ એક ઓપન એક્સેસ લેખ છે જે ક્રિએટિવ કોમન્સ એટ્રિબ્યુશન લાઇસન્સની શરતો હેઠળ વિતરિત કરવામાં આવે છે. આ લેખ કોઈપણ માધ્યમમાં અમર્યાદિત ઉપયોગ, વિતરણ અને પુનઃઉત્પાદનની મંજૂરી આપે છે જો મૂળ કાર્ય યોગ્ય રીતે ટાંકવામાં આવ્યું હોય.
નોંધ: અમે તમને ફક્ત તમારું ઇમેઇલ સરનામું આપવાનું કહીએ છીએ જેથી તમે જે વ્યક્તિને પેજ પર ભલામણ કરો છો તે જાણે કે તમે ઇચ્છો છો કે તે ઇમેઇલ જુએ અને તે સ્પામ ન હોય. અમે કોઈપણ ઇમેઇલ સરનામાં કેપ્ચર કરીશું નહીં.
આ પ્રશ્નનો ઉપયોગ તમે મુલાકાતી છો કે નહીં તે ચકાસવા અને આપમેળે સ્પામ સબમિશન અટકાવવા માટે થાય છે.
ડેવિડ જે.કે. સ્વેન્સબરી, પાર્ક કિયાન, ફિલિપ જે. જેક્સન, કેટલીન એમ. ફેરીઝ, ડેરિયસ એમ. નીડ્ઝવિડ્ઝકી, એલિઝાબેથ સી. માર્ટિન, ડેવિડ એ. ફાર્મર, લોર્ના એ. મેલોન, રેબેકા એફ. થોમ્પસન, નીલ એ. રેન્સન, ડેનિયલ પી. કેનિફ, માર્ક જે. ડિકમેન, ડ્યુઇ હોલ્ટેન, ક્રિસ્ટીન કિરમાયર, એન્ડ્રુ હિચકોક, સી. નીલ હન્ટર
પ્રતિક્રિયા કેન્દ્રમાં પ્રકાશ જાળ 1 સંકુલનું ઉચ્ચ-રિઝોલ્યુશન માળખું ક્વિનોન ગતિશીલતામાં નવી આંતરદૃષ્ટિ પ્રદાન કરે છે.
ડેવિડ જે.કે. સ્વેન્સબરી, પાર્ક કિયાન, ફિલિપ જે. જેક્સન, કેટલીન એમ. ફેરીઝ, ડેરિયસ એમ. નીડ્ઝવિડ્ઝકી, એલિઝાબેથ સી. માર્ટિન, ડેવિડ એ. ફાર્મર, લોર્ના એ. મેલોન, રેબેકા એફ. થોમ્પસન, નીલ એ. રેન્સન, ડેનિયલ પી. કેનિફ, માર્ક જે. ડિકમેન, ડ્યુઇ હોલ્ટેન, ક્રિસ્ટીન કિરમાયર, એન્ડ્રુ હિચકોક, સી. નીલ હન્ટર
પ્રતિક્રિયા કેન્દ્રમાં પ્રકાશ જાળ 1 સંકુલનું ઉચ્ચ-રિઝોલ્યુશન માળખું ક્વિનોન ગતિશીલતામાં નવી આંતરદૃષ્ટિ પ્રદાન કરે છે.
©2021 અમેરિકન એસોસિયેશન ફોર ધ એડવાન્સમેન્ટ ઓફ સાયન્સ. તમામ અધિકારો સુરક્ષિત છે. AAAS એ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef અને COUNTER ના ભાગીદાર છે. સાયન્સ એડવાન્સ ISSN 2375-2548.